青蒿素減輕LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞屏障功能損傷的實驗研究

孫俊波， 趙 璐， 史素琴， 寇振媛， 劉愛娟， 付婷婷

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南省中醫(yī)院，河南鄭州450002;2河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南鄭州450008;3河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450000)

青蒿素減輕LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞屏障功能損傷的實驗研究

孫俊波1， 趙 璐2△， 史素琴3， 寇振媛1， 劉愛娟2， 付婷婷2

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南省中醫(yī)院，河南鄭州450002;2河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南鄭州450008;3河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450000)

目的:探究青蒿素對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的大鼠腸上皮IEC-6細(xì)胞屏障功能損傷的影響。方法:體外培養(yǎng)IEC-6細(xì)胞，隨機(jī)分為5組:對照組、LPS(100 mg/L)組和LPS+青蒿素(30、50和100 μmol/L)組，MTT法檢測各組細(xì)胞毒性變化，ELISA檢測各組細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的變化，電阻儀檢測腸上皮細(xì)胞跨上皮電阻(TER)，酶標(biāo)儀檢測單層細(xì)胞對辣根過氧化物酶(HRP)的通透性，RT-qPCR和Western blot檢測各組細(xì)胞緊密連接蛋白(ZO-1、claudin-1和occludin)以及TLR4/MyD88/NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果:LPS與青蒿素在本實驗濃度范圍對IEC-6細(xì)胞均無毒性。與對照組相比，LPS處理下，細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/MyD88/NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表達(dá)降低。而青蒿素干預(yù)下，細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及TLR4/MyD88/NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA和蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)，均呈現(xiàn)濃度依賴性。結(jié)論:青蒿素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞屏障功能損傷。

青蒿素;脂多糖;腸上皮細(xì)胞

腸道屏障是機(jī)體最重要的免疫防御屏障，它能夠阻止腸道感染并預(yù)防炎癥的發(fā)生。腸黏膜上皮屏障功能受到損害時，腸腔內(nèi)細(xì)菌等致病性抗原通過受損的腸上皮細(xì)胞侵入腸道［1-2］，從而引發(fā)全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)以及多器官功能障礙［3］。腸上皮屏障具有的選擇性通透性，是上皮對腸腔內(nèi)物質(zhì)通過跨細(xì)胞或旁細(xì)胞途徑跨過的能力，其中緊密連接(tight junction，TJ)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，與旁細(xì)胞的通透性密切相關(guān)，而腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)上皮屏障功能損傷［4］。青蒿素(artemisinin，Art)是從菊科植物黃花蒿(Artemisia annua)葉中提取分離出的主要藥用成分，有研究表明，青蒿素除了具有抗瘧作用外，還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用［5］。因此，本文應(yīng)用細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞建立體外腸上皮細(xì)胞功能損傷模型，觀察青蒿素對腸上皮細(xì)胞屏障通透性、細(xì)胞炎性因子的水平以及緊密連接蛋白表達(dá)的影響，并探討青蒿素對腸上皮細(xì)胞功能保護(hù)作用的機(jī)制。

材料和方法

1 材料

青蒿素(河南中醫(yī)藥大學(xué)提供);大鼠小腸上皮IEC-6細(xì)胞(ATCC CRL-1592TM)，DMEM培養(yǎng)基，雙抗(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，胎牛血清(Gemini);MTT，二甲基亞砜(DMSO)，鼠抗ZO-1、claudin-1、occludin、MyD88和NF-κB p65多克隆抗體，β-actin鼠抗單克隆抗體(Abcam);羊抗鼠II抗，測定TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒，BCA試劑盒(北京中杉生物有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與單層上皮模型的建立 IEC-6細(xì)胞用pH 7.4的DMEM培養(yǎng)液(含雙抗、10%胎牛血清)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至約80%融合時，用0.25%胰蛋白酶、0.53 mmol/L EDTA液消化細(xì)胞，按1∶3的比例傳代。參照文獻(xiàn)［6］方法建立單層上皮模型，將IEC-6細(xì)胞以5×104/L接種于24孔板Transwell聚碳酸酯膜上常規(guī)培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)基，并用Millicell ERS電阻測定儀測定跨上皮細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistance，TER)以監(jiān)測細(xì)胞單層形成情況，待TER穩(wěn)定后，說明體外腸上皮單層細(xì)胞模型建立成功。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性 將IEC-6細(xì)胞以1× 104/L接種于96孔板，分為對照組、LPS(100 mg/L)組、青蒿素(100 μmol/L)組和LPS+不同濃度(30、50和100 μmol/L)青蒿素組，按分組處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT溶液孵育4 h，棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度值(A490)。

