八角葉不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

黃澤敬,陳全斌,陳　璐

(1 廣西貴港市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所平南檢驗站，廣西　平南　537300;2 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西　桂林　541004)

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八角葉不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

黃澤敬1,陳全斌2,陳璐2

(1 廣西貴港市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所平南檢驗站，廣西平南537300;2 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，廣西桂林541004)

分別以甲醇、乙酸乙酯、水為溶劑，對八角葉回流提取，再通過D101大孔吸附樹脂得到過柱粗提取物并精制得其精制提取物，再將以上五種提取物配成五種溶液。分別采用分光光度法測其五種提取物的抗氧化活性，并與人工合成抗氧化物質(zhì)BHT進(jìn)行比較。結(jié)果表明：八角葉不同溶劑提取物均具有抗氧化活性，且其作用強(qiáng)度與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，其精制提取物的抗氧化能力最強(qiáng),但在一定范圍內(nèi)均弱于相同濃度下的抗BHT的抗氧化性。

八角葉；提取物；抗氧化活性

八角(學(xué)名：Illicium verum)為雙子葉植物綱木蘭亞綱八角科八角屬的一種，是主產(chǎn)于廣西的食藥兩用植物，具有健胃、止咳、消痛、消炎的功效，醫(yī)藥上用于治療神經(jīng)衰弱，消化不良、腎虛腰痛、胃寒嘔吐等癥。近年來國內(nèi)外學(xué)者對其化學(xué)成分、藥理作用等方面做了諸多研究，部分研究表明[1]，以八角為代表的多數(shù)天然產(chǎn)物均具有抗氧化作用，研究還發(fā)現(xiàn)[2]一些人工合成的氧化劑，如BHT等，能夠抑制人體的呼吸酶活性，使用過量甚至可以致畸致癌，因而合成氧化劑的使用越來越受到限制，從天然產(chǎn)物中尋找高安全性的抗氧化劑已成為近年來研究的熱點。本文對八角葉的五種不同溶劑提取物的抗氧化性進(jìn)行測定，探討它作為天然抗氧化劑替代BHT的可能性，為進(jìn)一步開發(fā)利用八角葉提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1儀器和試劑

儀器：RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB-HIS型循環(huán)水式真空泵，DLSB-5/20型低溫冷卻循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有些公司；WS210S型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；SKSY-4型電子恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；202ASI型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱，上海浦東菜豐科學(xué)儀器有限公司；800B型低速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；微量連續(xù)可調(diào)移液器，上海江岳電子科技有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；722S型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

實驗試劑：乙酸乙酯；甲醇；蒸餾水；二苯代苦味酰自由基(DPPH)，Sigma公司；BHT；鄰二氮菲；鄰苯三酚；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；硫酸亞鐵氨；H2O2；鐵氰化鉀；三氯乙酸；三氯化鐵；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；濃鹽酸；乙醇等。所有溶劑試劑均為分析純。

實驗樣品：八角葉(2014年，秋，采自廣西來賓金秀縣)。

1.2實驗方法

1.2.1八角葉不同溶劑提取物的制備

稱取經(jīng)風(fēng)干粉碎的八角葉300 g，放入1 L圓底燒瓶，再加入400 mL水，恒溫水浴加熱回流2 h，過濾，所得濾液旋干，減壓濃縮回收所得的水再次加入1 L圓底燒瓶，重復(fù)上述操作，共三次，最后得到水提取物(7.9877 g)。將得到的濾渣即八角葉晾干。分別采用甲醇、乙酸乙酯為提取溶劑，同水提取法進(jìn)行相同萃取操作，得乙酸乙酯提取物(9.5234 g)、甲醇提取物(10.6682 g)。

稱取經(jīng)風(fēng)干粉碎的八角葉300 g，碾碎后置入圓底燒瓶，加水(固液比1:10)煮沸60 min，冷卻過濾，第二、三次煮沸30 min，合并濾液。將濾液以10 mL/min的速度過大孔吸附樹脂柱(4.0 cm×60 cm)。吸附完畢后，首先用蒸餾水洗柱，至流出液無色，然后用75%的乙醇洗脫。洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，得到黃色粗提物即過柱粗提取物(4.3526 g)，取其中約2.3526 g粗提物再經(jīng)無水乙醇溶解、過濾(重復(fù)3次)棄殘渣，將濾液干燥得淺黃色精制提取物(1.6844 g)。

