青錢柳種質(zhì)資源親緣關(guān)系的ISSR分析評價

陳秀娟，柏明娥*，王麗玲，張都海，徐高福，王燕飛

(1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，杭州310023；2.淳安縣新安江開發(fā)總公司，浙江淳安311700；3.龍泉市林場，浙江麗水323700)

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青錢柳種質(zhì)資源親緣關(guān)系的ISSR分析評價

陳秀娟1，柏明娥1*，王麗玲1，張都海1，徐高福2，王燕飛3

(1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，杭州310023；2.淳安縣新安江開發(fā)總公司，浙江淳安311700；3.龍泉市林場，浙江麗水323700)

利用ISSR分子標記，對從浙江、江西、湖南等地收集的38份青錢柳種質(zhì)資源的親緣關(guān)系進行分析評價。結(jié)果表明：(1)從100對ISSR引物中篩選出16對，能擴增出108條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為67.5%，表明青錢柳種質(zhì)資源的種內(nèi)變異較為豐富；(2)38份材料間的遺傳相似系數(shù)在0.118～0.667，浙江淳安姥山林場2號與江西修水1號遺傳相似系數(shù)最大為0.667，親緣關(guān)系最近；浙江安吉天荒坪4號和浙江遂昌白馬山3號遺傳相似系數(shù)最小為0.118，親緣關(guān)系最遠；(3)聚類分析表明在遺傳相似系數(shù)為0.330時可將38份青錢柳種質(zhì)分為2組，第1組包括37個樣品，第2組僅包括浙江遂昌白馬山1號1個樣品；在遺傳相似系數(shù)為0.368時可將第1組再細分為2個小組，第1小組包括23個樣品，以浙江種質(zhì)居多，第2小組包括14個樣品，以浙江遂昌和湖南種質(zhì)為主。本研究結(jié)果從分子水平上反映了青錢柳不同地理種源間的變異程度和親緣關(guān)系，可以為合理引種、保護和優(yōu)良種源篩選提供參考依據(jù)。

青錢柳；種質(zhì)資源；親緣關(guān)系；ISSR

青錢柳[(Cyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinsk.)]系胡桃科(Juglaruiaceae)青錢柳屬植物，是冰川世紀幸存下來的珍稀樹種，為我國特有。青錢柳為落葉喬木，樹干通直，果實為堅果，扁球形，中部圍有水平方向的革質(zhì)圓盤狀翅，形似銅錢，可作為速生用材及園林觀賞樹種[1]。青錢柳種子具有休眠特性，一般播種后需隔年萌發(fā)，自然萌發(fā)率低[2-3]。研究表明青錢柳中含有多種有機或無機類化學(xué)成分，如黃酮[4]、多糖[5]、三萜類化合物[6]、酚酸類化合物[7]及鉀、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、硒等無機元素[8]，具有降血糖[9]、降血壓[10]、降血脂[11]和提高機體免疫力等多種功能[12]。青錢柳分布范圍較廣，主要分布于我國亞熱帶地區(qū)的江西、浙江、安微、福建、湖北、四川、貴州、湖南、廣西、重慶、江蘇等省(市)，河南、陜西和云南省也有少量分布，多生于海拔420～1100m(東部)或420～2500m(西部)的山區(qū)、溪谷、林緣、林內(nèi)或石灰?guī)r山地，喜生于溫暖、濕潤、排水良好的酸性紅壤、黃紅壤之上[13-14]。青錢柳在我省的安吉、杭州、臨安、淳安、建德、寧波、天臺、開化、仙居、遂昌、龍泉、慶元、云和、麗水、瑞安等地均有零星或小片狀分布[15]。隨著青錢柳藥用價值的開發(fā)，大規(guī)模掠奪式和破壞性采集資源現(xiàn)象嚴重，導(dǎo)致對自然植被不同程度的破壞，許多地區(qū)的青錢柳自然居群逐漸縮減，再加上青錢柳種子敗育率高，自然更新能力弱，在一定程度上也限制了其發(fā)展。因此對青錢柳種質(zhì)資源的保存、保護非常重要。

