病原菌新基因功能的研究策略

杜雪晴，黃金林

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病原菌新基因功能的研究策略

杜雪晴，黃金林

隨著高通量測序技術(shù)和蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的病原菌新基因被發(fā)現(xiàn)，研究病原菌新基因有助于更好的防控由該病原菌引起的疾病的傳播。本文從生物信息學(xué)角度、新基因功能獲得與缺失、與新基因編碼產(chǎn)物互作蛋白的分析等方面綜述了適用于病原菌新基因功能研究的策略，為基因分子生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域提供參考。此外，本文還結(jié)合常規(guī)的新基因研究方法，將芯片技術(shù)，2D-DIGE技術(shù)滲透入病原菌新基因研究策略中，使研究者能更快捷準確的找出新基因功能研究的切入點，進而制定切實可行的新基因功能的研究方案。

病原菌新基因；生物信息學(xué)；基因功能；蛋白質(zhì)相互作用

隨著全基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)座插入突變體偶聯(lián)測序技術(shù)從病原微生物基因組中篩選新基因越來越準確快捷，但闡明新基因編碼蛋白的生物學(xué)特性、生物學(xué)功能、與臨床醫(yī)學(xué)之間的關(guān)系、新基因表達調(diào)節(jié)機制還十分困難，病原菌新基因功能研究仍然是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中具有挑戰(zhàn)性的工作。通常對于新基因功能的研究，首先是利用數(shù)據(jù)庫中已有的信息對新基因進行生物信息學(xué)分析；其次應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對該基因進行體內(nèi)或體外分析，并通過體內(nèi)篩選與該基因編碼蛋白相互作用的蛋白進一步確證該基因在病原菌致病過程中發(fā)揮的作用。

1　新基因生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)(Bioinformatics)是隨著生命科學(xué)和計算機科學(xué)的迅猛發(fā)展，由生命科學(xué)和計算機科學(xué)相結(jié)合形成的一門新學(xué)科。目前，各類病原微生物基因及蛋白信息數(shù)據(jù)庫已更新的相對完備，生物信息學(xué)分析也成為新基因功能研究的首選方法[1]。利用數(shù)據(jù)庫中已有的信息可快速了解與新基因功能有關(guān)的信息，初步推測新基因可能的功能，據(jù)此制定進一步的研究方案。

1.1新基因序列分析生物信息學(xué)的核心是基因組信息學(xué)，即以基因組DNA序列的信息分析為基礎(chǔ)尋找發(fā)現(xiàn)新基因[2]。新基因序列分析包括堿基序列基本參數(shù)分析以及序列同源性比對。序列基本參數(shù)統(tǒng)計包括分子質(zhì)量、GC百分含量、融合溫度(Tm值)、摩爾消光系數(shù)等核酸序列基本指標的計算[3]?？赏ㄟ^一些常用軟件如JaMBW軟件包中的工具Oligo Calculator、BioEdit、DNAMAN等進行綜合計算(http://www.bioinformatics.org/JaMBW/)。隨后進行新基因序列同源性分析，包括基因序列同源性和氨基酸序列同源性分析，如應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST程序進行基因序列比對，應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序進行蛋白序列比對(http://www.uniprot.org/)等。通過比對發(fā)現(xiàn)與新基因或氨基酸序列高度同源的基因或蛋白，通過這些已知基因或蛋白的信息推測未知基因的功能。Gao等[4]于2014年應(yīng)用轉(zhuǎn)座突變體偶聯(lián)二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)變形菌屬彎曲菌基因組中的一些變形菌屬特異新基因，通過序列與結(jié)構(gòu)同源性分析初步推知所篩選的新基因的功能。

1.2新基因編碼產(chǎn)物的分析首先可以對新基因編碼產(chǎn)物進行理化性質(zhì)分析，其次運用swiss-model預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)，并進行結(jié)構(gòu)同源性分析，通過比對后獲得結(jié)構(gòu)同源性較高的已知蛋白，可以推測未知基因蛋白的功能。此外預(yù)測病原菌新基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域，功能域?qū)τ谥贫ê罄m(xù)蛋白功能研究策略具有至關(guān)重要的意義。如預(yù)測該蛋白是否有信號肽(SignalP4.0)、跨膜結(jié)構(gòu)(TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)以及脂蛋白信號肽等可以推測該蛋白是否為膜蛋白或分泌性蛋白。 Marchant等[5]綜述了多個空腸彎曲菌Tlp蛋白預(yù)測受體和跨膜信號肽結(jié)構(gòu)域，使我們更好的了解空腸彎曲菌的趨化機制。

