黃河三角洲土壤古菌群落結(jié)構(gòu)對鹽生植被演替的響應(yīng)

張 玥,孔 強,郭篤發(fā)*,金建玲,姜愛霞,郭 健

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黃河三角洲土壤古菌群落結(jié)構(gòu)對鹽生植被演替的響應(yīng)

張 玥1,孔 強1,郭篤發(fā)1*,金建玲2,姜愛霞1,郭 健3

(1.山東師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院,山東 濟南 250014；2.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟南 250100；3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程系,山東 濟南 250100)

采用高通量測序技術(shù),探究黃河三角洲光板地和4種典型鹽生植被類型(翅堿蓬、獐茅、白茅和羅布麻)下土壤古菌群落組成和數(shù)量分布特征,揭示其對鹽生植被演替的響應(yīng).結(jié)果表明,植被覆蓋有利于降低土壤鹽化程度、增加土壤營養(yǎng)物質(zhì)含量,土壤速效磷隨鹽生植被在光板地-重鹽土壤(翅堿蓬、獐茅)-輕鹽土壤(白茅、羅布麻)中的正向演替有不斷升高的趨勢.5種覆被類型下土壤古菌在種群組成上差異明顯,無植被覆蓋的光板地具有最高的古菌群落多樣性和豐富度,廣古菌門為優(yōu)勢菌群.土壤古菌群落結(jié)構(gòu)與鹽生植被演替順序不具有嚴(yán)格的一致性:當(dāng)植被處于相同演替階段時,土壤古菌群落結(jié)構(gòu)不具明顯的相似性;在不同演替階段時,土壤古菌群落結(jié)構(gòu)也未均表現(xiàn)出更大的差異性.隨著鹽生植被正向演替,土壤溫度、電導(dǎo)率(含鹽量)對土壤古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性起促進作用,土壤全氮、堿解氮、有機質(zhì)起抑制作用.

黃河三角洲；古菌群落結(jié)構(gòu)；高通量測序；鹽生植被

古菌曾被認(rèn)為是細(xì)菌的一個分支,直到Woese[1]于1990年首次將自然界微生物分為3大領(lǐng)域:真核生物、細(xì)菌和古菌,使古菌明顯區(qū)別于細(xì)菌.在微生物非培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用之前,古菌被認(rèn)為只存在于熱泉、鹽湖和深海熱液等極端環(huán)境中[2].近年來的研究表明,古菌廣泛分布于土壤、湖泊、河流、海洋以及沼澤等環(huán)境中[3-6].由于極端的生存環(huán)境以及未知的生理過程和功能,古菌被現(xiàn)代微生物學(xué)、環(huán)境學(xué)等學(xué)科視為重要的研究對象之一[7],其在植物—土壤—古菌生態(tài)系統(tǒng)中的作用日漸凸顯.研究古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性有助于較早反映土壤質(zhì)量變化,成為評價自然或人為干擾引起的土壤質(zhì)量變化的重要指示因子[8].

黃河三角洲為陸進海退之地,由于其離海距離、成陸時間及土壤鹽堿程度不同,以裸地為起點,形成了強度、中度、輕度不同耐鹽程度的植被演替系列[9],是研究鹽堿土壤微生物群落及其與鹽生植被演替關(guān)系的天然實驗室.近年來對黃河三角洲微生物的研究主要集中于鹽漬土壤或石油污染土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面[10-11],國內(nèi)外對于古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究仍很薄弱,尤其對鹽生植被演替過程中土壤古菌響應(yīng)的研究還鮮見報道.

