特發(fā)性膜性腎病相關(guān)自身抗體研究進(jìn)展

程桂雪　李永哲　秦曉松

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽110004)

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特發(fā)性膜性腎病相關(guān)自身抗體研究進(jìn)展

程桂雪李永哲秦曉松

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽110004)

膜性腎病是成人腎病綜合征最常見的病理表現(xiàn)之一，為我國原發(fā)性腎小球疾病的第二大病因。大約70%的膜性腎病患者表現(xiàn)為持續(xù)反復(fù)的蛋白尿，可致腎臟損傷，危及生命。約1/3膜性腎病患者可以自發(fā)緩解、逐漸好轉(zhuǎn)，還有約1/3的患者在5～10年后發(fā)展為終末期腎病，其余患者則表現(xiàn)為持續(xù)蛋白尿[1,2]。膜性腎病可分為特發(fā)性和繼發(fā)性兩類，其中特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)占70%～80%，主要指沒有明確病因引起的腎小球基底膜改變，其治療主要應(yīng)用激素、免疫抑制劑，如環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺、甲基潑尼松等[3,4]；繼發(fā)性膜性腎病(Secondary membranous nephropathy,SMN) 占20%～30%，一般繼發(fā)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)等自身免疫疾病，感染(乙型/丙型肝炎病毒感染)，惡性腫瘤和藥物中毒等。IMN的發(fā)病機(jī)理、病因尚不明確，目前缺乏診斷的特異性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)?，F(xiàn)就目前發(fā)現(xiàn)的IMN相關(guān)靶抗原及其作用機(jī)制綜述如下(表1)。

1　特發(fā)性膜性腎病的相關(guān)足細(xì)胞靶抗原及其作用機(jī)制

1.1小鼠Heymann腎炎的靶抗原1959 年Heymann等[5]用大白鼠腎勻漿和佐劑反復(fù)免疫健康同種大白鼠,制作出類似人類MN(Membranous Nephropathy,MN) 模型，稱為Heymann腎炎(Heymann nephropathy,HN)。免疫熒光顯示IgG、C3 沿GBM(Glomerular basement membrane，GBM)呈顆粒樣沉積。其后Edgingiton證實(shí)引起HN的抗原為腎小管刷狀緣Fx1A的主要成分之一，大量存在于近曲小管上皮細(xì)胞刷狀緣。Kerjaschki等[6]在小鼠的腎小球基底膜內(nèi)皮下足細(xì)胞膜沉淀物發(fā)現(xiàn)糖蛋白抗原-megalin，屬低密度脂蛋白受體家族，為鼠膜性腎病的靶抗原，形成的抗原抗體復(fù)合物與C5b-9形成膜攻擊復(fù)合物可使足細(xì)胞NADPH過氧化物酶復(fù)合體的表達(dá)上調(diào)，使活性氧在GBM產(chǎn)生，進(jìn)而氧化足細(xì)胞表面脂蛋白，隨后，二聚單體NC1域IV型膠原蛋白與氧化的脂蛋白共價(jià)結(jié)合，這些結(jié)構(gòu)的改變影響腎小球基底膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響腎小球?yàn)V過功能，產(chǎn)生蛋白尿[7]。由于人腎小球足細(xì)胞無megalin蛋白表達(dá)，故HN模型未能揭露人膜性腎病的發(fā)病機(jī)制，但該模型為探索人膜性腎病免疫機(jī)制及發(fā)現(xiàn)自身抗體奠定了基礎(chǔ)。