以乙醇為溶劑，依次配置不同濃度的八角葉不同溶劑提取物溶液(樣液)，貯藏、備用。

1.2.2八角葉不同溶劑提取物抗氧化活性測定

對DPPH自由基清除作用的測定參考文獻(xiàn)[3]。

對羥基自由基(·OH)清除活性的測定參考文獻(xiàn)[4-5]。

2　結(jié)果與分析

2.1清除DPPH自由基

DPPH·是一種性質(zhì)較為穩(wěn)定的自由基，其醇溶液顯紫色，在517 nm處有最大吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH·的單電子由于被配對，濃度減小而使其顏色變淺，吸光度變小，這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學(xué)計量關(guān)系，因此可用比色法進(jìn)行定量分析[3-4]。即自由基清除劑的清除自由基能力越強(qiáng)，吸光度越小。

圖1　八角葉提取物及抗壞血酸清除DPPH自由基的效果比較

圖1是不同質(zhì)量濃度的八角葉提取物及抗壞血酸清除DPPH自由基的效果比較，可以看出八角葉各提取物及BHT對DPPH自由基都有一定的清除活性，并且，隨著八角葉各提取物濃度的增大，其對DPPH自由基的清除率也相應(yīng)增大，BHT溶液則先增大后趨于水平。當(dāng)各提取物質(zhì)量濃度小于1.4 mg/mL時，對DPPH自由基的清除活性順序依次為：BHT>精制提取物>過柱粗提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物；在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，八角葉精制提取物對DPPH自由基的清除率達(dá)到89.78%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于BHT的清除率，可以看到，超過一定濃度時，八角葉精制提取物、過柱粗提取物、甲醇提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物相對于人工合成抗氧化物質(zhì)BHT具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性。

2.2清除羥基自由基(·OH)

羥基自由基是最活潑、毒性最大的自由基,它可通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用, 造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷,使細(xì)胞壞死或突變,·OH還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬等有關(guān),羥自由基清除率是反映測試樣抗氧化作用的重要指標(biāo)[5]。H2O2/Fe2+體系可通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，鄰二氮菲-Fe2+水溶液被·OH氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，使鄰二氮菲2Fe2+在536 nm處的最大吸收峰變?nèi)趸蛳В?dāng)體系加入·OH清除劑后，氧化過程受到抑制，體系在536 nm的吸光度降低程度相應(yīng)減小,因此可根據(jù)536 nm處吸光度的變化程度判斷被測物清除·OH的能力[6]。

圖2　八角葉各提取物及抗壞血酸清除羥基自由基的效果比較

圖2是不同質(zhì)量濃度的各八角葉樣液及BHT溶液清除羥基自由基效果比較，可以看出在濃度為1 mg/mL范圍內(nèi)，BHT及八角葉各提取物對(·OH)的清除效果隨樣品質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，但八角葉各提取物對羥基自由基(·OH)的清除作用均弱于BHT，其清除作用的大小關(guān)系為：BHT>精制提取物>過柱粗提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物，八角葉各提取物中精制提取物清除羥基自由基(·OH)效果最強(qiáng)。

圖3是不同質(zhì)量濃度的各八角葉樣液及BHT溶液清除超氧陰離子自由基效果比較，可以看出，八角葉各提取物及BHT對超氧陰離子自由基清除率隨著濃度的增大而增大，但當(dāng)濃度增大到一定值后，清除率隨濃度增大不再明顯提高。在所選的樣品濃度范圍內(nèi)，八角葉各提取物與BHT對超氧陰離子自由基的清除能力大小關(guān)系為：BHT>精制提取物>過柱粗提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物，在質(zhì)量濃度0.6 mg/mL時，八角精制提取物對超氧陰離子自由基清除率達(dá)到95.24%，因此，在八角葉各提取物中精制提取物對超氧陰離子自由基的清除作用最強(qiáng)。

圖3　八角葉各提取物及抗壞血酸清除超氧陰離子自由基的效果比較

2.4還原能力的測定

還原能力是抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，可以通過提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的物質(zhì)，以中斷自由基的連鎖反應(yīng)。在還原能力測定試驗中，采用普魯士藍(lán)法，其原理是樣品中具有還原能力的成分可以將鐵氰化鉀還原成為亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再與三價鐵離子作用形成普魯士藍(lán)[Fe(Fe(CN)6)3],普魯士藍(lán)在700 nm下有最大吸收峰，吸光度越高，表示樣品的還原能力越強(qiáng)。一般情況下,樣品的還原能力與其抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性[8]。