與國內(nèi)普遍使用的克隆測序技術(shù)相比,高通量測序技術(shù)擁有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高、獲得信息豐富等優(yōu)點[12].本研究利用高通量測序技術(shù)研究黃河三角洲土壤古菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量分布特征,揭示其與植被演替的關(guān)系,明確暖溫帶濱海鹽漬土區(qū)古菌微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量分布特征,旨在為進一步研究濱海鹽漬土區(qū)生物組成提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 土樣采集

土壤樣品于2012年6月采自黃河三角洲(現(xiàn)代三角洲),在研究區(qū)內(nèi)沿東西向路線,依照鹽生植被演替順序,選擇光板地、2種強耐鹽植物群落(翅堿蓬群落、獐茅群落)、2種輕耐鹽植物群落(白茅群落、羅布麻群落),采用對角線五點采樣法,每個植物群落取3個樣地,采集土壤樣品.采樣時,采集深度為0~20cm,并混合均勻,除去較大的根系等雜物,分為2份,每份約200g.一份土樣封于滅菌袋中,于4℃條件下保存,用于土壤理化性質(zhì)分析;另一份土樣放入液氮罐帶回實驗室,于-80℃條件下保存,用于分子生物學(xué)研究[13].

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

根據(jù)美國土壤質(zhì)地分類制分析土壤質(zhì)地,使用電導(dǎo)率儀(DDS-307,雷磁)測定土壤電導(dǎo)率,使用元素分析儀(vario Macro cube,德國Elementar)測定土壤全氮,采用堿解擴散法測定土壤堿解氮,土壤速效磷測定采用Olsen法,土壤有機質(zhì)測定采用低溫外加熱重鉻酸鉀氧化-比色法[14].

1.3 DNA提取

土壤樣品DNA的提取采用Omega DNA提取試劑盒(#D5625-01),依據(jù)試劑盒操作說明書進行操作.

1.4 PCR擴增

PCR擴增所用引物:正向F引物(CGTATCG- CCTCCCTCGCGCCATCAG+BACODE+PRIM-EF)、反向R引物(CTATGCGCCTTGCCAGCCC- GCTCAG+PRIME R).PCR反應(yīng)體系的各組分組成:模板DNA 10.0ng,引物(50μmol/L)各1.0μL, 10×PCR buffer 5.0μL,dNTP(10mmol/L) 0.5μL, Plantium TaqòDNA聚合酶0.5μL,ddH2O補至50.0μL.PCR熱循環(huán)參數(shù):94℃,預(yù)變性30s;94℃,變性20s;45℃,復(fù)性20s;65℃,延伸1min,擴增5個循環(huán);94℃,變性20s;60℃,復(fù)性20s;72℃,延伸20s,擴增20個循環(huán);72℃,延伸5min;10℃保存.

1.5 高通量測序

對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳測定,采用上海生工瓊脂糖回收試劑盒(cat:SK8131)對DNA進行回收.回收產(chǎn)物使用Qubitò2.0熒光劑進行定量處理,將所有樣品根據(jù)測得的DNA濃度按1:1混合,并充分震蕩均勻.混合產(chǎn)物使用羅氏公司454測序儀(Roch GS FLX sequencer)進行測序.

1.6 數(shù)據(jù)處理

將測序所得序列與RDP數(shù)據(jù)庫比對進行物種分類,通過Mothur軟件分析,將相似性大于97%的序列歸為同一種可操作分類單元(OTU),并進行α多樣性分析,計算α多樣性指數(shù):豐富度指數(shù)(Richness)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、ACE指數(shù)、覆蓋率(Coverage).

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

土壤理化性質(zhì)見表1.在5種覆被類型中,光板地、翅堿蓬地、白茅地屬于粉砂壤土,獐茅地和羅布麻地均屬于粉砂土.由于黃河三角洲土壤可溶性鹽分主要為NaCl,土壤電導(dǎo)率與鹽分含量可用線性方程模擬[15],采用土壤電導(dǎo)率表征土壤含鹽量.5種土壤中光板地、獐茅地、翅堿蓬地為海積潮濕正常鹽成土,白茅地和羅布麻地為弱鹽淡色潮濕雛形土,有植被覆蓋土壤鹽化程度較小,無植被覆蓋的光板地鹽化程度最高,其電導(dǎo)率達1.95dS/m.有機質(zhì)、全氮、堿解氮在有植被覆蓋土壤中的含量均高于光板地.速效磷含量白茅和羅布麻地高于翅堿蓬和獐茅地,光板地含量最低.可以看出,植被覆蓋有利于降低土壤鹽化程度、增加土壤營養(yǎng)物質(zhì)含量,土壤速效磷隨鹽生植被在光板地-重鹽土壤(翅堿蓬、獐茅)-輕鹽土壤(白茅、羅布麻)中的正向演替有不斷升高的趨勢.