2　新基因功能獲得與失活

了解病原菌新基因功能最直觀的方法就是對該基因體內(nèi)過表達或失活。通過觀察病原菌表型變化或者生理生化特性的改變分析該基因可能的功能。

2.1新基因功能獲得方法在新基因上游加入可調(diào)控原件并通過載體轉(zhuǎn)入某一特定的細胞中(也可以是新基因突變株)，使其過表達，觀察該細胞生物學(xué)特性以及生理生化反應(yīng)，代謝等方面的變化，從而了解該基因的功能，如果是轉(zhuǎn)入細胞中稱為轉(zhuǎn)染，基因轉(zhuǎn)染運載系統(tǒng)分為非病毒方法和病毒方法。非病毒方法又分為化學(xué)轉(zhuǎn)染法，生物轉(zhuǎn)染法及物理轉(zhuǎn)染法。另一種轉(zhuǎn)染運載系統(tǒng)是病毒作為載體，其優(yōu)勢有能夠在轉(zhuǎn)化細胞中將目的基因穩(wěn)定遺傳，其次能夠?qū)⒖寺〉幕蜃鳛椴《救旧w的一部分，并且能夠進行分離，最重要的是轉(zhuǎn)化效率高[6]。Marijke Keestra等[7]將鼠傷寒沙門菌sipA基因構(gòu)建到真核表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HEK293細胞，發(fā)現(xiàn)該基因編碼毒力因子能夠激活NOD1/NOD2信號通路。轉(zhuǎn)化是構(gòu)建新基因過表達株最常用的方法，應(yīng)用誘導(dǎo)型高效表達質(zhì)粒將新基因轉(zhuǎn)入該基因的突變株。轉(zhuǎn)化方法有電轉(zhuǎn)化和熱激法。

2.2新基因功能失活方法觀察病原菌在新基因功能被部分或者全部失活后，生物學(xué)行為或表型變化來鑒定新基因的功能。為使基因功能失活可以使該基因敲除、突變或者缺失，也可以從轉(zhuǎn)錄水平進行干擾蛋白的合成但該類方法極少用于病原菌的研究。基因水平的失活方法有基因敲除技術(shù)(主要用于動物模型的建立)、基因缺失技術(shù)和基因突變技術(shù)。80年代初，胚胎干細胞(ES細胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)，運用基因同源重組進行基因敲除是構(gòu)建基因敲除動物模型最普遍使用的方法[8-9]。Robert等[10]于2007年建立了myd88基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)nramp1基因在彎曲菌感染中發(fā)揮作用。病原菌最常用的基因功能缺失方法就是使該基因突變。Red同源重組系統(tǒng)是常用的構(gòu)建病原菌突變株的方法，運用高效自殺載體系統(tǒng)同樣能達到基因突變的目的。前者相對后者操作簡單，但在某些病原菌中還沒有應(yīng)用[11-12]。Kao等將csrA與rpoN基因突變后幽門羅桿菌J99運動力及粘附能力均顯著下降，說明csrA，rpoN影響幽門桿菌J99鞭毛發(fā)揮正常作用[13]。 Malik Tareen 等[14]將空腸彎曲菌cj0268c基因突變后，粘附侵襲Caco-2細胞的能力均有下降，說明該基因與彎曲菌粘附侵襲能力有關(guān)。

轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默即干擾mRNA翻譯成蛋白質(zhì)這一過程。此類技術(shù)常用于真核生物及病毒的研究。原核生物由于轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時進行，所以干擾mRNA的翻譯有一定的局限性。目前最為常用的基因沉默技術(shù)是RNAi技術(shù)，該技術(shù)利用與靶mRNA具有同源性microRNA與阿爾法古蛋白家族形成RNA沉默復(fù)合體，特異性結(jié)合并降解靶mRNA[15]。大量研究表明RNAi技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中用于治療多種疾病大有前景[16-18]。如 Peer等[19]利用β7-targeted siRNA 治療小鼠腸炎，β7-targeted siRNA的靶分子是編碼細胞周期素(CyD1)的mRNA，能夠特異性的與之結(jié)合并降解，從而使腸道上皮細胞炎性有一定的恢復(fù)。

3　病原體基因表達水平的檢測

病原菌新基因功能失活或過表達后，若能得知某些已知基因上調(diào)或下調(diào)表達，那么該基因與上調(diào)或下調(diào)表達的已知基因的功能定存在直接或間接關(guān)系。

