Nafion修飾碳纖維微電極在抗壞血酸共存下選擇性測(cè)定去甲腎上腺素

李　梅，陳　慧，伍雪巍，農(nóng)燕婷，陳思伶，唐旻奕，程　寒

(中南民族大學(xué)　藥學(xué)院，湖北　武漢　430074)

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Nafion修飾碳纖維微電極在抗壞血酸共存下選擇性測(cè)定去甲腎上腺素

李梅，陳慧，伍雪巍，農(nóng)燕婷，陳思伶，唐旻奕，程寒*

(中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430074)

制備了碳纖維微電極，將潔凈的碳纖維微電極浸入Nafion溶液中，采用電沉積的方法制得Nafion修飾碳纖維微電極。采用循環(huán)伏安法(CV)、差分脈沖伏安法(DPV)研究了去甲腎上腺素(NE)和抗壞血酸(AA)在電極上的電化學(xué)行為。結(jié)果表明：在最優(yōu)條件下制備的Nafion修飾電極能完全屏蔽AA的電化學(xué)響應(yīng)，而對(duì)NE仍表現(xiàn)出良好的電化學(xué)響應(yīng)。修飾電極能在1.0 mmol/L AA的共存下選擇性地測(cè)定NE，采用DPV進(jìn)行檢測(cè)，NE的氧化峰電流與其濃度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.991 2，檢出限(S/N=3)為8.6×10-7mol/L。利用該方法測(cè)定了模擬樣品中NE的含量，平均加標(biāo)回收率為101.6%。該電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，且具有良好的靈敏度和選擇性，有望用于復(fù)雜生物環(huán)境中NE濃度的檢測(cè)。

Nafion；碳纖維電極；差分脈沖伏安法；循環(huán)伏安法；去甲腎上腺素；抗壞血酸

去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)是一種神經(jīng)遞質(zhì)，主要由交感節(jié)后神經(jīng)元和腦內(nèi)腎上腺素能神經(jīng)末梢合成和分泌。動(dòng)物體內(nèi)的NE含量變化反映了肢體神經(jīng)系統(tǒng)植物交感神經(jīng)的活動(dòng)狀況，其代謝障礙會(huì)引起含量的改變，從而影響心血管功能的調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、情感障礙、體溫調(diào)節(jié)、攝食等生理功能，因此在臨床和基礎(chǔ)研究中具有非常重要的作用[1-4]?？箟难?Ascorbic acid,AA)又稱維生素C，是一種在生物體內(nèi)維持機(jī)體正常生理功能的維生素，作為一種抗氧化劑，AA還可以保護(hù)身體免受自由基的威脅。NE與AA均為電化學(xué)活性物質(zhì)，可采用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。由于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)AA與NE共存，但AA平均濃度比NE高10～1 000倍，且與NE氧化峰重疊，從而干擾NE的測(cè)定[5-6]。因此排除AA的干擾，選擇性測(cè)定NE在生理功能研究和臨床檢測(cè)中有重要意義。張宏等[7]利用電沉積的方法制得納米金修飾玻碳電極，該修飾電極對(duì)NE氧化反應(yīng)有催化作用。由NE和AA在納米金修飾電極上的循環(huán)伏安圖可觀察到兩個(gè)明顯分開(kāi)的氧化峰，峰電位差達(dá)131 mV，因此，可利用該修飾電極在AA存在下選擇性測(cè)定NE。但因納米金修飾層易脫落，導(dǎo)致修飾電極不穩(wěn)定。

Nafion聚合物因具有導(dǎo)電性好、對(duì)熱和化學(xué)物質(zhì)穩(wěn)定、阻抗小、水中溶解度小，同時(shí)還具有化學(xué)惰性、耐腐蝕性等優(yōu)點(diǎn)，成為一種良好的電極修飾材料[8-11]。由于Nafion膜含有帶負(fù)電的磺酸基團(tuán)，只與陽(yáng)離子發(fā)生選擇性交換，排斥中性分子和陰離子，是一種優(yōu)良的陽(yáng)離子交換劑[12-14]，因此用作電極修飾材料具有良好的離子選擇性。Nafion膜廣泛應(yīng)用于化學(xué)修飾電極以增加修飾電極對(duì)陽(yáng)離子的選擇性[15-17]。金利通等[8]的研究顯示，Nafion膜修飾電極對(duì)表面活性物質(zhì)具有良好的抗干擾能力，因此應(yīng)用Nafion修飾電極可提高分析靈敏度和抗干擾能力。

