慢病毒介導(dǎo)的GHSR1a shRNA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響*

劉 岸， 黃成鋼， 徐 佳

(岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院胃腸外科，湖南岳陽(yáng)414000)

慢病毒介導(dǎo)的GHSR1a shRNA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響*

劉 岸△， 黃成鋼， 徐 佳

(岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院胃腸外科，湖南岳陽(yáng)414000)

目的:構(gòu)建生長(zhǎng)激素促泌素受體1a(growth hormone secretagogue receptor 1a，GHSR1a)基因短發(fā)夾干擾RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒載體，感染人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480，觀察沉默GHSR1a基因?qū)W480細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法:構(gòu)建特異性靶向GHSR1a基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體和陰性對(duì)照序列慢病毒載體;建立穩(wěn)定表達(dá)GHSR1a shRNA的SW480細(xì)胞、陰性對(duì)照細(xì)胞(NC)及空白對(duì)照細(xì)胞(BC)，RTPCR檢測(cè)GHSR1a的mRNA在細(xì)胞中的表達(dá);通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中GHSR1a、ghrelin、PTEN、p-AKT及p53蛋白的水平;CCK-8法測(cè)定GHSR1a shRNA對(duì)SW480細(xì)胞活力的影響;建立裸鼠結(jié)直腸癌皮下移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠并測(cè)量各組裸鼠腫瘤重量;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中Ki-67和PTEN的陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果:在體外實(shí)驗(yàn)中，GHSR1a在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株Caco-2及SW480中的表達(dá)明顯高于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460的表達(dá);成功建立了穩(wěn)定表達(dá)GHSR1a shRNA的SW480細(xì)胞;GHSR1a shRNA能明顯抑制SW480細(xì)胞GHSR1a mRNA及蛋白的表達(dá);沉默GHSR1a基因后SW480細(xì)胞活力明顯減弱;與NC組相比較，GHSR1a shRNA組細(xì)胞中PTEN mRNA及蛋白水平上調(diào)，AKT磷酸化被抑制，p53的表達(dá)明顯增加;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與NC組相比較，GHSR1a shRNA組裸鼠結(jié)直腸癌皮下移植瘤重量明顯減輕，同時(shí)Ki-67表達(dá)下調(diào)，PTEN表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的GHSR1a shRNA對(duì)體內(nèi)、外人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，該作用可能通過(guò)上調(diào)PTEN及其下游PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)。

結(jié)直腸癌;Ghrelin;生長(zhǎng)激素促泌素受體1a;PTEN

Ghrelin作為一種主要由胃腸道黏膜細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體，其在控制胃酸分泌、進(jìn)食和新陳代謝等生理和病理生理活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用［1-2］。研究表明，ghrelin基于生長(zhǎng)激素促泌素受體(growth hormone secretagogue receptors，GHSRs)而發(fā)揮調(diào)控作用，目前已知的GHSRs有GHSR1a和GHSR1b兩個(gè)亞型，GHSR1a主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和單核細(xì)胞中［3-4］。近年來(lái)報(bào)道稱ghrelin/GHSRs生物學(xué)軸不僅調(diào)控正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，同時(shí)與食管癌［5］、胃癌［6］和肺癌［7］等多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切。Waseem等［8］報(bào)道使用GHSR1a拮抗劑可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲，但GHSR1a在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。為此，本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建靶向GHSR1a基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，感染至人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中，觀察沉默GHSR1a基因?qū)w內(nèi)外結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含EDTA胰酶和高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;TRIzol試劑、Lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)基和抗生素殺稻瘟菌素S購(gòu)自Invitrogen;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自Fermentas;RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKa-Ra;慢病毒載體系統(tǒng)pLenR-GPH vector由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司提供;限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB;質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen;GHSR1a、PTEN和GAPDH的上、下游引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;聚凝胺購(gòu)自Sigma;CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG及ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;化學(xué)發(fā)光試劑和Ki-67鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;GHSR1a兔抗人多克隆抗體、ghrelin小鼠抗人單克隆抗體、PTEN兔抗人多克隆抗體、p-AKT兔抗人多克隆抗體、p53兔抗人單克隆抗體和β-actin小鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Epitomics。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人胚腎細(xì)胞株HEK-293T、人直腸癌高分化腺癌細(xì)胞株Caco-2、低分化腺癌細(xì)胞株SW480和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460均購(gòu)自ATCC，所有細(xì)胞均培育于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和1%谷氨酸鹽，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合成80%～90%時(shí)以胰蛋白酶消化并傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。24只4～5周齡雌性BALB/c-nu/nu品系裸鼠購(gòu)自北京維通利華公司，體重(18.4±0.7)g，生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(京) 2012-0001，飼養(yǎng)于湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 設(shè)計(jì)干擾序列及陰性對(duì)照序列 針對(duì)已經(jīng)公布的GHSR1a基因序列(NM-198407)，設(shè)計(jì)針對(duì)人GHSR1a基因的干擾 RNA序列(GHSR1a shRNA)，正義鏈序列為 5'-TGAGAAAGCTCTCCACTCTGTTCAAGAGACAGAGTGGAGAGCTTTCTCTTTTTTC-3'，反義鏈序列為5'-ACTCTTTCGAGAGGTGAGACAAGTTCTCTGTCTCACCTCTCGAAAGAGAAAAAAGAGCT-3'。同時(shí)設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照(negative control，NC)序列(NC shRNA)，正義鏈序列為5'-TAACTAGTAACGGCTGCTCCTTCAAGAGAGGAGCAGCCGTTACTAGTTTTTTTTC-3'，反義鏈序列為 5'-ATTGATCATTGCCGACGAGGAAGTTCTCTCCTCGTCGGCAATGATCAAAAAAAAGAGCT-3'，并通過(guò)BLAST檢索驗(yàn)證該序列不對(duì)任何基因起干擾效應(yīng)。所有shRNA由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