青錢柳作為第三紀孑遺物種，起源古老，在長期進化過程中受地理環(huán)境等因素的自然選擇或人為選擇使種質(zhì)間產(chǎn)生了一定的遺傳變異，這種遺傳變異不僅表現(xiàn)在物種形態(tài)上，同樣也體現(xiàn)在分子水平上。如佘誠棋等[16]的研究表明，青錢柳種子性狀在群體間和群體內(nèi)均達到顯著差異，不同種源青錢柳復(fù)葉性狀、地徑和苗高均存在顯著差異[17]；周一碭等[18]的研究表明，青錢柳種質(zhì)資源厙的遺傳多樣性豐富。DNA分子標記技術(shù)作為品種鑒別、物種間親緣關(guān)系分析等的一種有效手段，已在多種植物的研究中得到應(yīng)用[19-21]。ISSR(inter-simple sequence repeats)是1994年由Zietkeiwitcz創(chuàng)建的一種簡單序列重復(fù)間擴增多態(tài)性分子標記方法[22]，具有操作簡單快捷、DNA用量少、技術(shù)要求和成本低等特點。本文利用ISSR分子標記技術(shù)對浙江、江西、湖南等地收集的38份青錢柳種質(zhì)資源材料進行親緣關(guān)系的分析評價，以期為青錢柳種質(zhì)資源的保存、保護及分子輔助選育提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試青錢柳種源分別采自浙江、江西、湖南、貴州等地(見表1)，其中19號、20號、21號分別為浙江淳安姥山林場、浙江安吉天荒坪和浙江遂昌白馬山母樹群采集種子后培育的1a生實生苗種源，其余均為自然分布種源。采樣時選取無病蟲害的幼嫩葉片，硅膠干燥封存后帶回實驗室于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　供試青錢柳種源與采集地點

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA的提取?；蚪M提取采用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(BioTeke，北京)，DNA提取后通過1.5% 瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000C 微量核酸蛋白測定儀檢測完整性、純度及濃度。D260 /D280 > 1. 8 的DNA 樣品用于后續(xù) PCR 擴增。

1.2.2ISSR引物篩選和PCR的擴增。從38份樣品中選擇5份樣品進行ISSR引物篩選，共獲得16條擴增條帶清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性引物(見表2)。

表2　供試ISSR引物序列

利用這16條引物對38份青錢柳的DNA樣品進行 ISSR-PCR擴增。ISSR擴增反應(yīng)采用20μL體系：10. 0μL 2×Power Taq PCR MasterMix，模板DNA 60 ng，ISSR 引物1μL (10μmol/L) ，ddH2O補足20μL。PCR擴增反應(yīng)在杭州博日公司的TC-XP 型擴增儀上進行。ISSR-PCR 擴增程序為 94℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min，4℃保存。PCR樣品的分析采用毛細管電泳。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

PCR 擴增產(chǎn)物用毛細管電泳分析后，根據(jù)實驗結(jié)果，分析記錄同一大小重復(fù)出現(xiàn)的條帶，在相同的遷移大小上，有帶用1表示，無帶用0表示。采用 NTSYS-pc 2.10e 軟件進行遺傳多樣性分析，使用軟件中的SimQual程序計算樣品間的Dice遺傳相似系數(shù)，用SAHN程序進行UPGMA(非加權(quán)成對算術(shù)平均法)聚類分析，通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2　結(jié)果與分析

2.1擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

利用篩選出的16條ISSR引物對青錢柳基因組DNA進行PCR擴增，毛細管電泳結(jié)果顯示均能擴增出清晰穩(wěn)定、重復(fù)性和多態(tài)性較高的條帶。這16條引物共擴增獲得160條ISSR條帶，條帶大小介于100～1000 bp，其中多態(tài)性條帶數(shù)108條，多態(tài)率為67.5%，表明38個青錢柳種質(zhì)間的基因組差異明顯，種內(nèi)變異較為豐富。

圖1　引物820對4號青錢柳樣品的擴增圖譜

2.2遺傳相似性分析

將16條引物擴增出的條帶作為原始矩陣，利用 NTSYS-pc 軟件計算38份種質(zhì)間的 Dice 遺傳相似系數(shù)，遺傳相似系數(shù)介于0.118～0.667，平均為0.409。其中浙江淳安姥山林場2號與江西修水1號之間的遺傳相似系數(shù)最大為0.667，表明兩者間的親緣關(guān)系最近；其次為浙江富陽2號與4號，遺傳相似系數(shù)為0.647。親緣關(guān)系最遠的為浙江安吉天荒坪4號和浙江遂昌白馬山3號，遺傳相似系數(shù)最小為0.118，其次為湖南綬寧與浙江安吉天荒坪4號，遺傳相似系數(shù)為0.151。38份試樣間的遺傳相似系數(shù)詳見表3。

表3　38份青錢柳種源間的遺傳相似系數(shù)

接表3　38份青錢柳種源間的遺傳相似系數(shù)

