聚硫堇為探針與固定化載體的適配體傳感器用于雙酚A的檢測(cè)研究

楊紹明，張小榮，鄭　玥，丁素游，陳延勝

(華東交通大學(xué)　理學(xué)院，江西　南昌　330013)

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聚硫堇為探針與固定化載體的適配體傳感器用于雙酚A的檢測(cè)研究

楊紹明*，張小榮，鄭玥，丁素游，陳延勝

(華東交通大學(xué)理學(xué)院，江西南昌330013)

研制了一種簡單和靈敏地檢測(cè)環(huán)境激素雙酚A(BPA)的電化學(xué)適配體傳感器。首先在玻碳電極(GCE)表面采用電沉積法沉積一層多孔納米金(NP-Au)，再采用電聚合法將硫堇(TH)和適配體(APT)一步聚合到電極表面，以聚硫堇(PTH)作為電化學(xué)探針和APT的固定化載體，以牛血清白蛋白(BSA)抑制非特異性吸附，構(gòu)筑GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA傳感器。采用差分脈沖伏安法對(duì)該傳感器的電化學(xué)性能進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)雙酚A在10.0 fg/mL～1.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)有較好的信號(hào)響應(yīng)，檢出限為5.3 fg/mL。以GCE/PTH+APT/BSA傳感器作為對(duì)照，其對(duì)雙酚A在10.0 fg/mL～1.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為9.0 fg/mL。結(jié)果表明多孔納米金的引入可有效提高傳感器的靈敏度。GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA傳感器具有選擇性高和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。

雙酚A；適配體；傳感器；多孔納米金；聚硫堇

雙酚A(BPA)作為一種典型的環(huán)境激素，是聚碳酸酯塑料、聚合物封裝等材料的基本組分，被廣泛用于嬰兒奶瓶、水瓶、食品容器、聚氯乙烯拉伸膜和硬紙板等材料中。BPA通過食品、飲用水及空氣等的污染對(duì)人類健康造成威脅，并且在自然環(huán)境中不易分解，易在生物體內(nèi)蓄積，因此受到世界各地監(jiān)管機(jī)構(gòu)的關(guān)注。目前，BPA的檢測(cè)手段有色譜法、分光光度法以及免疫分析法等[1-4]。但傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在諸多不足，比如試劑、設(shè)備成本昂貴和靈敏度低等。電化學(xué)傳感方法具有成本低、檢測(cè)快速和靈敏度高等特點(diǎn)，是一種潛在的高效分析手段[5-7]。

適配體(APT) 是能夠從生物體外篩選得到的單鏈DNA或RNA，鏈段的結(jié)構(gòu)和堿基對(duì)排序可以隨意組合配對(duì)，其和待測(cè)物之間可進(jìn)行一對(duì)一的特異性結(jié)合，且反應(yīng)迅速、靈敏度高[8]。由于這些特殊的性質(zhì)，適配體較傳統(tǒng)抗體在分子識(shí)別方面具有更為廣闊的應(yīng)用前景，受到了眾多研究人員的關(guān)注。適配體電化學(xué)傳感器在BPA的分析檢測(cè)方面也取得了一定的進(jìn)展，如以納米材料石墨烯/金納米粒子、多孔納米金為信號(hào)增敏材料，以溶液中的鐵氰化鉀、嵌入在適配體-互補(bǔ)DNA中的亞甲基藍(lán)或BPA的直接氧化為檢測(cè)信號(hào)可實(shí)現(xiàn)對(duì)BPA的檢測(cè)[9-11]。但目前報(bào)道的適配體傳感器檢測(cè)BPA的方法存在電化學(xué)探針使用不便或穩(wěn)定性不高，以及BPA的直接氧化導(dǎo)致易產(chǎn)生干擾等缺點(diǎn)。