本文利用兩種方法制備了Nafion修飾碳纖維電極，對(duì)兩種方法的修飾效果進(jìn)行比較，選擇較優(yōu)的電沉積法將Nafion修飾到碳纖維電極表面，對(duì)電沉積時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)一步探索了AA和NE在修飾電極上的電化學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，修飾電極對(duì)NE有良好的電化學(xué)響應(yīng)及穩(wěn)定性，且能完全屏蔽AA的電化學(xué)信號(hào)，采用該修飾方法可在高濃度AA共存下選擇性地測(cè)定NE。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

XD-RFL實(shí)驗(yàn)室倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)，CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，采用兩電極系統(tǒng)，碳纖維微電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極。分析天平(奧豪斯上海責(zé)任有限公司)，F(xiàn)E20K型酸度計(jì)(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))。

碳纖維(直徑6 μm，吉林市神舟碳纖維有限責(zé)任公司)；5% Nafion(Sigma公司)；去甲腎上腺素(NE，Sigma公司)用0.1 mol/L的HClO4配成1.0×10-2mol/L的母液，置于4 ℃的冰箱冷藏室中保存，使用時(shí)以Tris-HCl緩沖溶液稀釋至所需濃度；碳粉導(dǎo)電膠(自制)，無(wú)水乙醇(分析純，天津醫(yī)藥公司)，抗壞血酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，所有其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2碳纖維微電極的制作

在酒精燈的外焰上拉制玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑1 mm)，使拉制好的毛細(xì)管尖端內(nèi)徑約20 μm，將分離好的碳纖維(直徑6 μm，長(zhǎng)約15 mm)和銅絲(銅絲兩端均去掉約1.5 cm的絕緣層，銅絲直徑0.2 mm，長(zhǎng)約10 cm)用碳粉導(dǎo)電膠粘連，將碳纖維從玻璃毛細(xì)管另一端穿入至露出玻璃毛細(xì)管尖端外約2 mm，用AB膠將玻璃毛細(xì)管末端封住，且保證粘膠固化后固定在銅絲上，然后于酒精燈外焰上灼燒，迅速取出，直至玻璃毛細(xì)管尖端熔封，封好后，在倒置顯微鏡下測(cè)量電極長(zhǎng)度，若碳纖維過(guò)長(zhǎng)，則將露出的碳纖維在酒精燈外焰上燒蝕，確保露出的碳纖維長(zhǎng)度為100～200 μm，即得碳纖維微電極。

1.3電沉積法制作Nafion修飾電極

用無(wú)水乙醇將5% Nafion試劑稀釋至1%后使用。將裸電極置于制備好的1%Nafion溶液中，1.5 V電壓下電鍍5 s，取出，室溫條件下自然晾干(3～5 min)，重復(fù)沉積多次，優(yōu)化Nafion修飾量，修飾電極洗凈待用。

1.4滴涂法制作Nafion修飾電極

將裸電極放在載玻片上，取制備好的1% Nafion溶液10 μL(Nafion溶液剛好能將碳纖維電極尖端浸沒(méi))，滴在電極尖端，室溫下自然晾干，修飾電極洗凈待用。

2　結(jié)果與討論

2.1電沉積法與滴涂法修飾電極的穩(wěn)定性比較

選擇經(jīng)電沉積5 s修飾的電極以及滴涂法制備的電極分別在1.0×10-4mol/L NE溶液中進(jìn)行連續(xù)測(cè)定(DPV，n=5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用電沉積法修飾的碳纖維電極在NE中多次測(cè)定，響應(yīng)電流幾乎不變，電極的重現(xiàn)性良好；而滴涂法修飾的電極多次測(cè)量后電流明顯減弱。因此，采用電沉積法制備Nafion膜更穩(wěn)定，碳纖維修飾電極的電化學(xué)性能亦更穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇電沉積法制備Nafion膜。