圖4　八角葉各提取物及抗壞血酸還原能力的效果比較

圖4 是八角葉各提取物及抗壞血酸還原能力的效果比較，可以看出，在所測濃度范圍內(nèi)，八角葉各提取物與BHT隨著濃度的增加還原能力都逐漸增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。八角葉各提取物與BHT還原能力大小關(guān)系為：BHT>精制提取物>過柱粗提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物，八角葉各提取物中，精制提取物的還原能力最強(qiáng)，相對而言，八角葉各提取物的還原能力還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于BHT的還原能力。

3　結(jié)　論

八角葉各提取物均具有一定的抗氧化性(其中精制提取物的抗氧化性最強(qiáng))，隨著各提取物質(zhì)量濃度的增大，其抗氧化性逐漸增強(qiáng)；在不同的抗氧化體系中，其抗氧化活性強(qiáng)弱不盡相同。

(1) 在羥基自由基體系和超氧陰離子自由基體系中，抗氧化活性強(qiáng)弱順序依次為：BHT>精制提取物>過柱粗提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。而其還原能力強(qiáng)弱順序依次為：BHT>精制提取物>過柱粗提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。

(2) 在DPPH自由基體系中，當(dāng)質(zhì)量濃度小于1.4 mg/mL時，抗氧化活性強(qiáng)弱順序依次為：BHT>精制提取物>過柱粗提取物>甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物；當(dāng)質(zhì)量濃度大于2.0 mg/mL時，八角葉各提取物對DPPH自由基的清除能力均強(qiáng)于抗壞血酸。

(3) 八角葉何種成分具有抗氧化作用等尚有待進(jìn)一步研究。

[1]羅丹紅,陳美燊,羅仁勇,等.廣西科技工作者對八角研究狀況[J].大眾科技,2012,14(9):111-113.

[2]喬風(fēng)云,陳欣,余柳青.抗氧化因子與天然抗氧化劑研究綜述[J].科技通報，2006,22(3)：332-336.

[3]王乃馨,王衛(wèi)東,鄭義. 野馬追類黃酮清除DPPH自由基活性研究[J].中國食品添加劑: 試驗研究,2010(6):84-87.

[4]楊明惠,何麗仙,李珍貴.分光光度法測定Fenton體系中產(chǎn)生的羥自由基[J].大理學(xué)院學(xué)報,2007,6(4):38-39.

[5]方光榮,劉潔,劉麗虹,等.分光光度法測定中藥對羥自由基的清除率[J].湖北大學(xué)學(xué)報, 2004,26(2):151-154.

[6]李永利,張焱.鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性[J].中國衛(wèi)生植驗雜志,2000,10(6):673-674.

[7]李利華.魚腥草中總黃酮的含量測定及抗氧化性研究[J].西北藥學(xué)雜志,2009,24(3):177-179.

[8]曾軍,石國榮.天然產(chǎn)物抗氧化活性的測定方法和原理[J].安徽農(nóng)學(xué)通報, 2008,14(22):35-36.

Study on the Antioxidant Activity of Different Solvent Extracts of Illicium Verum Leaves

HUANGZe-jing1,CHENQuan-bin2,CHENLu2

(1 Quality Inspection of Guangxi Guigang Pingnan Products Inspection Station, Guangxi Pingnan 537300;2 Department of Resources and Environment, Guangxi Normal University, Guangxi Guilin 541004, China)

The leaves of Illicium verum were extracted respectively by methanol, ethyl acetate and water. Using the D101 macroporous adsorption resin to get the column of crude extracts, and then the refined extracts were refined. The above five kinds of extracts were made up into five kinds of solution. The antioxidant activity of five extracts were determined with spectrophotometric method and compared to BHT. The result indicated that all extracts exhibited antioxidant activity. Its intensity and concentration were positively correlated. Antioxidant capacity of the refined extract was strongest. But in a certain range, the antioxidant activity of extracts was weaker than the same concentration of BHT.

Illicium verum; leaf; extracts; antioxidant activity

黃澤敬(1985-)，男，助理工程師，從事食品檢測、植物研究和應(yīng)用及環(huán)境污染控制研究。

陳全斌(1957-)，男，研究員，從事植物有效成分提取及其活性研究。

S567

A

1001-9677(2016)02-0079-03