1.2新生兒同源性免疫膜性腎病的靶抗原-中性內(nèi)切酶2002年，Debiec等[8,9]在少見的新生兒同種免疫性膜性腎病中發(fā)現(xiàn)腎小球原位免疫復(fù)合物，并首次發(fā)現(xiàn)人膜性腎病的相關(guān)抗體-中性內(nèi)切酶抗體(Neutral endopeptidase,NEP)，這為人們進(jìn)一步探索膜性腎病的發(fā)病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。研究組通過腎臟病理活檢確診新生兒膜性腎病，分析其病因在于該患兒母親是先天NEP基因缺陷，其患者母親在早期的流產(chǎn)史中被該種蛋白免疫，此次懷孕中的胎兒表達(dá)NEP，此時(shí)母體中抗NEP循環(huán)抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒腎小球基底膜足細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而激活補(bǔ)體，使足細(xì)胞受累，隨之引起胎兒腎單位損傷、腎小球發(fā)生病理變化，導(dǎo)致新生兒膜性腎病。2004年，Debiec研究組[10]對5組家庭的核型分析，認(rèn)為母體金屬彈力酶 (Metallomembrane endopeptidase,MME)基因缺失引起中性內(nèi)切酶缺陷，在妊娠期間母體即可產(chǎn)生抗胎兒NEP的抗體。另外，有研究指出患兒母親產(chǎn)生的補(bǔ)體IgG亞型不同，則患兒膜性腎病的嚴(yán)重程度有差異，并明確指出母體產(chǎn)生的抗體中IgG1比例越高，患兒患病越嚴(yán)重。因此檢測孕婦血清中抗NEP抗體及核型分析可以早期發(fā)現(xiàn)新生兒膜性腎病，從而其預(yù)防該病的發(fā)生，降低新生兒同源免疫性膜性腎病的發(fā)病率[11]。

1.3成人膜性腎病主要靶抗原-M型磷脂酶A2受體為了深入研究特發(fā)性膜性腎病的發(fā)病機(jī)制，在2009年，Beck等[12]人對IMN患者腎小球提取物采用Western blot方法獲得一種與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，由質(zhì)譜分析等方法證實(shí)存在一種185-kD的腎小球蛋白，即M型磷脂酶A2受體(M-phospholipase A2 receptor,PLA2R)為引起特發(fā)性膜性腎病的靶抗原。該蛋白可在70%的特發(fā)性膜性腎病患者中表達(dá),并且在繼發(fā)性膜性腎病等其他對照組患者中未檢測到該種蛋白。PLA2R1主要表達(dá)于腎小球基底膜足細(xì)胞，屬于甘露糖受體家族[12]，其結(jié)構(gòu)包括N末端富含胱氨酸區(qū)域(Cysteine-rich,CysR)、Ⅱ型纖連蛋白區(qū)域(Fibronectin-like type Ⅱ,FnⅡ)、8個(gè)C型凝集素區(qū)域(C-type lectin-like domain 1,CTLD1)以及跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)的C末端(圖1)。該蛋白空間構(gòu)想的改變可使機(jī)體產(chǎn)生抗PLA2R抗體，進(jìn)而形成循環(huán)免疫復(fù)合物[13,14]，這些循環(huán)抗體可以在膜性腎病患者的血清和腎小球免疫沉淀物中被檢測到。

表1　特發(fā)性膜性腎病的靶抗原及作用機(jī)制Tab.1　Target antigens and their pathogenesis of idiopathic membranous nephropathy

圖1　PLA2R分子結(jié)構(gòu)Fig.1　Molecular structure of PLA2R

許多研究都說明了抗PLA2R自身抗體與特發(fā)性膜性腎病的關(guān)系，在不同國家、種族的IMN患者對PLA2R的特異性稍有差異；在不同的研究中，抗體檢出率不同。如：Beck等人在37個(gè)IMN患者中檢測出26個(gè)患者抗PLA2R自身抗體陽性(70%)[12],而歐洲IMN患者抗體陽性率為78%[15];隨后，伊朗、日本和中國的研究顯示該抗體陽性率分別為74%、53%、82%[16-18]。除地域和人種的差異，其原因還可能是由于檢測方法或小樣本測試的差異等因素所引起的，研究表明PLA2R與新生兒膜性腎病相關(guān)性不大，其主要是成人特發(fā)性膜性腎病靶抗原。