表1 不同覆被類型土壤理化性質(zhì) Table 1 Soil properties of different land cover

2.2 土壤樣本測序結(jié)果

高通量測序結(jié)果經(jīng)過低質(zhì)量序列過濾后,得到的序列長度大部分分布于400~600bp之間,平均長度在440bp以上,滿足了進一步分析的質(zhì)量要求.5個土壤樣本共獲得80874條有效序列,分別為:光板地9586條,翅堿蓬11030條,獐茅23263條,白茅22794條,羅布麻14201條.OTU統(tǒng)計結(jié)果如表2所示.

2.3 不同覆被類型下土壤古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

表2 不同覆被類型下古菌群落多樣性指數(shù) Table 2 The soil archaeal diversity index of different land cover

2.4 不同覆被類型下土壤古菌群落結(jié)構(gòu)分析

5種覆被類型下的土壤古菌序列主要歸屬于兩個門類:泉古菌門(Crenarchaeota)和廣古菌門(Euryarchaeota).廣古菌門在五種土壤中的相對豐度為97.15%(光板地)~4.63%(白茅土壤),為優(yōu)勢菌群;泉古菌門在5種土壤中的相對豐度比廣古菌門小得多,僅為1.61%(白茅土壤)~ 0.05%(翅堿蓬土壤);未分類門在五種土壤中的相對豐度為93.75%(白茅土壤)~2.77%(光板地),差異較大.檢測到4個綱分類單元:廣古菌門下的鹽桿菌綱(Halobacteria)、熱原體綱(Thermoplasmata)、甲烷微菌綱(Methanomicrobia),泉古菌門下的熱變形菌綱(Thermoprotei),其中鹽桿菌綱為優(yōu)勢菌群;未分類綱在五種土壤中的相對豐度為98.04%(白茅土壤)~9.55%(光板地),差異較大.五種覆被類型下共檢測到26個屬分類單元,除熱裸單胞菌屬()屬于熱原體綱下的熱原體目(Thermoplasmatales)–Thermoplasmatales_ incertae_sedis外,其余古菌屬均屬于鹽桿菌綱下的鹽桿菌目(Halobacteriales)–鹽桿菌科(Halobacteriaceae),各古菌屬相對豐度具體情況如圖1所示,其中、鹽紅菌屬()、鹽盒菌屬()為優(yōu)勢菌群,光板地中古菌屬種類最多,羅布麻土壤次之,白茅土壤最少;未分類屬在5種土壤中的相對豐度為99.89%(白茅土壤)~79.43%(光板地).

經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),廣古菌門整體與土壤溫度、含水率和電導(dǎo)率呈正相關(guān)關(guān)系,與土壤全氮、堿解氮、速效磷和有機質(zhì)呈負(fù)相關(guān)關(guān)關(guān)系,其中甲烷微菌目(Methanomicrobiales)與土壤溫度的相關(guān)系數(shù)為0.959(<0.01),呈極顯正著相關(guān),說明該菌目對土壤溫度敏感,與土壤堿解氮的相關(guān)系數(shù)為-0.926(<0.05),呈顯著負(fù)相關(guān); 各古菌屬與土壤理化性質(zhì)的正負(fù)相關(guān)關(guān)系不完全相同,其中鹽堿團球菌屬()、鹽長命菌屬()、鹽紅菌屬、鹽棍菌屬()、富鹽菌屬()、鹽幾何菌屬()、鹽陸生菌屬()、鹽盒菌屬、鹽簡菌屬()與土壤電導(dǎo)率的相關(guān)系數(shù)分別為0.986、0.986、0.978、0.986、0.963、0.986、0.962、0.980、0.979(<0.01),均呈極顯著正相關(guān),說明這些稀有菌屬均為嗜鹽菌屬或耐鹽菌屬.泉古菌門整體與土壤溫度、電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與其余土壤理化性質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系,其中與土壤全氮的相關(guān)系數(shù)為0.900(< 0.05),為顯著正相關(guān).