多孔納米金是一種兼具納米材料和多孔材料優(yōu)點(diǎn)的固體材料，具有高的導(dǎo)電率、良好的生物相容性、超大的比表面積、較均勻的納米孔和高的孔隙率特征，在生物傳感器中作為信號(hào)放大基材受到越來越多的關(guān)注[12]。硫堇(TH)是噻吩嗪類的雜環(huán)分子，具有平面共軛結(jié)構(gòu)，使之與DNA鏈能夠通過嵌插方式進(jìn)行結(jié)合，而其單體能夠通過電化學(xué)方式進(jìn)行聚合，形成聚硫堇(PTH)。PTH具有很好的電化學(xué)可逆性、穩(wěn)定性以及高效的電子傳遞能力，在生物傳感器方面可充當(dāng)檢測(cè)分析物的電化學(xué)探針[13-15]。

本文以玻碳電極(GCE)為基質(zhì)，采用電沉積法在電極表面沉積一層多孔納米金，利用多孔納米金的大比表面積及其良好的導(dǎo)電性來放大電化學(xué)信號(hào)。利用硫堇單體的電聚合反應(yīng)在電極表面形成的PTH作為修飾電極的電化學(xué)探針，PTH在聚合過程中，帶負(fù)電荷的適配體通過靜電作用鑲嵌在帶正電荷的PTH的網(wǎng)格中，從而實(shí)現(xiàn)適配體的固定化，將雙酚A的適配體負(fù)載到玻碳電極表面，再以BSA作為封閉劑。當(dāng)待測(cè)液中有BPA存在時(shí)，其與適配體進(jìn)行特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致修飾電極的電化學(xué)信號(hào)減弱，利用電化學(xué)信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)BPA的定量檢測(cè)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

雙酚A適配體(5′-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3′，生工生物工程(上海)有限公司)[11]；氯金酸(HAuCl4，上海試劑一廠)；牛血清蛋白(BSA,上海晶純實(shí)業(yè)有限公司)；雙酚A(BPA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；硫堇(TH，上?；瘜W(xué)試劑公司)；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；JSM-6701F型掃描電子顯微鏡(日本電子(JEOL)公司)；三電極體系(鉑電極為對(duì)電極，Ag/AgCl為參比電極，3 mm直徑玻碳電極為工作電極)。

1.2溶液的配制

雙酚A適配體和硫堇溶液以pH 6.8的PBS配成含0.10 mmol/L TH和1.0 μmol/L雙酚A的溶液，置于 4 ℃冰箱中保存；BSA 以PBS( 0.2 mol/L,pH 6.8) 緩沖溶液配制成 1.0 mg/mL的溶液，貯存于 4 ℃冰箱內(nèi)；各濃度的BPA溶液均以乙醇配制。

1.3修飾電極的制備

1.3.1GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修飾電極的制備將GCE按照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行預(yù)處理后，置于新配的0.08 mol/L的HAuCl4和 0.004 mol/L 的Pb(CH3COO)2溶液中，于-0.5 V 電位下進(jìn)行恒電位沉積，沉積時(shí)間為 70 s，得GCE/NP-Au修飾電極[17]。將該電極置于含有 1.0 μmol/L BPA適配體和0.10 mmol/L硫堇(TH)的溶液中循環(huán)伏安法掃描20圈，得到 GCE/NP-Au/PTH+APT修飾電極。再將該電極置于1.0 mg/mL 的 BSA 中浸泡 40 min，制得 GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修飾電極。

1.3.2GCE/PTH+APT/BSA 修飾電極的制備參照“1.3.1”將預(yù)處理好的GCE電極置于含有 1.0 μmol/L BPA適配體的硫堇溶液中循環(huán)伏安法掃描 20 圈，得到 GCE/PTH+APT 修飾電極。再將該電極置于1.0 mg/mL 的 BSA 中浸泡 40 min，制得 GCE/PTH+APT/BSA 修飾電極。