1.41型血小板反應(yīng)蛋白7A域盡管對自身抗體的研究發(fā)現(xiàn)，大約70%的IMN患者可以采用特異性高的抗PLA2R自身抗體檢測來診斷，但還有少數(shù)的患者體內(nèi)未檢測到該抗體。2014年，Tormas等[19]人在154例抗PLA2R1抗體陰性的IMN患者中，發(fā)現(xiàn)其中15例患者血清存在抗1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(Thrombospondin Type-1 Domain-Containing 7A,THSD7A)抗體，THSD7A表達(dá)于足細(xì)胞膜上，其抗體亞型與PLA2R抗體相同，均為IgG4亞型[19]。THSD7A與PLA2R有相似的結(jié)構(gòu)和許多相似的生化特征，如N-糖基化、膜位置以及只在還原狀態(tài)下才能檢測到,但二者的存在又具有互斥性，即在IMN患者血清抗PLA2R抗體陰性的血清中才可發(fā)現(xiàn)THSD7A抗體?？筎HSD7A自身抗體可在9.7%的PLA2R陰性的患者中檢測到，在IMN患者中的檢出率大約為3%[19]。

1.5足細(xì)胞靶抗原及其自身抗體的致病機(jī)制雖然目前尚未清楚IMN確切的發(fā)病機(jī)制，但眾多研究表明抗體水平與足細(xì)胞表面成分和疾病的活動(dòng)進(jìn)展密切相關(guān)。自2009年人們發(fā)現(xiàn)PLA2R，普遍認(rèn)為機(jī)體產(chǎn)生的自身抗體與足細(xì)胞靶抗原形成的原位免疫復(fù)合物，可激活補(bǔ)體，形成膜攻擊復(fù)合物，從而引起腎小球損傷和蛋白尿的形成[20]。2009年Beck[12,20]的研究證實(shí)了IMN患者中抗PLA2R自身抗體的類型主要是IgG4，隨后的研究支持了這一結(jié)論，并提出繼發(fā)性膜性腎病中主要是IgG1亞型，研究還指出IMN患者體內(nèi)有多種亞型的免疫球蛋白，IgG4為主要類型，其次也存在IgG1、IgG2、IgG3，但其含量有較大差異。還有觀點(diǎn)認(rèn)為病程的不同階段，抗體亞型有差異，即原發(fā)性性膜性腎病早期階段可能主要以IgG1為主，而發(fā)展的后期階段IgG4占優(yōu)勢[21-23]。

為進(jìn)一步研究患者體內(nèi)產(chǎn)生的自身抗體是通過怎樣的潛在的病理機(jī)制激活補(bǔ)體引起足細(xì)胞損傷，研究者進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及移植后膜性腎病等研究。由于傳統(tǒng)上認(rèn)為IgG4類抗體不能激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑，因此可能是機(jī)體產(chǎn)生的少量IgG1類抗體激活了經(jīng)典補(bǔ)體途徑，但膜性腎病患者的C1q水平低甚至檢測不到，故可排除經(jīng)典的補(bǔ)體激活途徑，間接證實(shí)了IMN是通過其他途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)的。而旁路途徑或甘露糖交聯(lián)凝集素途徑可能是該病的補(bǔ)體激活途徑，含量較高的甘露聚糖凝集素的結(jié)合物可在特發(fā)性膜性腎病患者被檢測，支持了這一觀點(diǎn)[24,25]。補(bǔ)體活化后形成C5b-9，通過對足細(xì)胞DNA損傷、氧化劑和蛋白酶作用、及對足細(xì)胞裂孔蛋白的破壞等，導(dǎo)致濾過屏障破壞，從而產(chǎn)生蛋白尿。

研究者認(rèn)為特發(fā)性膜性腎病的發(fā)病機(jī)制可能與補(bǔ)體的激活不相關(guān)，可能是自身抗體本身介導(dǎo)的一種激活反應(yīng)。足細(xì)胞表面PLA2R的生理功能還不是很清楚，抗PLA2R自身抗體可能干擾了PLA2R的正常功能，或是作為異常的激活劑或抑制劑，而引起足細(xì)胞的病理改變[26]。

