正交設(shè)計法優(yōu)選石榴皮中總多酚的超聲提取工藝*

陳　素，周文財，高雅媛，何　洋

(廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東　中山　528458)

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正交設(shè)計法優(yōu)選石榴皮中總多酚的超聲提取工藝*

陳素，周文財，高雅媛，何洋

(廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458)

利用正交設(shè)計法優(yōu)選石榴皮中總多酚的提取工藝。以沒食子酸為對照，福林試劑為顯色劑，用紫外-可見分光光度法在760 nm處測定總多酚的含量。采用L9(34)正交試驗設(shè)計，以石榴皮中總多酚含量為考察指標(biāo)，考察乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間4個因素對提取的影響。結(jié)果表明：最佳提取工藝為乙醇濃度為40%，提取溫度55 ℃，料液比1:30，提取時間為30 min。該工藝經(jīng)試驗重復(fù)性好，操作簡單，為石榴皮中總多酚的開發(fā)提供了參考依據(jù)。

石榴皮；總多酚；正交試驗；紫外-可見分光光度法

石榴皮(Granatipericarpium)為石榴科植物石榴(PunicagratanumL.)的干燥果皮，收載于《中國藥典》(2010年版)。秋季果皮成熟后收集果皮，曬干。性溫，味酸、澀，歸大腸經(jīng)。有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲的功效，用于久瀉、久痢、便血等[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明石榴皮多酚具有抗氧化、消除自由基[2]，抗腫瘤[3]，抗病毒、抗菌及抗炎[4]，降血糖[5]等作用。本文研究石榴皮中總黃多酚成分的提取工藝，為科學(xué)開發(fā)和利用石榴皮提供可靠依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器

UV1102紫外可見分光光度計,上海天美科學(xué)儀器有限公司;KQ-500型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;CP225D型電子天平,德國Sartorius公司。

1.2藥材與材料

沒食子酸對照品(批號110831-201204)，購自中國食品藥品檢定研究院;石榴皮藥材(20110701),河北楚岡中藥飲片有限公司;試劑均為分析純，超純水實驗室自制。

2　方法與結(jié)果

2.1石榴皮總多酚含量測定方法

2.1.1對照品溶液的的制備

取沒食子酸對照品7 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶，加水適量，振搖使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液I，沒食子酸濃度為0.1446 mg·mL-1。同法配制對照品儲備液Ⅱ，沒食子酸濃度為45.11 mg·mL-1。

2.1.2供試品溶液的制備

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精密稱定，加40%乙醇溶液20 mL，50℃，超聲提取30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加40%乙醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加40%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，至20 mL量瓶中，加40%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察

精密量取對照品儲備液I0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加入蒸餾水10 mL，加入福林試劑0.5 mL，搖勻，在8 min內(nèi)，再加入20%碳酸鈉1.5 mL，搖勻，加入40%乙醇定容至刻度，搖勻，避光放置1.5 h，作為對照品系列溶液，以不含沒食子酸的空白溶液為參比，于760 nm波長處測定吸光度，以對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)對照品吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=1.133×10-1X+6.400×10-3(r=0.9996)。試驗表明，沒食子酸在1.157～8.098 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.2精密度試驗

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，測定其吸光度，重復(fù)6次測定其吸光度，RSD為0.13%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h時，測定其吸光度，計算吸光度的RSD為0.62%。結(jié)果表明，樣品室溫放置2.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4重復(fù)性試驗

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液6份，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，測定其吸光度，計算總多酚含量的平均值為185.0 mg·g-1，RSD為0.97%。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收率試驗

取已知含量的供試品粉末(總多酚的含量為183.9 mg·g-1)9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入對照品儲備液Ⅱ0.5、1.0和1.5 mL，按“2.1.2”項下方法操作，制備供試品溶液，每個濃度3份，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，測定其吸光度，計算總多酚的平均回收率為99.8%，RSD為1.2%，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.3單因素考察方法

2.3.1乙醇濃度對提取的影響

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精確稱定，5份，分別加入10%、20%、30%、40%和50%乙醇溶液，按“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，測定其吸光度，計算總多酚的含量。

結(jié)果表明，石榴皮總多酚提取含量隨溶劑濃度增加而變化，其中30%乙醇溶液提取出的總多酚含量最佳。

2.3.2提取溫度對提取的影響

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精確稱定，5份，按“2.1.2”項下方法操作，提取溫度分別設(shè)在50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃和70 ℃，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，測定其吸光度，計算總多酚的含量。

結(jié)果表明，隨著提取溫度的升高，石榴皮總多酚的提取率先增加而后下降，55 ℃為石榴皮總多酚最佳提取溫度。

2.3.3料液比對提取的影響

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精確稱定，5份，分別加入40%乙醇溶液15 mL、20 mL、25 mL、30 mL和35 mL，其余操作按“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，測定其吸光度，計算總多酚的含量。