3.1mRNA表達水平的變化檢測mRNA表達量的傳統(tǒng)技術(shù)有實時定量RT-PCR技術(shù)及Northern Blot，二者皆能夠定量檢測mRNA的轉(zhuǎn)錄水平變化，但也各有不足，實時定量RT-PR成本較高，而Northern Blot操作較為繁瑣，且使用放射性元素標記，會產(chǎn)生放射性污染。因此在實際研究中，研究者需根據(jù)實驗需求而選擇，二種實驗技術(shù)互相補充有時是必要的。

基因芯片是當下較為熱門的一項技術(shù)。其原理是采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定于經(jīng)過相應(yīng)處理的硅片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上,然后加入標記的待測樣品,進行多元雜交,通過雜交信號的強弱及分布,來分析目的分子的有無、數(shù)量及序列,從而獲得受檢樣品的遺傳信息[20-21]?；蛐酒欠治鲂禄蚬δ艿膬?yōu)良工具[22]。Gong等[23]使用基因芯片技術(shù)等發(fā)現(xiàn)malS 5′-UTR(ncRNA)可調(diào)控bax基因的表達，因此malS 5′-UTR(ncRNA)影響鼠傷寒沙門菌的侵襲能力。RNA-Seq技術(shù)是近年來新興的高通量表達譜分析技術(shù)，盡管目前為止該技術(shù)發(fā)展并沒有成熟，但具有很好的應(yīng)用前景[24]。Butcher等[25]應(yīng)用RNA-seq技術(shù)分析了空腸彎曲菌編碼鐵激活蛋cjfur，cjperR基因缺失株的轉(zhuǎn)錄組變化，發(fā)現(xiàn)在鐵離子缺少的情況下，鐵依賴基因差異表達。

3.2蛋白表達水平的變化蛋白芯片技術(shù)繼基因芯片技術(shù)之后又一新型技術(shù)。它的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為檢測的芯片，然后，用標記有特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配的抗體將與其對應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，抗體上的熒光將指示對應(yīng)的蛋白質(zhì)及其表達量[26]。2D-DIGE技術(shù)也是用于研究蛋白組學(xué)的一項有力技術(shù)[27]。首先將樣品分別用不同的熒光標記(如Cy2，Cy3)，并將2種樣品等量混合，同時在一塊膠上進行電泳，然后將跑好的2D圖像用激光經(jīng)不同的濾光器后進行熒光信號分析，根據(jù)熒光信號的比例定量分析上調(diào)表達與下調(diào)表達的蛋白[28]。Condell 等[29]應(yīng)用2D-DIGE技術(shù)分析沙門菌耐受三氯生抗菌劑的蛋白組學(xué)，結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，對野生株ST23與突變株ST23M比較蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)有18個上調(diào)表達蛋白，9個下調(diào)表達蛋白，這說明2D-DIGE技術(shù)可以用來分析新基因缺失后與野生型蛋白表達差異。

4　新基因編碼產(chǎn)物與已知蛋白相互作用研究策略

蛋白-蛋白之間的相互作用貫穿于細胞生命活動的每個過程，包括DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、拼接以及分泌，多數(shù)蛋白質(zhì)以復(fù)合體的形式存在。研究蛋白之間的相互作用是闡明蛋白作用機制和生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。

4.1體外GST pull-down技術(shù)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶pull-down(glutathione S-transferase pull-down，GST pull-down)技術(shù)利用GST對谷胱甘肽的親和作用，從蛋白混合液中分離出相互作用蛋白，是進行體外研究蛋白相互作用的有效方法[30]。

目前，GST pull-down已廣泛應(yīng)用于蛋白互作研究領(lǐng)域，該技術(shù)可聯(lián)合質(zhì)譜法篩選與已知蛋白相互作用的靶蛋白，也可以對已知的相互作用蛋白進行驗證。黃勇等[31]用GST pull-down技術(shù)驗證大腸桿菌YggG與Era蛋白之間存在相互作用，說明該基因的表達與大腸桿菌的環(huán)境應(yīng)激相關(guān)，提示yggG基因產(chǎn)物參與細菌的應(yīng)激調(diào)控。2010年，Kanno等[32]表達GST-Rab1-43蛋白，運用GST pull-down聯(lián)合質(zhì)譜法篩選出哺乳動物單體GTP酶的效應(yīng)因子。Minamino 實驗室[33-35]先后3次使用GST pull-down 技術(shù)證明 FliI ATPase 和鞭毛伴侶蛋白FliT 在沙門菌SJW1368鞭毛蛋白輸出過程中具有相互作用，鞭毛伴侶蛋白FlgN分別與FlgK，F(xiàn)lgL鞭毛蛋白C端結(jié)合以防止二者在運輸過程中被水解以及鞭毛伴侶蛋白FlgN和FliT的C端殘基分別與FlhAC相互作用，證實FlhA在鞭毛絲合成過程中發(fā)揮一定作用。該方法不足之處在于缺乏體內(nèi)生理條件，且不能檢測到蛋白間的瞬時作用。另外，該技術(shù)需要足量的活性蛋白，因此具有一定的局限性；GST標簽也可能會影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而造成假陰性結(jié)果。

