海洋魚類和甲殼類抗菌肽的研究進展與應(yīng)用前景

彭　會，王克堅*

(1.海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，海洋與地球?qū)W院，廈門大學(xué)，福建 廈門 361102；

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海洋魚類和甲殼類抗菌肽的研究進展與應(yīng)用前景

彭會1，2，王克堅1，2*

(1.海洋生物制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，海洋與地球?qū)W院，廈門大學(xué)，福建 廈門 361102；

2.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361102)

抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與研究已有幾十年的歷史，抗菌肽是一類生物體中普遍存在并具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，被科學(xué)家譽為“天然抗生素”。海洋動物抗菌肽是魚、蝦、蟹、貝等海洋動物的非特異性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，在海洋環(huán)境中對于防御外源病原菌的入侵起到重要作用。海洋抗菌肽的研發(fā)與應(yīng)用，不僅具有重要的醫(yī)學(xué)開發(fā)價值，也是減少抗生素污染、實現(xiàn)海水健康養(yǎng)殖的重要保障。本文主要以魚類抗菌肽和甲殼類抗菌肽為例，從抗菌肽的來源與分類、結(jié)構(gòu)特點以及生物學(xué)活性等方面，簡要概述近年來海洋魚類和甲殼類抗菌肽的一些研究進展及其開發(fā)利用前景。

海洋動物；抗菌肽；魚類；甲殼動物；應(yīng)用前景

抗生素的長期過量使用，已經(jīng)導(dǎo)致許多病原生物對幾乎所有的抗生素藥物都具有不同程度的耐藥性，是目前影響我國畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展乃至人類健康的重大科技問題?？咕氖且活惿矬w中普遍存在并具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，已證實是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在防御病原微生物中起著重要作用，被科學(xué)家譽為“天然抗生素”。由于最初人們僅發(fā)現(xiàn)這類活性多肽對細菌的作用，所以命名為抗菌肽，后來隨著對抗菌肽的深入研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)抗菌肽具有多重生物學(xué)功能，除了廣譜抗細菌外，還具有抗病毒、真菌和寄生蟲等活性，以及具有抗腫瘤、中和毒素、趨化和免疫調(diào)節(jié)、促進血管生成和創(chuàng)傷修復(fù)等生物學(xué)功能[1-3]，因而又被稱為“抗微生物肽”?？咕牡目咕鷻C理普遍認為是通過膜裂解機制或非膜裂解機制抑殺細菌，不易產(chǎn)生微生物耐藥性，無有害殘留等問題，所以被視為抗生素的有效替代品，在醫(yī)藥、畜牧水產(chǎn)業(yè)等多個領(lǐng)域都具有重要的潛在應(yīng)用價值[4-5]。

抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與研究已有幾十年的歷史，最早在1972年，瑞典科學(xué)家Boman首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)一種可能的抗菌肽并闡明其免疫功能[6]。直至1981年，Steiner等在使用大腸桿菌感染惜古比天蠶蛾(Hyalophoracecropia)時分離獲得了第一個抗菌肽天蠶素，并測定獲得其氨基酸序列，才有了世界上第一個真正意義上分離鑒定的抗菌肽[7]。此后，越來越多的抗菌肽從細菌、真菌、動物和植物等多種物種中被鑒定出來。為了更好地對這些抗菌肽進行研究，各國學(xué)者建立了各種數(shù)據(jù)庫來搜集抗菌肽的信息，如APD數(shù)據(jù)庫、ANTIMIC數(shù)據(jù)庫、SAPD數(shù)據(jù)庫和AMSDb數(shù)據(jù)庫等，極大地方便了不同生物源抗菌肽的比較研究和新抗菌藥物的篩選。

1　研究進展與應(yīng)用實例

海洋擁有地球上約80%的生物資源，近年來國內(nèi)外學(xué)者高度認識到海洋生物中蘊藏著豐富的抗菌活性物質(zhì)，從海洋生物中研究開發(fā)具有抗耐藥性細菌的抗生素有效替代品將是未來醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、藥學(xué)等發(fā)展的必然方向。海洋生物抗菌肽的研發(fā)與應(yīng)用，不僅具有重要的醫(yī)學(xué)開發(fā)前景，而且還將是減少抗生素污染、實現(xiàn)海水健康養(yǎng)殖的重要保障。目前已從海洋動物中分離到多種多樣的抗菌肽，其中魚、蝦和蟹等種類的抗菌肽報道較多。