1.4電化學(xué)測(cè)試方法

將制備好的GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 或GCE/PTH+APT/BSA 電極置于0.2 mol/L PBS(pH 6.0)溶液中，使用三電極系統(tǒng)，采用差分脈沖伏安法(DPV)對(duì)GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 或GCE/PTH+APT/BSA 電極進(jìn)行掃描得到空白電流(I0)，再將電極置于BPA溶液中培養(yǎng)40 min后，用DPV進(jìn)行掃描得到電流I，以傳感器的電流響應(yīng)ΔI(ΔI=I-I0)實(shí)現(xiàn)對(duì)BPA的檢測(cè)。

方位向間歇采樣散射波是對(duì)傳統(tǒng)散射波干擾的改進(jìn)，其原理是：干擾機(jī)對(duì)截獲到的SAR脈沖信號(hào)進(jìn)行周期性地全脈沖采樣(如圖2)，然后轉(zhuǎn)發(fā)至特定散射區(qū)域，干擾信號(hào)經(jīng)散射后被SAR接收.忽略干擾機(jī)轉(zhuǎn)發(fā)延時(shí)，設(shè)未經(jīng)方位向間歇采樣的傳統(tǒng)散射波信號(hào)形式為

在含0.1 mol/L KCl的 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](體積比1∶1)溶液中測(cè)定得到交流阻抗譜(振幅:0.005 V，頻率范圍:1 ～ 100 000 Hz)，并通過ZSimpwin軟件模擬而成。

2　結(jié)果與討論

2.1多孔納米金的表征

采用SEM對(duì)NP-Au/GCE的表面形貌進(jìn)行表征。如圖1A所示，采用電沉積法在玻碳電極表面沉積 70 s,得到納米多孔金修飾電極，其表面的樹枝狀骨架之間形成多孔金結(jié)構(gòu)，且排列致密，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]。對(duì)NP-Au/GCE修飾電極進(jìn)行能譜分析(圖1B)，從圖中可以明顯看出碳元素和金元素的峰，出現(xiàn)碳元素是由于基底為玻碳電極，說明修飾在玻碳電極上的樹枝網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)物質(zhì)為多孔納米金。

2.2不同修飾電極的 CV 表征

2.2.1GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA修飾電極采用CV法對(duì)該修飾電極的組裝過程進(jìn)行表征，結(jié)果見圖2。圖中曲線a為 GCE/NP-Au 修飾電極在 PBS 溶液中的循環(huán)伏安曲線，曲線b為電極表面負(fù)載適配體和聚硫堇后(GCE/NP-Au/PTH+APT修飾電極)的循環(huán)伏安曲線，在-0.1 V 左右出現(xiàn)1對(duì)聚硫堇的氧化還原峰；曲線c為GCE/NP-Au/PTH+APT修飾電極表面組裝上BSA后的循環(huán)伏安曲線，由于BSA不導(dǎo)電，聚硫堇的氧化還原峰變?。磺€d為GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA在 10.0 pg/mL 的BPA中孵育 20 min 后的循環(huán)伏安曲線，聚硫堇的氧化還原峰電流繼續(xù)減小，這是因?yàn)檫m配體與BPA結(jié)合到電極表面阻礙了聚硫堇氧化還原的電子傳遞，同時(shí)也說明BPA已成功結(jié)合到電極表面。

2.2.2GCE/PTH+APT/BSA 修飾電極采用CV法對(duì)該修飾電極的組裝過程進(jìn)行表征，結(jié)果見圖3。圖中曲線a為GCE在PBS溶液中的循環(huán)伏安曲線；曲線b為GCE電極表面負(fù)載適配體和電聚合一層硫堇后的循環(huán)伏安曲線，在-0.13 V 和-0.18 V 處出現(xiàn)的1對(duì)氧化還原峰為聚硫堇的氧化還原峰；曲線c為GCE/PTH+APT修飾電極表面組裝上BSA后的循環(huán)伏安曲線，由于BSA不導(dǎo)電，聚硫堇的氧化還原峰變??；曲線d為GCE/PTH+APT/BSA在 10.0 pg/mL 的BPA中孵育 20 min 后的循環(huán)伏安曲線，聚硫堇的氧化還原峰電流繼續(xù)減小，說明BPA已成功地結(jié)合到電極表面。比較圖2～3可知，大比表面積和高導(dǎo)電性的NP-Au顯著放大了電化學(xué)探針聚硫堇的信號(hào)。