2　特發(fā)性膜性腎病相關(guān)非足細(xì)胞靶抗原及其作用機(jī)制

2.1抗醛糖還原酶、超氧化物歧化酶Prunotto[27]發(fā)現(xiàn)IMN患者血清中存在抗醛糖還原酶(Aldose reductase,AR)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase 2,SOD2)的兩種抗體，并且患者腎組織中，這兩種物質(zhì)相應(yīng)的抗體、補(bǔ)體成分共存在于足突細(xì)胞電子致密物中。AR屬于醛酮還原酶家族可催化NADPH介導(dǎo)的脂肪族和芳香族醛或酮的還原，它特殊的功能是可把糖轉(zhuǎn)化成山梨醇，并調(diào)節(jié)組織的緊張性和滲透性。正常腎臟組織的AR被髓質(zhì)的腎小管上皮細(xì)胞遏制而不能表達(dá)；SOD2是保護(hù)細(xì)胞，防止氧化。在腎臟SOD2廣泛的表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，尤其是皮質(zhì)區(qū)可防護(hù)腎臟缺血再灌注損傷，但并沒有報(bào)道證實(shí)腎小球上也表達(dá)SOD2。有動(dòng)物研究表明腎小球損傷是由足細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基引起足細(xì)胞膜損傷，當(dāng)機(jī)體存在抗AR和SOD2抗體時(shí)，就會使AR和SOD2失去可對細(xì)胞的保護(hù)作用。然而膜性腎病的患者，在采用還原性藥物進(jìn)行治療后，可有效地緩解蛋白尿癥狀。因此， AR和SOD2抗體阻礙了這兩種還原性蛋白在機(jī)體中的作用，使氧化應(yīng)激作用引起了腎小球的損傷。但兩種抗體對膜性腎病不具有特異性，AR與SOD2的在IMN患者中檢出率分別為25%～34%、28%～50%[28]。

2.2α-烯醇化酶在成人膜性腎病的患者中，不斷有其他引起疾病的靶抗原被發(fā)現(xiàn)，如α-烯醇化酶(Alpha enolase)，可能是IMN潛在的靶抗原，但α-烯醇化酶也在其他自身免疫性疾病中被檢出，對于IMN的特異性較低[29]，其致病可能與足細(xì)胞表面的抗原表達(dá)的相關(guān)。

2.3陽離子化牛血清白蛋白國外的研究[30]指出陽離子化牛血清白蛋白與膜性腎病的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)在成人及兒童患者體內(nèi)可以測得高濃度的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)及其特異性抗體，但成人血清內(nèi)的BSA為中性的，而兒童患者體內(nèi)的BSA帶有陽性電荷，并且只在兒童患者的腎小球內(nèi)皮下沉積物中發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白及其IgG抗體。動(dòng)物模型研究中，只有給予動(dòng)物注射陽離子牛血清白蛋白才會引起MN[31]。因此，陽離子BSA引起MN的機(jī)制可能是進(jìn)入血液循環(huán)的該物質(zhì)會與腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)上的陰離子結(jié)合，而形成的原位免疫復(fù)合物，激活體內(nèi)的免疫反應(yīng)，引起腎小球損傷。

3　用于膜性腎病診斷的自身抗體

目前，已發(fā)現(xiàn)的自身抗體中，唯有PLA2R與IMN的相關(guān)性和特異性較高，許多研究表明在特發(fā)性膜性腎病的進(jìn)程中，PLA2R自身抗體含量的變化與疾病的嚴(yán)重程度及病程進(jìn)展密切相關(guān)[32]，復(fù)發(fā)時(shí)抗體滴度會再度升高[33]。當(dāng)采用藥物如糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、利妥昔單抗等治療一段時(shí)期后，可以觀察到患者病情改善的同時(shí)PLA2R抗體濃度也下降，并且血清抗體消失要早于蛋白尿的消失[3,34]。因此可將PLA2R自身抗體用于IMN的診斷、鑒別診斷、治療評估以及預(yù)后隨訪觀察。