3.2 構(gòu)建和鑒定慢病毒表達(dá)載體 在干擾RNA序列正義鏈及反義鏈的5'端分別加上AgeⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切空載體PLLU2G與稀釋和退火(退火反應(yīng)條件為95℃10 min，75℃10 min，55℃10 min，35℃10 min，15℃ 10 min)后的 GHSR1a shRNA及 NC shRNA在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)染新鮮大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α并挑選陽(yáng)性重組克隆，經(jīng)北京華大基因研究中心測(cè)序檢測(cè)證實(shí)與GHSR1a cDNA序列一致。

3.3 HEK-293T細(xì)胞感染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293T細(xì)胞，將5×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)液，加入5 mL Opti-MEM培養(yǎng)液。在一支離心管中加入20 μg重組干擾質(zhì)粒pLenR-GPH(表達(dá)綠色熒光蛋白)或20 μg陰性對(duì)照質(zhì)粒，分別加入Opti-MEM培養(yǎng)液中并混勻，調(diào)整溶液體積為2.5 mL。在另一支離心管中加入100μL Lipofectamine 2000，加入2.4 mL Opti-MEM培養(yǎng)液混勻，將上述質(zhì)粒溶液和Lipofectamine 2000稀釋液混合并制備成質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物，置室溫20 min。將3 mL質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)移至HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿培養(yǎng)8 h，更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，離心并過(guò)濾后分裝，使用逐孔稀釋滴度測(cè)定法測(cè)定病毒滴度后保存于－80℃。

3.4 慢病毒感染SW480細(xì)胞 將SW480細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為空白對(duì)照(blank control，BC)組、陰性對(duì)照(negative control，NC)組和GHSR1a shRNA感染組，NC組和GHSR1a shRNA感染組細(xì)胞中分別加入含8 mg/L聚凝胺的2種稀釋后病毒液1 mL，病毒液感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為5，將病毒液感染細(xì)胞12 h后棄去培養(yǎng)基，并加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白熒光的慢病毒感染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率。將感染后SW480細(xì)胞加入含殺稻瘟菌素(8 μg/L)的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，2周后可見(jiàn)抗性克隆長(zhǎng)出，取單細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，1個(gè)月后可獲得穩(wěn)定抑制GHSR1a表達(dá)的SW480細(xì)胞。

3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將感染后培養(yǎng)24 h 的SW480細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁添加或不添加ghrelin(1 000 nmol/L)后放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組(不加細(xì)胞，加入等量的PBS)。培養(yǎng)結(jié)束前1 h，各孔加入CCK-8溶液0.01 mL后繼續(xù)培養(yǎng)1 h，選擇酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 nm，測(cè)量吸光度值(A490)。細(xì)胞存活率 (%)=(實(shí)驗(yàn)組A490值－空白調(diào)零組A490值)/(空白對(duì)照組A490值－空白調(diào)零組A490值)×100%。