1.1魚類抗菌肽研究進展

魚類生活在富含各種微生物的水環(huán)境中，抗菌肽是在其受到損傷或者病原入侵時迅速防御和殺傷入侵物質(zhì)的重要的非特異性免疫因子，是魚類自身先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多樣。魚類抗菌肽按照生化和結(jié)構(gòu)特點，可將其分為4類：①不含半胱氨酸可以折疊成疏水或雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)，此種類型的抗菌肽由于富含一些堿性氨基酸和α螺旋結(jié)構(gòu)，有利于在細菌細胞膜形成穿孔，而產(chǎn)生直接的抗菌活性，包括Piscidins[8-10]，Pleurocidins[11-12]、Moronecidin[13-14]等；②含多個半胱氨酸，可以形成β折疊結(jié)構(gòu)，主要包括Hepcidin[15-19]，Cathelicidins[20-21]等；③源于組蛋白的抗菌肽，這類抗菌肽的氨基酸序列與組蛋白H2A和H2B等相似，如Parasin I[22-23]；④經(jīng)酰胺化或糖基化修飾的抗菌肽，這類抗菌肽經(jīng)高爾基體加工時，會在相關(guān)酶的作用下脫掉C端一個或多個氨基酸，或再與一些糖基結(jié)合，從而變成具有活性的成熟肽，如從鰻鱺皮膚分離出的一種糖基化的抗菌肽[24]。常見魚類抗菌肽的研究進展如表1所示。

表1　常見魚類抗菌肽列表

魚類抗菌肽hepcidin的研究：Hepcidin是一類富含半胱氨酸、具有二硫鍵結(jié)構(gòu)的抗菌肽。2000年，Krause等首先從人血液中分離純化出的一個由25個氨基酸組成的具有抗菌活性的新型抗菌肽，因其在肝臟中高表達，命名為LEAP-1(Liver expressed antimicrobial peptide)[25]。魚類抗菌肽hepcidin是Shike等于2002年首次從雜交斑紋鱸魚(Moronesaxatilis×Moronechrysops)的鰓中分離獲得了hepcidin的成熟肽片段[15]。此后發(fā)現(xiàn)hepcidin廣泛存在于多種魚類中。Hepcidin的基因序列和結(jié)構(gòu)高度保守，從多個物種中分離得到的hepcidin基因的分子結(jié)構(gòu)相似，基因均含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。Hepcidin蛋白結(jié)構(gòu)富含精氨酸、賴氨酸，由信號肽(Signal peptide)、前導(dǎo)肽(Prodomain)和成熟肽(Mature peptide)組成。Hepcidin的合成過程為首先形成一個包括信號肽和前導(dǎo)肽以及成熟肽的前多肽原(Pre-pro-peptide)，經(jīng)酶切去除信號肽后，由前導(dǎo)肽和成熟肽組成的前體肽(Pro-peptide)進入血液循環(huán)，最后通過前體肽轉(zhuǎn)化酶切割形成具有生物活性的成熟肽。多數(shù)hepcidin成熟肽含有8個半胱氨酸殘基，其位置在不同的生物中具有高度的保守性，可以形成4個二硫鍵，二硫鍵的連接方式為Cys1-Cys8、Cys3-Cys6、Cys2-Cys4和Cys5-Cys7。近年來在魚類中也發(fā)現(xiàn)了部分成熟肽含有4、5、6或7個半胱氨酸殘基的hepcidin。利用圓二色光譜和核磁共振譜等技術(shù)方法已經(jīng)證實人類、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)的hepcidin成熟肽在磷酸鹽緩沖液中通過4個二硫鍵形成了2個穩(wěn)定的β-折疊和1個Loop結(jié)構(gòu)，呈發(fā)卡形式[26-27]。