早期Beck研究組采用非還原SDS-PAGE電泳和Western blot檢測到PLA2R，但該方法操作復(fù)雜、耗時(shí)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高，不適用于大樣本量的臨床實(shí)驗(yàn)室使用[12]。隨后發(fā)展了基于重組細(xì)胞的間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence cell based assay,IIF-CBA)，在體外重組PLA2R，使其與患者血清中含有的抗PLA2R自身抗體結(jié)合，使用熒光標(biāo)記的二抗與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察到熒光物質(zhì)，便證明該患者體內(nèi)PLA2R抗體陽性，但其結(jié)果的判讀受主觀因素的影響較大[35,36]。為了進(jìn)行高通量樣本的定量檢測，研究者將可定位激光小珠免疫測定法(Addressable laser bead immunoassay，ALBIA)應(yīng)用于抗PLA2R自身抗體的檢測。該方法是使用承載著完整重組蛋白質(zhì)的可定位激光小珠免疫測定平臺檢測IMN患者血清中PLA2R抗體[35,37]。ALBIA是一個(gè)特定抗原的多路激光下的免疫熒光技術(shù)，該技術(shù)中特異的抗原(PLA2R)會與內(nèi)部標(biāo)記兩種不同比例熒光微球共價(jià)結(jié)合，孵化后與人類血清和熒光染料標(biāo)記的二抗結(jié)合，并用兩種激光分析。一種激光檢測小珠上結(jié)合的特異性目標(biāo)抗原(PLA2R)，而第二種激光用來檢測小珠上與熒光二抗結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物。ALBIA可在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測多種抗原但所需要的血清量只需2～20 μl。該法可以避免主觀因素對結(jié)果的影響。此外，為了能夠更精確地檢測抗體濃度，Hofstra等人采用了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對試驗(yàn)患者血清進(jìn)行測定，該方法在微孔板上包被PLA2R抗原，已稀釋的血清抗體與抗原結(jié)合，通過與酶標(biāo)二抗的特異性結(jié)合，而催化底物反應(yīng)，經(jīng)過酶標(biāo)儀的檢測得出樣本中抗PLA2R抗體的含量。該方法可對PLA2R抗體進(jìn)行定性或定量檢測，其敏感性、特異性較高，操作方便，適用于高通量檢測[21,38]。

THSD7A自身抗體只在PLA2R陰性的IMN患者中的檢出，故檢出率較低，敏感性較差，對人群中IMN患者診斷效能差。而非足細(xì)胞靶抗原AR、SOD2、α-烯醇化酶、BSA及其自身抗體的研究，雖然它們在IMN的發(fā)病機(jī)制中起一定作用，但也在其他多種疾病中發(fā)揮作用，對于IMN的診斷缺乏特異性。因此，目前這些自身抗體的檢測并未應(yīng)用于IMN的臨床診斷。

4　展望

近年來，IMN的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，盡管具體發(fā)病機(jī)制的研究仍不是很透徹，已發(fā)現(xiàn)NEP、PLA2R、THSD7A等自身抗體與該病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，這些抗體的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了膜性腎病的診斷、疾病分期、預(yù)后判斷、治療策略及療效監(jiān)測的改變，并且相關(guān)自身抗體的測定也逐漸廣泛的應(yīng)用到了臨床。然而，目前發(fā)現(xiàn)的自身抗體對IMN的診斷特異性與IMN診斷的金標(biāo)準(zhǔn)-腎組織活檢相比，尚有一定的差距。因此，還需要對疾病自身抗體進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以期找到新的該病特異性的抗體，加深對疾病的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識，同時(shí)也可以通過多種與疾病相關(guān)的自身抗體的聯(lián)合檢測，提高特發(fā)性膜性腎病的檢出率，以減少患者接受有創(chuàng)檢查的損傷，可有助于推動(dòng)膜性腎病的診斷、鑒別診斷、預(yù)后和治療策略的改進(jìn)。

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[收稿2015-07-10修回2015-08-07]

(編輯許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.037

R392 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1245-05

程桂雪(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事膜性腎病分子診斷方面的研究。

及指導(dǎo)教師：李永哲(1964年-)，男，博士，教授，主要從事自身免疫性疾病相關(guān)研究，E-mail:yongzhelipumch@126.com 。

秦曉松(1972年-)，女，博士，教授，主要從事腎病分子診斷方面研究，E-mail:qinxs@sj-hospital.org。