2.2Nafion修飾量的優(yōu)化

將潔凈碳纖維電極置于1% Nafion溶液中，于1.5 V電壓下采用電流～時(shí)間曲線電沉積5 s，取出，室溫下放置3～5 min，自然晾干，重復(fù)電沉積多次，每次電沉積完畢，均于1.0×10-3mol/L AA中記錄DPV圖。結(jié)果顯示，由于Nafion 膜只與陽(yáng)離子發(fā)生選擇性交換，靜電排斥陰離子，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液中，AA帶負(fù)電荷，因此，隨著電沉積次數(shù)的增加，修飾電極于1.0×10-3mol/L AA溶液中的電化學(xué)響應(yīng)逐漸減小，經(jīng)1% Nafion溶液反復(fù)電沉積9次(5 s/次)后，修飾電極完全屏蔽了AA的電化學(xué)響應(yīng)。

2.3Nafion修飾電極的掃描電鏡表征

碳纖維微電極和Nafion修飾的碳纖維微電極的掃描電鏡圖片如圖1所示，碳纖維微電極的表面平整光滑(圖1A)，而修飾電極幾何尺寸增加(圖1B)，表明帶負(fù)電荷的Nafion膜沉積在電極表面。

2.4Nafion修飾電極的伏安特性

采用1% Nafion溶液反復(fù)電沉積9次(5 s/次)得到Nafion修飾的碳纖維電極，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液中，考察了電極修飾前后在1.0×10-3mol/L AA和1.0×10-4mol/L NE溶液中的差分脈沖伏安曲線。由圖可見(jiàn)，修飾Nafion前，電極在AA溶液中有較強(qiáng)電流信號(hào)，修飾后電極在1.0×10-3mol/L AA中幾乎無(wú)響應(yīng)，AA的電化學(xué)信號(hào)完全被屏蔽(圖2A)；在1.0×10-4mol/L NE中Nafion修飾電極比裸電極的響應(yīng)電流略小，但仍表現(xiàn)出良好的電化學(xué)響應(yīng)(圖2B)。

由此可見(jiàn)，采用最優(yōu)條件下的Nafion修飾電極能完全屏蔽AA的電化學(xué)響應(yīng)，而對(duì)NE仍表現(xiàn)出良好的電化學(xué)響應(yīng)。這是因?yàn)樵趐H 7.2的Tris-HCl中，由于Nafion結(jié)構(gòu)中含有磺酸基，在溶液中解離后可使修飾的電極表面帶負(fù)電荷。NE結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)酚羥基和一個(gè)氨基，堿性較強(qiáng)，在pH 7.2的條件下，以質(zhì)子化形式存在，帶正電荷；而AA在此體系中帶負(fù)電荷。由于異性電荷相吸引，NE吸附在電極表面，使得其在電極表面的濃度增加，同時(shí)Nafion修飾層的存在也在一定程度上減弱了電極的電子傳遞能力，在上述兩種作用的影響下，NE的氧化峰電流略有減小，但仍表現(xiàn)出良好的電化學(xué)響應(yīng)。

2.5NE氧化峰電流與掃速的關(guān)系

研究了潔凈碳纖維電極在1.0×10-4mol/L NE中的氧化峰電流(I，μA)與掃描速率(v,mV/s)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在20～2 000 mV/s掃速范圍內(nèi)，NE的氧化峰電流隨著掃速的增大而增大，且氧化峰電流與掃速成正比，線性回歸方程為I=7×10-12v+2×10-8，r=0.995 0，表明NE在碳纖維電極上的氧化過(guò)程受吸附控制。

同時(shí)，研究了Nafion修飾電極在1.0×10-4mol/L NE中的氧化峰電流與掃描速率之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，在20～2 000 mV/s掃速范圍內(nèi)，NE的氧化峰電流與掃速成正比，回歸方程為I=6×10-12v+1×10-8，r=0.999 0，表明NE在修飾電極上的氧化過(guò)程亦受吸附控制。