3.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中GHSR1a蛋白的表達(dá)依照細(xì)胞蛋白提取試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Caco-2、SW480和NCM460細(xì)胞蛋白質(zhì)。經(jīng)Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取30 μg樣品，加入上樣緩沖液混勻后置于100℃水浴中孵育8 min。以8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干電轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉于4℃下孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)I抗，于4℃下孵育過(guò)夜，取出洗膜后，再分別加入用封閉液稀釋為1∶2 000的 II抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG)室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑后經(jīng)X線膠片曝光、顯影和定影。使用Quantity One 4.6.2(Bio-Rad)軟件掃描膠片，分析各蛋白條帶灰度值，以GHSR1a蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示GHSR1a蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3.7 RT-PCR檢測(cè)SW480細(xì)胞中GHSR1a和PTEN 的mRNA表達(dá) 用TRIzol試劑提取總RNA，按說(shuō)明書(shū)操作。總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm與280 nm處光密度比值(A260/A280)為1.9～2.1。每份樣品中取3 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后取1 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用引物設(shè)計(jì)軟件primer3設(shè)計(jì)特異性引物。GHSR1a的上游引物為5'-GGAGTTCATTCAGATGGGAAGAC-3'，下游引物為5'-TTCACCGCATCGAAGACCGA-3'(產(chǎn)物為287 bp); PTEN的上游引物為5'-CGCCCGAATTCAGATGGGAGCAA-3'，下 游 引 物 為 5'-TCGACCGCATC GAAAGACCA-3'(產(chǎn)物為235 bp);GAPDH的上游引物為5'-GTGGC ATCCACGAAACTAC-3'，下游引物為5'-GGACTCGTCATACTCCTGCT-3'(產(chǎn)物為123 bp)。反應(yīng)在25 μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為50℃ 30 min;94℃ 1 min;57℃ 1 min，72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-Rad Gel凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

3.8 制備裸鼠結(jié)直腸癌皮下移植瘤模型及分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和感染組SW480細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整密度為5×109/L，裸鼠皮膚消毒后，將100 μL上述細(xì)胞懸液注射至裸鼠左腋窩皮下，每組8只，接種腫瘤后裸鼠置于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第40天時(shí)處死裸鼠，剝離裸鼠皮下腫瘤標(biāo)本后稱重。

3.9 免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)Ki-67和PTEN的表達(dá) 所有標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、5 μm切片后采用SP染色法，陰性對(duì)照以PBS代替I抗，表達(dá)陰性。Ki-67表達(dá)結(jié)果判定參考Kunnumakkara等［9］的方法，在低倍鏡(×100)下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。同時(shí)在低倍鏡下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進(jìn)行分析PTEN的表達(dá)強(qiáng)度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，總體及總體中兩樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 GHSR1a在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞及結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

如圖1所示，ghrelin和GHSR1a在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460中的表達(dá)量極低，而在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco-2和SW480中表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05);另外，SW480細(xì)胞中的ghrelin和GHSR1a的表達(dá)量顯著高于Caco-2細(xì)胞(P＜0.05)，于是選擇ghrelin和GHSR1a表達(dá)量較高的SW480細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.The levels of ghrelin and GHSR1a were significantly higher in malignant Caco-2 and SW480 cells than those in normal human colonocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCM460 group;#P＜0.05 vs Caco-2 group.圖1 Western blot檢測(cè)ghrelin和GHSR1a在人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞和人結(jié)直腸癌Caco-2和SW480細(xì)胞中的表達(dá)

2 建立穩(wěn)定表達(dá)GHSR1a shRNA的SW480細(xì)胞株

沉默GHSR1a基因的SW480細(xì)胞GHSR1a蛋白及mRNA表達(dá)較BC組和NC組明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，其中GHSR1a mRNA的抑制率達(dá)71.5%，蛋白抑制率達(dá)83.2%，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The production of stable GHSR1a knockdown cells.A:GHSR1a protein was assayed by Western blot analysis;B:GHSR1a mRNA level in SW480 cells was detected by RT-PCR.BC:blank control;NC:negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs GHSR1a shRNA group.圖2 用Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)SW480細(xì)胞中GHSR1a的蛋白和mRNA的表達(dá)水平