RDA排序結(jié)果如圖2所示.第1軸序(Axis1)與第2軸序(Axis2)共可解釋86.64%的變量.土壤溫度、含水量、土壤電導(dǎo)率(含鹽量)與大部分古菌屬呈正相關(guān)關(guān)系;土壤全氮、堿解氮、速效磷、有機質(zhì)與大部分古菌屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.土壤溫度、電導(dǎo)率(含鹽量)、全氮、堿解氮、有機質(zhì)箭頭相對較長,可得這5種土壤理化性質(zhì)對土壤古菌屬群落結(jié)構(gòu)多樣性影響較大,且土壤溫度、電導(dǎo)率(含鹽量)對大部分古菌生長起促進作用,土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)反而會抑制大部分古菌的生長.

2.5 土壤古菌群落結(jié)構(gòu)比較

卡方數(shù)值越大,植被間古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性差異越大.從表3的卡方檢驗結(jié)果可知,土壤古菌群落結(jié)構(gòu)對鹽生植被演替表現(xiàn)出一定程度的響應(yīng),但各古菌屬未呈現(xiàn)統(tǒng)一的隨鹽生植被演替增加或減少的規(guī)律:光板地下的古菌群落結(jié)構(gòu)與有植被覆蓋的翅堿蓬、獐茅、白茅、羅布麻土壤下的均呈現(xiàn)不同程度的差異性,與屬輕鹽土壤的白茅土壤顯著性差異最大,與重鹽土壤(獐茅、白茅)次之,與屬輕鹽土壤的羅布麻土壤顯著性差異最小,且羅布麻土壤中除鹽堿團球菌屬外其他古菌屬的相對豐度皆比光板地中的極顯著增加;重鹽土壤(獐茅、白茅)下的古菌群落結(jié)構(gòu)整體與輕鹽土壤(白茅、羅布麻)下的呈現(xiàn)差異性,重鹽土壤(獐茅、白茅)整體土壤古菌屬與羅布麻土壤顯著性差異最大,且相對豐度均比羅布麻土壤中的極顯著減少;重鹽土壤(獐茅、白茅)之間,古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性差異較小;輕鹽土壤(白茅、羅布麻)之間,古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性呈現(xiàn)差異性,且白茅土壤中的大部分古菌相對豐度比羅布麻土壤中的極顯著減少.

表3 不同覆被類型下嗜鹽古菌屬卡方檢驗 Table 3 The halophiles chi-square test of different land cover at genus level

注: ** 為< 0.01極顯著差異,*為0.01￡< 0.05顯著差異;— 為不符合卡方檢驗要求.

3 討論

本研究中,廣古菌門在5種所研究的覆被下為優(yōu)勢菌群,泉古菌門相對豐度要小得多,這與以往利用分子生物學(xué)方法對鹽漬環(huán)境古菌樣品進行分析研究所獲得的結(jié)果相似.比如,Youssef等[16]采用16S rRNA方法對鹽漬沉積物進行研究,發(fā)現(xiàn)超過60%的古菌序列歸屬于廣古菌門的鹽桿菌綱.