與人類及其他哺乳動物顯著不同，魚類hepcidin抗菌肽存在明顯的多基因變體現(xiàn)象，真鯛(Chrysophrysmajor)、鱸魚、黑鯛(Chrysophrysmajor)、尼羅羅非魚(OreochromisNiloticus)等hepcidin都存在2個以上的基因變體。如黑鯛有7個不同基因變體AS-hepc1-7，在正常狀態(tài)下的組織分布、細菌感染下的誘導(dǎo)表達模式及生物活性，在不同魚類和不同變體(如黑鯛的AS-hepc2和AS-hepc6)都存在較顯著的差異[16]，這種變體現(xiàn)象反映出魚類在復(fù)雜的海洋環(huán)境下可能需要多基因變體參與自身的免疫防御功能，預(yù)示抗菌肽hepcidin是海水養(yǎng)殖魚類普遍存在的重要免疫防御因子，為hepcidin抗菌肽的廣泛應(yīng)用提供了理論依據(jù)。同時發(fā)現(xiàn)這與已經(jīng)報道的人、鼠hepcidin基因的表達模式顯著不同，肝臟不是普遍認為的唯一的hepcidin基因高效表達的器官，而腎臟是另一個主要高表達的器官[17，28]。這些新的研究結(jié)果提示，不同魚類的hepcidin因其不同的生存環(huán)境可能采取不同的免疫機制。

魚類抗菌肽hepcidin的抗菌活性已被廣泛研究，無論是從體內(nèi)提取的hepcidin成熟肽、體外人工合成的hepcidin成熟肽，還是體外重組表達的hepcidin成熟肽或前體肽都具有廣譜抗菌活性?；瘜W(xué)合成的羅非魚hepcidin TH1-5對李斯特菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，TH2-3對海水弧菌和創(chuàng)傷弧菌均有一定的抗菌活性[29]。體外重組表達的牙鲆(Paralichthysolivaceus)hepcidin對被測的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等具有較好的抗菌活性[30]。人工合成的海水青鳉(Oryziasmelastigma)hepcidin成熟肽(OM-hep1)和原核表達前體肽(Pro-OMhep1)對革蘭氏陽性菌如谷氨酸棒桿菌和金黃色葡萄球菌，對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和施氏假單胞菌都具有較好的抗菌活性，對被測的弧菌無抗菌活性[31]。此外，魚類hepcidin除了具有抗菌活性外，還具有抗病毒和腫瘤的活性。人工合成的海水青鳉hepcidin成熟肽OM-hep1和重組表達的前體肽Pro-OMhep1都可以抑制蝦白斑綜合征病毒的復(fù)制，還可以抑制人類肝癌細胞的生長[31]；人工合成的羅非魚hepcidin TH1-5對HepG2、HeLa、HT1080等多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用[32]。魚類hepcidin抗菌、抗病毒、抗腫瘤功能及其免疫調(diào)節(jié)機制等的研究將為抗菌肽hepcidin的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1.2甲殼動物抗菌肽的研究進展

早在二十世紀六七十年代就發(fā)現(xiàn)甲殼動物血液和其他組織中含有抗菌活性物質(zhì)，但直至1996年，Schnapp等才從岸蟹(Carcinusmaenas)血淋巴細胞中分離獲得甲殼動物的第一個抗菌肽[33]，該抗菌肽富含脯氨酸，分子量6.5 kDa，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有抗菌活性。迄今為止已有300多條甲殼動物抗菌肽序列被報道，甲殼動物抗菌肽主要包括：①Penaeidins是一類N端富含脯氨酸/精氨酸功能域，C端富含六個半胱氨酸形成三個二硫鍵功能域的陽離子抗菌肽，Penaeidins除了具有抗菌功能，還可以結(jié)合幾丁質(zhì)[34-36]；②Crustin是一類富含半胱氨酸和C端具有WAP結(jié)構(gòu)域的陽離子抗菌肽，分子量大小7.0～14.0 kDa，具有抗菌抗病毒、抑制蛋白酶活性以及參與體液免疫調(diào)節(jié)等多種功能[37-39]；③ALF是一類包含兩個保守的半胱氨酸以及高度疏水的N末端的陽離子抗菌肽，分子量大小約11.0 kDa，具有廣譜抗菌抗病毒活性[40-43]；④除上述3類抗菌肽外，甲殼動物中還發(fā)現(xiàn)了許多有抗菌功能的小肽，如雄性性腺高表達的抗菌肽Scygonadin[44-46]和SCY2[47]、對蝦血藍蛋白的裂解片段[48]、對蝦組蛋白的裂解片段[49]、青蟹組蛋白片段Sphistin[50]、蟹類抗菌肽Arasin[51]和Hyastatin[52]等。甲殼動物抗菌肽大部分屬于小分子多肽，主要來源于甲殼綱的蝦、蟹等。常見的蝦蟹類抗菌肽研究進展如表2所示。