2.3不同修飾電極的EIS表征

2.3.2GCE/PTH+APT/BSA 修飾電極采用EIS法對(duì)GCE/PTH+APT/BSA修飾電極的組裝過程進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，裸玻碳電極的阻抗圖呈1個(gè)較小的半圓，其阻抗為64 Ω；在GCE電極表面負(fù)載上PTH+APT后，阻抗圖的半圓直徑增大，說明適配體的不導(dǎo)電性使阻抗增大(177 Ω)；分別在GCE/PTH+APT修飾電極表面組裝上BSA及在10.0 pg/mL BPA中孵育后所測(cè)得的阻抗圖，半圓直徑持續(xù)增大(前者阻抗為192 Ω，后者為300 Ω)，說明BSA及BPA很好地組裝到電極的表面。EIS表征結(jié)果表明，由于多孔納米金的多孔性和良好導(dǎo)電性，在沉積多孔納米金后的電極表面負(fù)載PTH+APT的阻抗(146 Ω)明顯小于未沉積多孔納米金修飾電極表面負(fù)載PTH+APT的阻抗(177 Ω)；而在10.0 pg/mL BPA中孵育后，GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA的阻抗(390 Ω)明顯比GCE/PTH+APT/BSA修飾電極的阻抗(300 Ω)大，說明多孔納米金有效增大了電極的表面積及適配體的負(fù)載量，從而結(jié)合大量的BPA導(dǎo)致阻抗增大。

2.4修飾電極的性能研究

2.4.1GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修飾電極將修飾好的GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 電極置于不同濃度( 10.0 fg/mL ～ 1.0 ng/mL)的BPA溶液中進(jìn)行孵育，采用DPV法對(duì)其孵育后的電流變化ΔI進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，BPA在 10.0 fg/mL ～ 1.0 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，ΔI與lgc呈線性關(guān)系，線性方程為ΔI=6.59lgc(pg/mL)-3.71，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999，檢出限(S/N=3)為 5.3 fg/mL。

2.4.2GCE/PTH+APT/BSA 修飾電極將修飾好的 GCE/PTH+APT/BSA 電極置于不同濃度(10.0 fg/mL ～ 1.0 ng/mL)的BPA溶液中進(jìn)行孵育，采用DPV法對(duì)其孵育后的電流變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，BPA在 10.0 fg/mL～1.0 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，ΔI與lgc呈線性關(guān)系，線性方程為ΔI=0.09 lgc(pg/mL)+0.03，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999，檢出限為9.0 fg/mL。

將兩種修飾電極測(cè)定BPA的線性方程進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，由于多孔納米金的引入，GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA的靈敏度顯著高于GCE/PTH+APT/BSA，表明多孔納米金可有效增大電極的表面積從而增大適配體的負(fù)載量和聚硫堇的電化學(xué)信號(hào)，導(dǎo)致GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA的靈敏度提高。

2.5抗干擾性與穩(wěn)定性

為考察傳感器的抗干擾能力，以乙醇分別配制10.0 pg/mL BPA、50.0 pg/mL苯酚以及100.0 pg/mL的鄰苯二酚和間苯二酚進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，相對(duì)于該傳感器對(duì)BPA的響應(yīng)，其對(duì)5～10倍BPA濃度的苯酚、鄰苯二酚及間苯二酚的響應(yīng)較小，說明該傳感器的抗干擾能力強(qiáng)。