廣古菌門中,除極少量甲烷微菌綱和熱源體綱,5種土壤中檢測到的26個古菌屬中有25個(96.15%)屬于鹽桿菌綱中的鹽桿菌目、鹽桿菌科,為嗜鹽古菌.嗜鹽古菌最顯著的特征是其需要獨特的生長環(huán)境:對高濃度NaCl依賴性強,至少需要1.5mol/L的NaCl才能生長,最適NaCl生長濃度為3.5~4.5mol/L[17].目前通過分離得到的嗜鹽古菌大多來自高鹽環(huán)境,如海洋、鹽(堿)湖、曬鹽場、高鹽濃度土壤、人工鹽制品等.Walsh等[18]采用16S rRNA方法對鹽泉島古菌多樣性進行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌占70%以上,并隨著鹽濃度的升高,多樣性增加.與Walsh研究結(jié)論相似,本文在土壤鹽分含量最高的光板地中,嗜鹽古菌多樣性和相對豐度均最高,其中21個屬(占光板地所含古菌屬總量的84%)屬于嗜鹽古菌;屬于輕鹽土壤的白茅土壤與其差異明顯,只有5個屬(占白茅土壤所含古菌屬總量的20%)屬于嗜鹽古菌;但同屬于輕鹽土壤的羅布麻土壤中含有20個屬(占羅布麻土壤所含古菌屬總量的80%)屬于嗜鹽古菌,僅次于光板地中的含量.輕鹽土壤中嗜鹽古菌含量較高的原因有待進一步研究,也許與其好氧(或兼性厭氧)及生長所需的復(fù)雜營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān).

由圖1可得,在5種土壤中相對豐度最高,鹽紅菌屬、鹽盒菌屬、鹽粒菌屬()、鹽微菌屬()、鹽盤菌屬()、鹽桿菌屬()、鹽棒菌屬()、、鹽堿單胞菌屬()相對豐度依次遞減,其余嗜鹽古菌相對豐度均不足1%.鹽紅菌屬為嗜鹽好氧古菌,棲息于鹽漬或超鹽漬土壤中[19];鹽堿單孢菌屬在鹽堿環(huán)境中廣泛存在[20],且生長需要異常高溫[21],表明該古菌生理學(xué)特征較為獨特.由表3可知,以上2個菌屬在4種土壤中均比光板地中極顯著減少,與其嗜鹽特性對應(yīng).鹽球菌屬()發(fā)現(xiàn)于阿拉伯灣鹽生植物鹽節(jié)木的根際中,該古菌有降解石油的功能[22],本實驗中只在羅布麻土壤中發(fā)現(xiàn),日后可深入研究并加以利用.

根據(jù)嗜鹽古菌能否生長的pH值條件,可將其分為中性嗜鹽古菌和嗜鹽嗜堿古菌2類,但目前對嗜鹽嗜堿古菌的研究十分有限.截止到目前發(fā)現(xiàn)的32個屬于嗜鹽古菌的屬中,有7個屬于嗜鹽嗜堿菌屬(鹽堿桿菌屬()、鹽堿球菌屬()、鹽堿單胞菌屬、鹽堿紅菌屬() 、鹽堿團球菌屬、鹽堿湖菌屬、鹽堿古菌屬()),在3個中性嗜鹽菌(鹽雙形菌屬()、鹽紅菌屬、鹽無色菌屬()中也有嗜鹽嗜堿菌的存在.本文中檢測到的嗜鹽嗜堿菌包括鹽堿團球菌屬、鹽堿古菌屬、鹽堿單胞菌屬和鹽盤菌屬,除鹽堿古菌屬在羅布麻土壤中含量最高,其余三者均在光板地中含量最高.目前嗜鹽嗜堿菌的分類主要依據(jù)16S rRNA序列的分析,隨著研究范圍的擴大、研究方法的改進,更多的嗜鹽嗜堿菌屬及其生理特性將得以發(fā)現(xiàn)和確認(rèn).