3 沉默GHSR1a基因?qū)W480細(xì)胞增殖的影響

如圖3所示，細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)72 h后，GHSR1a shRNA組細(xì)胞增殖率為(161.6±20.8)%，與BC組或NC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05);各組細(xì)胞經(jīng)外源性ghrelin(1 μmol/L)作用72 h后，BC組和NC組的細(xì)胞存活率分別為(128.6±17.2)%和(133.5±15.4)%，與GHSR1a shRNA組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。

Figure 3.The effect of GHSR1a shRNA on the viability of SW480 cells.A:SW480 cells were treated with culture medium(BC group)，negative control(NC group)and GHSR1a shRNA were monitored for 72 h，and the cell viability was measured by CCK-8 assay;B:the effect of exogenous ghrelin on SW480 cell viability.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs GHSR1a shRNA group;#P＜0.05 vs the same group without ghrelin.圖3 CCK-8法檢測(cè)GHSR1a shRNA對(duì)SW480細(xì)胞活力的影響

4 GHSR1a shRNA上調(diào) PTEN蛋白同時(shí)抑制PI3K/AKT通路

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，感染GHSR1a shRNA對(duì)SW480細(xì)胞中g(shù)hrelin蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響，但PTEN和p53蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)AKT的磷酸化水平顯著下調(diào)，與BC組或NC組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05);另外，應(yīng)用RTPCR檢測(cè)PTEN的mRNA水平結(jié)果顯示，與NC組相比較，GHSR1a shRNA組中PTEN的mRNA水平上調(diào)約1.8倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.GHSR1a shRNA up-regulated PTEN and inhibited the PI3K/AKT pathway in the SW480 cells.A:the protein levels of PTEN，p-AKT and p53 were detected by Western blot analysis in the SW480 cells after treated with culture medium(BC group)，negative control(NC group)and GHSR1a shRNA;B:the PTEN mRNA was detected by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖4 GHSR1a shRNA后對(duì)SW480細(xì)胞中PTEN、p-AKT和p53蛋白水平和PTEN mRNA表達(dá)的影響

5 GHSR1a shRNA抑制結(jié)直腸癌皮下移植瘤生長(zhǎng)

腫瘤細(xì)胞接種裸鼠皮下15 d后即可在皮下觸及腫瘤，成瘤率為100%，飼養(yǎng)至第40天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剝離裸鼠皮下移植瘤組織后稱重，BC組、NC組和GHSR1a shRNA組腫瘤平均重量分別為(1.22±0.34)g、(1.09± 0.28)g和(0.63±0.17)g，GHSR1a shRNA組裸鼠腫瘤重量明顯低于BC組或NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)，而B(niǎo)C組與NC組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＞0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The effect of GHSR1a knockdown on in vivo growth of tumor xenograft.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs GHSR1a shRNA group.圖5 沉默GHSR1a基因在SW480細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

6 感染GHSR1a shRNA對(duì)裸鼠皮下移植瘤組織中Ki-67和PTEN表達(dá)的影響

如圖6所示，免疫組化染色結(jié)果表明，Ki-67染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為僅胞核染成棕褐色，PTEN陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞漿為棕褐色。BC組和NC組中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較高，但PTEN陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較低;而GHSR1a shRNA組腫瘤細(xì)胞中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均明顯低于BC組和NC組，另外PTEN的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.05)。

Figure 6.Ki-67 and PTEN in tumor tissue sections determined by immunohistochemistry(×400).圖6 免疫組化檢測(cè)感染GHSR1a shRNA后對(duì)裸鼠結(jié)直腸癌皮下移植瘤細(xì)胞中Ki-67和PTEN表達(dá)的影響