對(duì) GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修飾電極的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試。將其在10.0 pg/mL的BPA溶液中組裝后采用DPV法測(cè)定10次，其對(duì)應(yīng)峰電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 5.6%；將此電化學(xué)核酸適配體吹干置于 4 ℃ 冰箱內(nèi)1周后再測(cè)定，傳感器的響應(yīng)信號(hào)為初始的94%，說明該傳感器的穩(wěn)定性良好。同1支電極重復(fù)組裝4次測(cè)定 10.0 pg/mL 的BPA，RSD為 2.0%；采用4支不同的金電極同時(shí)組裝測(cè)定 10.0 pg/mL 的BPA，其RSD為 3.6%，說明該傳感器的重現(xiàn)性良好。

2.6回收率實(shí)驗(yàn)

為考察GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA 修飾電極的實(shí)用性與可靠性，以隨機(jī)配制的未知濃度樣品對(duì)傳感器進(jìn)行3個(gè)濃度水平(0.010，1.0,10.0 ng/mL)的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，3種加標(biāo)水平的回收率分別為94.0%,106.0%和98.0%；RSD(n=3)分別為2.6%，4.8%和3.5%。

3　結(jié)　論

本文首先利用電沉積法在玻碳電極表面沉積一層多孔納米金，再通過循環(huán)伏安法電聚合硫堇，將聚硫堇作為電化學(xué)探針，并以其作為固定化載體，在電聚合的過程中將BPA的適配體同步固定到電極表面，構(gòu)筑以聚硫堇為電化學(xué)探針和固定化載體的適配體電化學(xué)生物傳感器。采用DPV 法對(duì)該傳感器的性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA修飾電極上，BPA的ΔI與 其濃度的對(duì)數(shù)(lgc) 在 10.0 fg/mL～1.0 ng/mL 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為 5.3 fg/mL。同時(shí)對(duì)傳感器的抗干擾性、穩(wěn)定性和回收率進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，以聚硫堇為探針和固定化載體的核酸適配體電化學(xué)生物傳感器對(duì)BPA具有良好的信號(hào)響應(yīng)，且同時(shí)具有較高的選擇性和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

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Study of Bisphenol A Determination Using Aptamer Sensor with Polythionine as Electrochemical Probe and Immobilization Matrix

YANG Shao-ming*,ZHANG Xiao-rong,ZHENG Yue,DING Su-you,CHEN Yan-sheng

(School of Sciences,East China Jiaotong University,Nanchang330013,China)

A simple and sensitive electrochemical aptamer sensor was developed for the determination of environmental hormone bisphenol A(BPA).Nanoporous Au(NP-Au) was first deposited on the glassy carbon electrode(GCE) surface by electrochemical deposition,followed by one-step electropolymerization synthesis of polythionine(PTH) and aptamer(APT).The PTH was used as a redox electrochemical probe and the immobilization matrix for APT.Then,BSA as a blocking agent was used to prevent non-specific adsorption.The electrochemical behavior of the GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA aptamer sensor was studied by DPV method.The GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA sensor showed a good linear range of 10.0 fg/mL-1.0 ng/mL for BPA with a detection limit of 5.3 fg/mL.The GCE/PTH+APT/BSA sensor as reference showed a linear range of 10.0 fg/mL-1.0 ng/mL for BPA with a detection limit of 9.0 fg/mL.The experimental results showed that the introduction of NP-Au could effectively improve the sensitivity.The GCE/NP-Au/PTH+APT/BSA sensor had the advantages of high selectivity and low detection limit.

bisphenol A；aptamer；sensor；nanoporous Au；polythionine

2015-10-28；

2015-12-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21465012，21065004);江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ150544)

楊紹明，博士，教授，研究方向：電分析化學(xué)及生物傳感器，Tel：0791-87046336，E-mail：yangsm79@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.016

O657.1；O629.8

A

1004-4957(2016)06-0724-05