表2　常見蝦蟹類抗菌肽列表

雄性性腺高表達的抗菌肽Scygonadin和SCY2的研究：青蟹是我國南方最重要的海水養(yǎng)殖蟹類品種，近些年來，隨著青蟹養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，多種病害頻繁發(fā)生引起養(yǎng)殖青蟹大量死亡，嚴重影響了我國青蟹養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。青蟹以先天性免疫為主，抗菌肽是先天性免疫系統(tǒng)中重要免疫因子，對抵抗病原微生物感染具有重要作用。迄今，大多數(shù)抗菌肽來源于血液、皮膚和黏液，而從動物生殖系統(tǒng)中分離、鑒定甚少。廈門大學(xué)2006年首次報道了在鋸緣青蟹[后經(jīng)鑒定我國的鋸緣青蟹(Scyllaserrata)應(yīng)為擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)]的精漿中分離獲得了一個新型抗菌肽，命名為Scygonadin。Scygonadin基因主要在成熟的雄性鋸緣青蟹的射精管中高效表達，是迄今為止在甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的一種與生殖免疫相關(guān)的陰離子抗菌肽，具有抗菌、抗病毒活性，Scygonadin的發(fā)現(xiàn)豐富了甲殼動物抗菌肽理論[44-46]。SCY2是課題組近些年來在青蟹中發(fā)現(xiàn)的又一種新型陰離子抗菌肽，與Scygonadin基因的序列相似性為65%，分子質(zhì)量約為10.0 kDa，等電點為4.84，是一種陰離子抗菌肽。SCY2基因主要在雄性青蟹射精管中高表達，其它組織以及雌性青蟹體內(nèi)的多器官和組織只有微弱表達；并發(fā)現(xiàn)該抗菌肽基因在胚胎發(fā)育Ⅱ期表達量相對較高，在其它幾個時期較低。進一步研究發(fā)現(xiàn)LPS、細菌及真菌感染等不能誘導(dǎo)SCY2表達，但在交配誘導(dǎo)條件下青蟹抗菌肽SCY2有顯著的誘導(dǎo)表達變化，結(jié)合SCY2隨青蟹發(fā)育的季節(jié)性表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)SCY2的誘導(dǎo)表達模式與青蟹的性成熟規(guī)律一致，推測激素水平變化與SCY2的表達相關(guān)；進一步研究了激素誘導(dǎo)下青蟹抗菌肽SCY2的表達模式，闡明SCY2的表達模式是交配誘導(dǎo)表達，說明其表達特性與生殖免疫功能相關(guān)。體外抗菌活性試驗表明其主要抗革蘭氏陽性菌，而體內(nèi)的抗菌活性試驗發(fā)現(xiàn)，海洋動物致病菌副溶血弧菌與SCY2共孵后再注射擬穴青蟹，青蟹的存活率在16 h后仍有23.0%，而對照組青蟹的存活率僅6.7%，說明SCY2蛋白在青蟹抵御病原微生物過程中可發(fā)揮重要的免疫作用[47]?？咕腟cygonadin和SCY2的研究將為維護青蟹親體和胚胎健康、解決我國青蟹人工育苗中的關(guān)鍵科學(xué)問題等提供科學(xué)依據(jù)。