討論

結(jié)直腸癌作為我國(guó)最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢(shì)，位居我國(guó)惡性腫瘤病死率的第3位。目前結(jié)直腸癌的治療方法主要是手術(shù)治療，而外科手術(shù)對(duì)早期實(shí)體瘤的患者較為有效，對(duì)復(fù)發(fā)和晚期的患者往往達(dá)不到根治的目的，因此，目前臨床上需要一種新的結(jié)直腸癌早期診斷和治療的分子標(biāo)志物，以期改善患者預(yù)后［10］。目前已有多項(xiàng)研究報(bào)道表明ghrelin在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)多種惡性腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮了巨大作用［5-8］，同時(shí)GHSR的亞型之一GHSR1a在調(diào)控HEK-293細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮了一定作用［11］，表明GHSR1a可能與惡性腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)，但GHSR1a在人結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究首先比較了 ghrelin及 GHSR1a在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)差異，結(jié)果表明ghrelin和GHSR1a在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，同時(shí)ghrelin及GHSR1a在結(jié)直腸高分化腺癌細(xì)胞系Caco-2中的表達(dá)顯著低于結(jié)直腸低分化腺癌細(xì)胞系SW480。既往研究表明非惡性細(xì)胞表達(dá)極少量?jī)?nèi)源性ghrelin，在缺乏胎牛血清的培養(yǎng)基中無(wú)法增殖，而惡性腫瘤細(xì)胞表達(dá)大量?jī)?nèi)源性ghrelin，并且可以在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中增殖［9］，這種ghrelin及其受體GHSR1a在良惡性細(xì)胞中的表達(dá)差異表明ghrelin/GHSR1a生物學(xué)軸與結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有一定聯(lián)系，與文獻(xiàn)報(bào)道相仿，為此，本研究將進(jìn)一步探討ghrelin/GHSR1a生物學(xué)軸與體內(nèi)外結(jié)腸癌生長(zhǎng)的關(guān)系及其可能作用機(jī)制。

RNA干擾技術(shù)已成為當(dāng)前研究基因功能的重要工具，小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)存在感染效率低、半衰期短、維持時(shí)間較短等缺點(diǎn)，近年來(lái)發(fā)展的慢病毒介導(dǎo)的shRNA技術(shù)可高效抑制靶基因表達(dá)，成為基因沉默的最常用選擇［12］。在本研究中，我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)設(shè)計(jì)了特異性靶向GHSR1a基因的shRNA，并通過(guò)慢病毒的介導(dǎo)感染至人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，從而首次獲得穩(wěn)定沉默GHSR1a基因表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，結(jié)果表明，感染GHSR1a shRNA慢病毒表達(dá)載體后可明顯下調(diào)GHSR1a蛋白及mRNA在SW480細(xì)胞中的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，感染GHSR1a shRNA的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力明顯被抑制，從而進(jìn)一步表明GHSR1a與腫瘤細(xì)胞增殖關(guān)系密切;既往研究表明外源性ghrelin可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡［13］，在本實(shí)驗(yàn)中，一定濃度外源性ghrelin(1 μmol/L)可促進(jìn)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組SW480細(xì)胞增殖，而對(duì)沉默GHSR1a基因表達(dá)的SW480細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，從而表明外源性ghrelin需通過(guò)其受體GHSR1a才能發(fā)揮促細(xì)胞增殖作用。但抑制 GHSR1a在SW480細(xì)胞中的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，這種作用是因?yàn)镚HSR1a shRNA可抑制內(nèi)源性ghrelin在SW480細(xì)胞中的表達(dá)還是GHSR1a本身具有一定促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的活性?為進(jìn)一步明確疑問(wèn)，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，本研究驗(yàn)證了感染GHSR1a shRNA對(duì)SW480細(xì)胞中內(nèi)源性ghrelin表達(dá)無(wú)明顯影響，從而表明GHSR1a在促進(jìn)體外結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖作用中具有一定活性，抑制GHSR1a的表達(dá)，可抑制體外腫瘤細(xì)胞增殖。

為進(jìn)一步驗(yàn)證沉默GHSR1a基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞是否同樣具有增殖抑制作用。為此，本研究通過(guò)建立裸鼠結(jié)直腸癌皮下移植瘤模型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次表明GHSR1a shRNA可抑制增殖因子Ki-67在皮下移植瘤組織中的表達(dá)，從而抑制皮下移植瘤生長(zhǎng)，表明沉默GHSR1a基因的表達(dá)可在體內(nèi)抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相仿，從而表明抑制GHSR1a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)可有效抑制體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)而表明GHSR1a有望成為新的結(jié)直腸癌治療的作用靶點(diǎn)。當(dāng)前，已有GHSR拮抗劑和反向激動(dòng)劑安全地用于人體實(shí)驗(yàn)和嚙齒動(dòng)物中，并取得了良好的療效［14-15］。