本文中5種覆被類型下泉古菌門比廣古菌門相對豐度小得多,且在泉古菌門中只檢測到熱變形菌綱的存在,與以往土壤古菌研究結(jié)果不同,這可能與黃河三角洲鹽堿土壤本身性質(zhì)及其中包含的其他微生物不適宜泉古菌門生長有關(guān).比如,袁超磊等[23]利用454高通量測序技術(shù)對湖南湘陰縣一典型紅壤剖面進行研究,發(fā)現(xiàn)古菌以泉古菌門中的熱變形菌綱(89%)為主,且其分布與土壤黏粒含量相關(guān).Nicol等[24]利用16S rRNA方法對亞馬遜4個不同地點的草地生態(tài)系統(tǒng)進行研究,發(fā)現(xiàn)檢測到的泉古菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過廣古菌;Jackson等[25]通過采用16S rRNA方法對森林泥炭土的剖面進行分析,發(fā)現(xiàn)表層土壤中(0~10cm)未檢測到古菌菌群,但深層土壤中(20~50cm)獲得了泉古菌序列,未檢測到廣古菌序列;Chen等[26]利用分子生物學(xué)方法在水稻土中發(fā)現(xiàn)根際的氨氧化古菌(屬于泉古菌門)數(shù)量高于非根際和未種植的水稻田,表明水稻根系一定程度上改變了泉古菌的數(shù)量且對其群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.本文中泉古菌門與土壤全氮呈顯著正相關(guān),可能與其在土壤中的氨氧化作用有關(guān)[27].

4 結(jié)論

4.1 植被覆蓋有利于降低土壤鹽化程度、增加土壤營養(yǎng)物質(zhì)含量,土壤速效磷隨鹽生植被正向演替有不斷升高的趨勢.

4.2 無植被覆蓋的光板地具有最高的古菌群落多樣性和豐富度,土壤古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性與鹽生植被演替順序的響應(yīng)不具有嚴(yán)格的一致性:當(dāng)植被處于相同演替階段時,土壤古菌群落結(jié)構(gòu)不具明顯的相似性;在不同演替階段時,土壤古菌群落結(jié)構(gòu)也未均表現(xiàn)出更大的差異性.

4.3 土壤理化性質(zhì)中的溫度、電導(dǎo)率(含鹽量)、全氮、堿解氮、有機質(zhì)對土壤古菌屬群落結(jié)構(gòu)多樣性影響較大.隨著鹽生植被正向演替,土壤溫度、電導(dǎo)率(含鹽量)對土壤古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性起促進作用,土壤全氮、堿解氮、有機質(zhì)起抑制作用.

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* 責(zé)任作者, 教授, guodufa@163.com

The response of soil archaeal community structure to halophyte vegetation succession in the Yellow River Delta

ZHANG Yue1, KONG Qiang1, GUO Du-fa1*, JIN Jian-ling2, JIANG Ai-xia1, GUO Jian3

(1.College of Geography and Enviroment, Shandong Normal University, Jinan 250014, China；2.College of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250100, China；3.Food Science and Engineering, Shandong Agricuture and Engineering University, Jinan 250100, China)., 2016,36(7)：2162~2168

This study attempted to investigate the soil archaeal community structure ofand other four kinds of halophyte vegetation (,,) in the Yellow River Delta by using high-throughput sequencing technology, and revealed its response to halophytic vegetation succession. The vegetation coverage would help to reduce the extent of soil salinization and increase the content of soil nutrients. The soil available phosphorus had a rising trend with the salt vegetation forward succession in- heavy salt soil(S,)- light salt soil(,). The soil archaeal community structure of the 5soil differed significantly,with no vegetation coverage had the highest soil archaeal community diversity and richness, andwas the advantage microflora. Soil archaeal community structure wasn’t consistent strictly with halophytic vegetation succession. The community structure of soil archaea didn’t have obvious similarity when the halophytic vegetation succession at the same stage. Most community structure of soil archaea had differences at different successional stages, while the differences were not all greater when at the different stage. With the salt vegetation forward succession, the soil temperature, electrical conductivity (salinity) and total nitrogen played catalytic roles to soil archaeal community structure diversity, while the soil available nitrogen and organic matter had inhibitory effects.

the Yellow River Delta；archaea community structure；high-throughput sequencing；halophytic vegetation

X53

A

1000-6923(2016)07-2162-07

張 玥(1990-),女,山東煙臺人,山東師范大學(xué)碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究.

2015-12-26

山東省自然科學(xué)基金項目(2012ZRB019DW);山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖?J15LE07)