2.3 ELISA檢測細(xì)胞炎性因子水平 將IEC-6細(xì)胞以5×105/L接種于12孔板，分為對照組、LPS(100 mg/L)組和LPS+不同濃度(30、50和100 μmol/L)青蒿素組，按分組處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測各組TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

2.4 腸上皮細(xì)胞TER的測定 將IEC-6細(xì)胞以5× 105/L接種于Transwell小室，Millicell ERS電阻測定儀測定TER值，待數(shù)值穩(wěn)定后，按上述分組方法處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，分別檢測處理前后的TER值，測得TER值減去空白對照后記錄為每組電阻值。每組做3復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.5 單層細(xì)胞通透性的測定 測量大分子物質(zhì)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)通過單層細(xì)胞的速率，以觀察細(xì)胞通透性的改變。IEC-6細(xì)胞以5×105/L接種于Transwell小室，將HRP(終濃度3.4×10－6mol/L)加入Transwell小室的上室培養(yǎng)液中，按上述分組處理細(xì)胞培養(yǎng)24 h，于上室和下室各取2 μL培養(yǎng)基，置于96孔板內(nèi)，加入TMB顯色液，酶標(biāo)儀370 nm處檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HRP濃度。

2.6 Western blot檢測蛋白的表達(dá) 將IEC-6細(xì)胞按上述分組處理，培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，煮沸5 min變性后，進(jìn)行SDSPAGE電泳，上樣量為80 μg。然后以150 mA 3 h轉(zhuǎn)PVDF膜。3%脫脂奶粉封閉抗原1 h后，加入ZO-1 (1∶500)、claudin-1(1∶500)、occludin(1∶500)、TLR4 (1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000) 和β-actin(1∶1 000)等I抗孵育，4℃過夜，用TBST洗膜，每次5 min，共3次。加入II抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，每次5 min，共3次，加入ECL顯色液曝光顯影。

2.7 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá) 將IEC-6細(xì)胞按上述分組處理，培養(yǎng)24 h后，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，并檢測其純度以及完整性。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依據(jù)2－ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達(dá)量。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)處理計量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 青蒿素與LPS對IEC-6細(xì)胞均無毒性作用

MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS和青蒿素單獨處理的IEC-6細(xì)胞活性無明顯變化，青蒿素對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活性無顯著影響(圖1)。這表明LPS與青蒿素處理(在本實驗濃度范圍)對IEC-6細(xì)胞活性均無明顯抑制作用。

Figure 1.The viability of IEC-6 cells after treatment with LPS and artemisinin(Art).Mean±SD.n=3.圖1 LPS和不同濃度青蒿素作用對細(xì)胞活力的影響

2 青蒿素降低LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎性因子水平

ELISA結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯升高，而青蒿素降低了LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)，見圖2。

Figure 2.The releases of inflammatory cytokines in the culture supernatant of IEC-6 cells after treatment with LPS and artemisinin(Art).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖2 LPS和不同濃度青蒿素對炎性因子水平的影響