PTEN作為一種易變異的抑癌基因，其在人體正常組織中呈高表達(dá)，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，但PTEN基因的突變或缺失可促進(jìn)細(xì)胞增殖和阻斷細(xì)胞凋亡，從而在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等多種惡性生物學(xué)行為中有著密不可分的關(guān)系［16］。在結(jié)直腸癌中，PTEN的低表達(dá)與結(jié)直腸癌的病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)PTEN的缺失和低表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［17］。在體外實(shí)驗(yàn)中，Western blot和RT-PCR結(jié)果表明，GHSR1a shRNA不僅可促進(jìn)體外結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中PTEN蛋白和mRNA的表達(dá);另外在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，沉默GHSR1a在SW480細(xì)胞中的表達(dá)可上調(diào)PTEN蛋白在裸鼠結(jié)直腸癌皮下移植瘤中的表達(dá)，從而表明抑制GHSR1a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控PTEN基因的表達(dá)。既往研究表明腫瘤細(xì)胞中抑癌基因PTEN的缺失或表達(dá)下調(diào)可引起PIP3催化亞基的表達(dá)放大，并激活PI3K/AKT通路的磷酸化，而活化的 AKT可以磷酸化下游的mTOR，從而在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、蛋白合成和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為中發(fā)揮中樞作用［18］，而通過(guò) PTEN/ PI3K/AKT通路即可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［11］。在本研究中，GHSR1a shRNA可分別上調(diào)和下調(diào)p53和p-AKT在SW480細(xì)胞中的蛋白水平，從而表明PTEN/PI3K/AKT通路可能在GHSR1a促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮著一定作用。

綜上所述，本研究提示感染GHSR1a shRNA至結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞后可抑制體內(nèi)外結(jié)直腸細(xì)胞的生長(zhǎng)，PTEN及其下游調(diào)控因子在GHSR1a調(diào)控體內(nèi)外結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用。從而為臨床結(jié)直腸癌基因治療提供一個(gè)新的作用靶點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步深入研究GHSR1a是否影響結(jié)直腸癌的其它惡性生物學(xué)行為。

致謝:感謝南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心對(duì)本研究順利實(shí)施給予的幫助!

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅 森)

Lentivirus-mediated shRNA interferenceofghrelin receptorblocks growth of colorectal cancer cells

LIU An，HUANG Cheng-gang，XU Jia

(Department of Gastrointestinal Surgery，The First People’s Hospital of Yueyang，Yueyang 414000，China.E-mail: 325905634@qq.com)

AIM:To investigate the therapeutic effects of lentivirus-mediated shRNA targeting growth hormone secretagogue receptor 1a(GHSR1a)on colorectal cancer cell line SW480 both in vitro and in vivo.METHODS:Human GHSR1a sequence was used for the design of shRNA targeting GHSR1a，which was introduced to lentivirus，followed by transfection into SW480 cells.CCK-8 assay was performed to detect cell viability.The mRNA expression of GHSR1a and PTEN in colorectal cancer cells was detected by RT-PCR.The protein levels of GHSR1a，ghrelin，PTEN，p-AKT and p53 were determined by Western blot.Stable GHSR1a silencing in SW480 xenografts in nude mice was established.After the mice were sacrificed and weighted，immunohistochemistry was used to detect the positive expression of Ki-67 and PTEN in the tumors.RESULTS:GHSR1a was over-expressed in the malignant cells in comparison with the normal cells in vitro.The tumor specific lentivirus-mediated shRNA targeting GHSR1a gene and GHSR1a knockdown SW480 cells were successfully constructed.After transfection with GHSR1a shRNA，the expression of GHSR1a at mRNA and protein levels was markedly inhibited in the SW480 cells.Furthermore，GHSR1a silencing by specific shRNA showed increased PTEN，inhibition of AKT phosphorylation and promotion of p53 release in the SW480 cells.In vivo results demonstrated that down-regulation of GHSR1a in the SW480 cells significantly decreased the expression of Ki-67 and increased the expression of PTEN in the tumor tissues，leading to a marked reduction in tumor weight in comparison to blank control or negative controltumors.CONCLUSION:Down-regulation of GHSR1a by shRNA technique inhibits the growth of colorectal cancer cell line and xenograft tumor through activation of the PTEN/PI3K/AKT signaling pathways.

Colorectal cancer;Ghrelin;Growth hormone secretagogue receptor 1a;PTEN

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.012

1000-4718(2016)07-1227-08

2016-01-06

2016-04-21

岳陽(yáng)市2014年第三批科技資助項(xiàng)目

△Tel:0730-8256328;E-mail:325905634@qq.com