2.3聚類分析

圖2　青錢柳種質(zhì)資源UPGAM聚類圖

利用UPGMA法對38份青錢柳材料進行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖(圖2)。在遺傳相似系數(shù)為0.330時可將38份青錢柳樣品分為2組，第1組包括37個試樣，第2組僅包括15號浙江遂昌白馬山1號1個試樣，在遺傳相似系數(shù)為0.368時可將第1組37份試樣再細分為2個小組，第1小組包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、27、28、29、33、34、35、37、38號共23個試樣，本組以浙江種源居多，浙江清涼峰、富陽、安吉天荒坪、杭州午潮山、寧波四明山等地種源全部歸于此組，另江西修水1號和2號、浙江開化古田山2號、浙江淳安姥山林場1號和2號、浙江遂昌1年生苗及貴州榕江平陽的種源也歸于此組；第2小組包括16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、30、31、32、36號共14個試樣，主要以浙江遂昌和湖南等地種源為主，另包括浙江淳安姥山林場3號和4號、浙江淳安姥山林場1年生苗、浙江安吉天荒坪1年生苗、開化古田山1號、江西中源種源。從以上聚類結(jié)果可以看出，來自相同地區(qū)的青錢柳樣品大都聚于一起，如浙江清涼峰、富陽、安吉天荒坪等，呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律，但各地種源并未嚴格按地理界限聚在一起。

3　結(jié)論與討論

青錢柳作為一種很有發(fā)展前景的多用途珍貴樹種已引起人們極大的關(guān)注，相關(guān)研究及報導(dǎo)較多，但有關(guān)分子生物學(xué)方面的研究尚少。本研究利用ISSR分子標記技術(shù)從基因組水平揭示了青錢柳種質(zhì)資源的遺傳差異及親緣關(guān)系，進而分析其遺傳多樣性，有助于青錢柳種質(zhì)資源的保護。從ISSR-PCR擴增結(jié)果看，16對引物共擴增獲得160條ISSR條帶，多態(tài)性條帶百分率達67.5%，表明青錢柳在DNA水平上具有豐富的遺傳多樣性。遺傳相似性系數(shù)是用來比較群體或個體間相似程度的度量參數(shù)，平均相似系數(shù)越高，說明相似程度越大，遺傳背景一致性越強[23]。分析結(jié)果表明38份青錢柳種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)在0.118～0.667，平均為0.409，其遺傳相似性系數(shù)總體比較低，說明青錢柳種質(zhì)在長期的適應(yīng)和進化過程中形成了廣泛的遺傳變異，個體間遺傳差異較大。38份種質(zhì)中親緣關(guān)系最近的為江西修水1號與淳安姥山林場2號，遺傳相似系數(shù)最大為0.667，親緣關(guān)系最遠的為浙江安吉天荒坪4號和浙江遂昌白馬山3號，遺傳相似系數(shù)最小為0.118，青錢柳種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠近與地理距離間沒有形成一定的相關(guān)性。

進一步的聚類分析表明來自相同或相近地區(qū)的多數(shù)種質(zhì)可以聚于一起，如浙江清涼峰、富陽、安吉天荒坪、杭州午潮山、寧波四明山等地的種質(zhì)基本聚于一組，呈現(xiàn)一定的地域性分布規(guī)律，表明這些地區(qū)的種質(zhì)相似度較高，遺傳背景較為一致。但各地種質(zhì)并未嚴格按地理界限聚在一起，出現(xiàn)一定的交叉現(xiàn)象，如江西修水、貴州榕江平陽的種質(zhì)與上述種質(zhì)聚于一組，湖南綏寧、湖南張家界種質(zhì)基本與浙江遂昌種質(zhì)聚為一組，這可能與種質(zhì)資源的自然遷移或人工移栽等因素有關(guān)。值得關(guān)注的是，聚類圖顯示位于浙江遂昌境內(nèi)的白馬山1號種質(zhì)單獨聚為一組，提示該種質(zhì)在遺傳背景上可能與其它種質(zhì)存在較大程度的差異。因此，可考慮進一步開展該種質(zhì)的生物學(xué)性狀、化學(xué)成分等方面的研究，為青錢柳優(yōu)良種源選擇和推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

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2016-04-10

浙江省科技廳公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目(2013C32087)；遂昌縣科技計劃項目(2014-17-08)

陳秀娟(1973- )，女，助理工程師，主要從事林業(yè)資源管理；*通訊作者：柏明娥(1966- )，女，研究員，碩士，主要從事資源植物開發(fā)利用技術(shù)研究，E-mail:1683317628@qq.com。

S792.12

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.04.002