2　應(yīng)用前景

抗菌肽具有極大的潛在應(yīng)用價值，已成為醫(yī)藥、食品、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域的研究熱點，隨著對抗菌肽的開發(fā)利用研究，抗菌肽最終將會實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，歐美等經(jīng)濟和技術(shù)較發(fā)達的國家走在前列，已經(jīng)有多家公司和機構(gòu)致力于抗菌肽類新藥物的研究和開發(fā)。抗菌肽可與傳統(tǒng)的抗生素聯(lián)合使用，也可作為單獨的抗菌劑使用，其臨床應(yīng)用潛力很大。恩夫韋地(Enfuvirtide)已于2003年批準上市，用于成人和6歲以上兒童的抗艾滋病治療藥物。目前已有十余種通過美國食品與藥品管理局審批上市的抗菌肽類藥物[53]，多數(shù)抗菌肽藥物限于局部的抗感染治療。國外主要是針對抗菌肽的醫(yī)用醫(yī)藥價值開展研究，而針對畜牧及水產(chǎn)業(yè)等的應(yīng)用報道較少，尤其是源于海洋生物的抗菌肽基因工程產(chǎn)品迄今未有臨床試驗與應(yīng)用的報道。

抗菌肽不僅可以作為藥物治療細菌感染和癌癥等疾病，同時也被作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中，為促進畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了貢獻。目前國內(nèi)關(guān)于天蠶素類的抗菌肽作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的報道較多[54-55]，而利用來自海洋動物抗菌肽作為飼料添加劑及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用報道相對較少。廈門大學(xué)海洋動物抗菌肽研發(fā)團隊，自2002年以來，針對我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈中存在的抗生素污染等重大生產(chǎn)問題，以研發(fā)可替代某些抗生素或降低抗生素用量的環(huán)保型抗菌肽飼料、抗菌肽防腐劑等為目標，在我國率先開展了海洋魚類和蟹類新型抗菌肽的研究。其所研制的海洋動物抗菌肽基因工程產(chǎn)品經(jīng)國家權(quán)威資質(zhì)部門的檢測以及通過在海水養(yǎng)殖場幾年的中試試驗，證明安全有效。2015年已獲得我國首個農(nóng)業(yè)部批準的大黃魚抗菌肽生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書，預(yù)示著源于海洋動物的抗菌肽基因工程產(chǎn)品可以在我國畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)乃至醫(yī)藥業(yè)等進行開發(fā)應(yīng)用。

海洋動物抗菌肽的研發(fā)與應(yīng)用，不僅具有重要的醫(yī)學(xué)開發(fā)前景，也可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，保障其健康發(fā)展和水產(chǎn)品安全。海洋動物抗菌肽基因工程產(chǎn)品的開發(fā)利用預(yù)期產(chǎn)業(yè)化前景廣闊。

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Study and application of antimicrobial peptides from marinefish and crustacean

PENG Hui1，2，WANG Kejian1，2*

(1.State-Province Joint Engineering Laboratory of Marine Bioproducts and Technology，College of Ocean and Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China；2.Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources，Xiamen 361102，China)

Antimicrobial peptides are a group of small peptides with broad-spectrum antimicrobial activities，which have been studied for several decades.Antimicrobial peptides are thought to be “natural antibiotics”.Marine antimicrobial peptides are considered to be one of the important components of innate immune defense system in fish，shrimp，crab，shellfish and other marine animals.Marine antimicrobial peptides play an important role in the defense of exogenous pathogens in the marine environment.The development and application of marine antimicrobial peptides not only has an important prospect of medical development，but also is an important safeguard to reduce antibiotic contamination and achieve the healthy breeding of marine animals.Here we make a brief introduction of the research and application prospects of antimicrobial peptides from marine fish and crustacean，and the source and classification of antimicrobial peptides，structural characteristics and biological activity will be clarified.

marine animals；antimicrobial peptides；fish；crustacean；application prospect

2016-04-21

福建省高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項目計劃(2013N5010)；福建省產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新技術(shù)重大研發(fā)平臺項目(2014N2004)；廈門南方海洋研究中心項目(13GZP001NF06).

彭會(1980-)，女，工程師，博士，研究方向：海洋生物技術(shù).E-mail：penghui@xmu.edu.cn

王克堅(1964-)，男，閩江學(xué)者特聘教授，博士，研究方向：海洋生物技術(shù)、海洋生物分子生物學(xué)與免疫毒理學(xué).E-mail：wkjian@xmu.edu.cn

R931.77

A

1006-5601(2016)03-0254-09

彭會，王克堅.海洋魚類和甲殼類抗菌肽的研究進展與應(yīng)用前景[J].漁業(yè)研究，2016，38(3)：254-262.