3 青蒿素降低LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞屏障通透性升高

與對照組相比，LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞TER值明顯降低，而青蒿素顯著提高LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞TER值。另外，與對照組相比，LPS提高單層細(xì)胞對HRP的通透性，而青蒿素顯著降低LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞對HRP的通透性升高，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，見圖3。

4 青蒿素降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞緊密連接蛋白的水平

Western blot和 RT-qPCR結(jié)果表明，LPS降低IEC-6細(xì)胞ZO-1、claudin-1和occludin的表達(dá)水平，而青蒿素顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞ZO-1、claudin-1和occludin的表達(dá)降低，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，見圖4。

5 青蒿素下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB表達(dá)

Western blot和 RT-PCR結(jié)果證明，LPS上調(diào)IEC-6細(xì)胞TLR4、MyD88和NF-κB p65的表達(dá)，而青蒿素顯著降低LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞MyD88和NF-κB p65的表達(dá)升高，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，見圖5。

Figure 3.The effects of LPS and artemisinin(Art)on the permeability of IEC-6 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖3 LPS和不同濃度青蒿素對細(xì)胞通透性的影響

討論

腸黏膜屏障主要由腸黏膜基底膜、上皮細(xì)胞層及其表面的黏液層所構(gòu)成，腸上皮細(xì)胞是腸黏膜屏障的主要組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［7］。目前已有研究表明在炎性結(jié)腸炎、重癥胰腺炎、暴發(fā)性肝衰竭等疾病引起的腸黏膜屏障損傷中，均存在腸上皮細(xì)胞細(xì)胞功能的破壞［8-9］。LPS是革蘭氏陰性菌的致病因子，它直接接觸腸黏膜上皮細(xì)胞時，可通過阻斷緊密連接蛋白的磷酸化和去磷酸化過程，導(dǎo)致腸黏膜上皮的通透性增加和腸黏膜功能損傷［10］。本文采用青蒿素干預(yù)LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞功能損傷，討論青蒿素對腸上皮細(xì)胞通透性等功能的保護(hù)作用。實驗結(jié)果證明，LPS與青蒿素(在本實驗濃度范圍)對IEC-6細(xì)胞均無毒性，可進(jìn)行進(jìn)一步研究。

Figure 4.The expression of ZO-1，claudin-1 and occludin after treatment with LPS and artemisinin(Art).A:protein expression;B: mRNA expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖4 LPS和不同濃度青蒿素對ZO-1、claudin-1和occludin表達(dá)的影響

青蒿素是從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧化基團(tuán)結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，主要衍生物包括雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。近年來，越來越多的研究表明，青蒿素及其衍生物具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤以及抗炎的活性［5］。蒿甲醚和青蒿琥酯均能抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的水平［11-12］。本研究結(jié)果顯示，青蒿素能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

Figure 5.The expression of TLR4，MyD88 and NF-κB p65 after treatment with LPS and artemisinin(Art).A:protein expression; B:mRNA expression.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖5 LPS和不同濃度青蒿素對TLR4、MyD88和NF-κB p65表達(dá)的影響