2.6工作曲線及線性范圍

在1.0×10-3mol/L AA共存條件下，在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液中，利用DPV法測(cè)定NE，結(jié)果見(jiàn)圖3。在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)，NE的氧化峰電流隨其濃度的增大而增大，且NE的濃度與氧化峰電流呈良好的線性關(guān)系(圖3插圖)，其線性方程為I=3×10-5c+4×10-10,r2=0.991 2。修飾電極對(duì)Nafion的檢出限(S/N=3)達(dá)8.6×10-7mol/L。即使在AA濃度高出NE 3個(gè)數(shù)量級(jí)的情況下，Nafion修飾電極仍能選擇性地檢測(cè)NE。

2.7實(shí)際樣品的測(cè)定

在優(yōu)化條件下，采用20 mmol/L Tris-HCl配制3.0×10-5mol/L NE及1.0×10-3mol/L AA混合溶液，在優(yōu)化條件下對(duì)電極進(jìn)行電沉積修飾，并對(duì)NE做3個(gè)水平(4.0×10-5，3.0×10-5，5.0×10-5mol/L)的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，測(cè)得回收率分別為101.1%，101.7%，102.0%，平均回收率為101.6%。

3　結(jié)　論

本文采用電沉積法及滴涂法將Nafion修飾到碳纖維電極表面，形成Nafion修飾的碳纖維電極，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電沉積法制備的修飾電極電化學(xué)性能更穩(wěn)定。研究了NE和AA在該修飾電極上的電化學(xué)行為，優(yōu)化了Nafion的修飾用量，使得修飾電極能屏蔽AA的電化學(xué)響應(yīng)。Nafion修飾電極能在高濃度(1.0×10-3mol/L)AA共存下選擇性測(cè)定NE，且NE的氧化峰電流與濃度在1.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。該修飾方法具有良好的靈敏度和選擇性，有望用于復(fù)雜生物環(huán)境中NE濃度的檢測(cè)。

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Selective Detection of Norepinephrine at Nafion Modified Carbon Fiber Microelectrode in the Presence of Ascorbic Acid

LI Mei,CHEN Hui,WU Xue-wei,NONG Yan-ting,CHEN Si-ling,TANG Min-yi,CHENG Han*

(College of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Wuhan430074，China)

A carbon fiber microelectrode modified with Nafion was fabricated by electrodeposition method on the basis of previous work.The electrochemical behaviour of norepinephrine(NE) and ascorbic acid(AA) at the prepared microelectrodes before and after modification were investigated using cyclic voltammetry(CV) and differential pulse votammetric(DPV) methods.Under the optimum conditions,the Nafion modified electrode can completely shield the electrochemical response of AA,however,a sensitive response to NE was obtained on the modified electrode.Based on this,the modified electrode can be used to selectively detect NE without interference from high concentration AA.DPV response of NE showed a good linearity(r2=0.991 2) at the modified microelectrode with its concentration in the range of 1.0×10-6-1.0×10-4mol/L,with a detection limit(S/N=3) of 8.6×10-7mol/L.The proposed method was applied in the determination of NE in simulation sample with spiked recovery of 101.6%.The modified electrode exhibited almost the same electrochemical behavior after a month,indicating that the modified electrode is pretty stable and has a good reproducibility.The advantages of excellent sensitivity and selectivity made the modified electrode could be used to monitor NE in complex biological environment.

Nafion；carbon fiber electrode；differential pulse voltammetry(DPV)；cyclic voltammetry(CV)；norepinephrine(NE)；ascorbic acid(AA)

2015-10-01；

2015-12-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21205144)；中南民族大學(xué)學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)(XTZ15013)；中南民族大學(xué)民族藥學(xué)十二五實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心資助

程寒，博士，副教授，研究方向：藥物分析，Tel:027-67841196，E-mail:chenghan@mail.scuec.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.020

O657.1;R458.3

A

1004-4957(2016)06-0744-05