結(jié)果表明，料液比對石榴皮總多酚的提取效率的影響隨著提取溶劑體積的增加而下降，在1:30為石榴皮總多酚最佳提取料液比。

2.3.4提取時間對提取的影響

取石榴皮粉末(過三號篩)0.5 g，精確稱定，5份，加入40%乙醇溶液20 mL，分別超聲提取20、30、40、50和60 min，其余操作按“2.1.2”項下方法，制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1 mL，按“2.2.1”項下方法操作，測定其吸光度，計算總多酚的含量。

結(jié)果表明，隨著時間的延長，石榴皮總多酚的提取率逐漸增加，到40 min后無明顯增加，故確定提取40 min為石榴皮總多酚的最佳提取時間。

2.4石榴皮總多酚提取的正交試驗

根據(jù)石榴皮總多酚的性質(zhì)，考察了乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間4個因素，并結(jié)合以上單因素試驗結(jié)果，設(shè)置4因素3水平正交試驗(見表2)，根據(jù)因素水平表，以石榴皮總多酚含量為評價指標(biāo)，按L9(34)正交表進行試驗。正交試驗數(shù)據(jù)處理采用正交試驗直觀分析法，統(tǒng)計不同水平下提取出石榴皮總多酚含量的平均含量，以極差R進行分析(見表3)。

表2　正交優(yōu)選因素水平

表3　正交試驗結(jié)果分析

極差R的結(jié)果表明，乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間4因素對石榴皮總多酚提取含量的影響的顯著性為：料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時間。石榴皮總多酚超聲提取的最優(yōu)水平搭配為A3B2C1D1，即乙醇濃度為40%，提取溫度55 ℃，料液比1:30，提取時間為30 min為最佳提取工藝。

3　討　論

最大吸收波長選擇：取對照品溶液經(jīng)顯色處理后，以不含沒食子酸的空白溶液為參比，將待測液盛于比色皿中，置于比色池中，在200～800 nm波長段掃描測定最大吸收度，結(jié)果顯示，對照品及供試品均在760 nm處有最大吸收，故選擇760 nm為測定波長。

4　結(jié)　論

正交優(yōu)選石榴皮總多酚超聲提取最佳提取工藝為乙醇濃度為40%，提取溫度55 ℃，料液比1:30，提取時間為30 min。該方法優(yōu)選出的工藝簡單，重復(fù)性好，穩(wěn)定性佳，操作容易。在實際生產(chǎn)中，也要考慮實際操作，溶劑消耗，濃縮回收溶劑的耗能等因素，調(diào)整工藝。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會．中國藥典[S]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:87．

[2]李建科,李國秀,趙艷紅,等．石榴皮多酚組成分析及其抗氧化活性[J]．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,42(11):4035．

[3]Settheetham W，Ishida T．Study of genotoxic effects of antidiarrheal medicinal herbs on human cells in vitro[J]．Southeast Asian J Trop Med Public Health，1995，26(Suppl1):306．

[4]Nonaka G，Nishioka I，Nishizawa M，et al．Anti-AIDS agents，2：Inhibitory effects of tannins on HIV reverse transcriptase and HIV replication in H9 lymphocyte cells[J]．J Nat Prod，1990，53(3):587．

[5]姚海,王燁,徐永華,等．石榴皮乙酸乙酯提取物對胰島細(xì)胞生長活力的影響[J]．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010,33(10):1168．

Study on Extraction Technology of Total Polyphenols inPunicagratanumL. by Orthogonal Design*

CHENSu，ZHOUWen-cai，GAOYa-yuan，HEYang

(School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Guangdong Zhongshan 528458，China)

The extraction technology of total polyphenols inpunicagratanumL. was optimized. The ultraviolet spectrophotometry method was used to measure the total polyphenols content in ethanol extract ofPunicagratanumL. with different polar solvent extraction, with Folin’s reagent as color reagent and the gallic acid as standard substance and the maximum absorption wave-length of 760 nm. By L9(34) orthogonal experimental design, withPunicagratanumL., as index of total polyphenols, ethanol concentration, extraction temperature, extraction time and ethanol dosage on the extraction were investigated. Results showed that the optimum extraction process was 40% ethanol, 55 ℃, 30 times the amount of reflux extraction and 30 min. The experimental reproducibility of the process showed the further development of process a better reference value.

PunicagratanumL.; total polyphenols; orthogonal experiment; UV-Vis spectrophotometry

廣東藥學(xué)院2014年省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(項目編號: 201410573031)。

陳素(1993-)，女，在讀本科，應(yīng)用化學(xué)(化妝品科學(xué)與技術(shù)方向)。

何洋(1980-)，女，高級實驗師，從事藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與藥動學(xué)研究。

O657

A

1001-9677(2016)02-0060-03