單層細(xì)胞的TER值是反映腸黏膜屏障通透性的主要指標(biāo)之一，與細(xì)胞單層通透性呈負(fù)相關(guān)。TER值的減小提示緊密連接結(jié)構(gòu)受到破壞，HRP通過受損的細(xì)胞間空隙漏入下室增多，腸道通透性增加［13］。本研究中，細(xì)胞TER值的減小與細(xì)胞對HRP通透性的增加都表明LPS破壞了腸上皮細(xì)胞通透性，而青蒿素顯著增加受損細(xì)胞的TER值并降低細(xì)胞對HRP通透性。緊密連接區(qū)域的特異性蛋白包括跨膜蛋白o(hù)ccludin、膜蛋白ZO-1以及claudin蛋白家族等，其中occludin蛋白是一種跨膜蛋白，位于細(xì)胞間緊密連接的縫隙處，在調(diào)控細(xì)胞間的通透性和信號傳導(dǎo)方面有重要意義。這些緊密連接蛋白表達(dá)下調(diào)時，緊密連接結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，造成細(xì)胞多種功能受損［14］。有研究證明，茶黃素、大黃素等中藥成分能夠上調(diào)Caco-2細(xì)胞中occludin、claudin-1和ZO-1蛋白的水平，減輕Caco-2細(xì)胞通透性等功能損傷［14-15］。本研究結(jié)果同樣證明，LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中occludin、claudin-1和ZO-1表達(dá)降低，而青蒿素上調(diào)這些蛋白的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是模式識別受體的一種，在機(jī)體免疫與炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LPS通過TLR4通路誘導(dǎo)幼年動物的腸道屏障功能損傷［16］，MyD88和NF-κB作為TLR4信號通路的下游因子，在炎癥損傷中均有重要作用。有研究證明，青蒿琥酯顯著降低LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2炎性因子水平，其中TLR4/MyD88/NF-κB通路發(fā)揮重要的作用［12］。本研究表明，青蒿素顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB的激活，由此，青蒿素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活，從而發(fā)揮對腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，本文利用青蒿素干預(yù)LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞屏障功能損傷，發(fā)現(xiàn)青蒿素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路降低腸上皮細(xì)胞通透性，并上調(diào)細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)為青蒿素治療細(xì)胞屏障功能損傷相關(guān)疾病提供了新的理論基礎(chǔ)，但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:林白霜，羅 森)

Artemisinin attenuates intestinal epithelial barrier damage induced by LPS

SUN Jun-bo1，ZHAO Lu2，SHI Su-qin3，KOU Zhen-yuan1，LIU Ai-juan2，F(xiàn)U Ting-ting2

(1Henan Province Hospital of TCM，The Second Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450002，China;2The Third Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China;3The First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China.E-mail:junbosun@163.com)

AIM:To investigate the effect of artemisinin on lipopolysaccharide(LPS)-induced intestinal epithelial barrier damage in IEC-6 cells and its molecular mechanism.METHODS:Cultured IEC-6 cells were divided to 5 groups:control group，LPS(100 mg/L)group and LPS+Artemisinin(30，50 and 100 μmol/L)groups.The cytotoxicity was detected by MTT assay.The releases of TNF-α，IL-1β and IL-6 in the IEC-6 cells were measured by ELISA.The transepithelial electrical resistance(TER)was detected by electrical resistance tester，and the horseradish peroxidase (HRP)flux permeability were analyzed by a microplate reader.The expression of tight junction proteins，ZO-1，claudin-1 and occludin，and the expression of TLR4/MyD88/NF-κB at mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot.RESULTS:Artemisinin alone(up to 100 μmol/L)or in combination with LPS(100 mg/L)was not toxic to IEC-6 cells.Compared with control group，the releases of TNF-α，IL-1β and IL-6 in the culture supernatant of IEC-6 cells significantly increased after treatment with LPS.The expression of TLR4/MyD88/NF-κB was activated by LPS.LPS down-regulated the protein expression of ZO-1，claudin-1 and occludin.However，artemisinin treatment decreased the releases of TNF-α，IL-1β and IL-6 in the culture supernatant of IEC-6 cells.The expression of TLR4/MyD88/NF-κB at mRNA and protein levels was gradually reduced after treatment with artemisinin.In addition，artemisinin upregulated the protein expression of ZO-1，claudin-1 and occludin significantly(P＜0.01)in a dose-dependent manner.CONCLUSION: Artemisinin attenuates LPS-induced intestinal epithelial barrier damage by inhibiting TLR4/MyD88/NF-κB activation in the IEC-6 cells.

Artemisinin;Lipopolysaccharides;Intestinal epithelial cells

R574;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.021

1000-4718(2016)07-1285-06

2016-02-19

2016-04-07

△Tel:0371-60908899;E-mail:junbosun@163.com