4.2胞內(nèi)免疫共沉淀技術(shù)另一種檢測蛋白相互作用常用的方法是免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)。免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)來研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，也是確定2種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法[36]。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當用預(yù)先固化在argarose beads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。Lung 等[37]應(yīng)用Co-IP技術(shù)證實大腸桿菌中其他與T3SS毒力蛋白NleB1相互作用的蛋白，豐富了該蛋白的毒力功能。黃琪等[38]利用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析，在卡介苗(BCG)中篩選與PPE蛋白家族Rv3425相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)Rv3425與Rv3614c相互作用，推測Rv3425可能與ESX-1蛋白分泌系統(tǒng)及結(jié)核分枝桿菌致病機制密切相關(guān)。該技術(shù)與普通的ELISA和Western-blot技術(shù)相比，使用的抗體需達到一定的濃度并對相應(yīng)抗原有較高的親和力，否則會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。另外針對誘餌蛋白的特異性抗體可能與相互作用蛋白競爭性結(jié)合，從而影響相互作用蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性[39-40]。

5　展　望

筆者相信隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，未來高通量大規(guī)模測序技術(shù)會普及于生物學(xué)領(lǐng)域，因此將會有更多的病原菌新基因被挖掘。另外，基因及蛋白數(shù)據(jù)庫不斷完善，這對后續(xù)新基因研究提供更多的依據(jù)。研究病原菌的新基因能夠更深的了解該病原菌的特性，與臨床醫(yī)學(xué)的關(guān)系，以及致病機制，對于因該病原菌引起的疾病的防控具有重要意義。本文雖然主要綜述病原菌新基因功能的研究策略，但許多技術(shù)也適于其他生物的新基因功能的研究，希望本文能為從事本行業(yè)工作的研究者們提供借鑒。

[1] Bu YQ, Yang ZM, Song FZ. Strategies and methods in functional analysis of novel genes[J]. Life Sci Res, 2006, 10(2): 95-98. (in Chinese)

卜友泉, 楊正梅, 宋方洲. 新基因功能研究的策略與方法[J]. 生命科學(xué)研究, 2006, 10(2): 95-98.

[2] Zhang L, Li QZ. Overall strategy for the study of new gene function[J]. China Anim Husb Vet Med, 2011, 38(5): 109-113. (in Chinese)

張嵐, 李慶章. 新基因功能研究的整體策略[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38(5): 109-113.

[3] Mount DW. Bioinformatics: Sequence and genome analysis[M]. 2nd ed. New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press, 2004.

[4] Gao B, Lara-Tejero M, Lefebre M, et al. Novel components of the flagellar system inepsilonproteobacteria[J]. mBio, 2014, 5(3): e01349. DOI: 10.1128/mBio.01349-14

[5] Marchant J, Wren B, Ketley J. Exploiting genome sequence: predictions for mechanisms ofCampylobacterchemotaxis[J]. Trends Microbiol, 2002, 10(4): 155-159. DOI: 10. 1016/S0966-842X(02)02323-5

[6] Brummelkamp TR, Bernards R. New tools for functional mammalian cancer genetics[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3(10): 781-789. DOI: 10. 1038/nrc1191

[7] Keestra AM, Winter MG, Klein-Douwel D, et al. ASalmonellavirulence factor activates the NOD1/NOD2 signaling pathway[J]. MBio, 2011, 2(6): e00266-11. DOI: 10.1128/mBio.00266-11

[8] Bu L, Gao X, Jiang X, et al. Targeted conditional gene knockout in human embryonic stem cells[J]. Cell Res, 2010, 20(3): 379-382. DOI: 10.1038/cr.2010.23

[9] Vonder leyen HE, Dzau VJ. Therapeutic potential of nitric oxide synthase gene manipulation[J]. Cireulation, 2001, 103(22): 12761-12765. DOI: 10.1161/01.CIR.103.22.2760

[10] Watson RO, Novik V, Hofreuter D, et al. A MyD88-deficient mouse model reveals a role for Nramp1 inCampylobacterjejuniinfection[J]. Infect Immun, 2007, 75(4): 1994-2003.DOI: 10.1128/IAI.01216-06

[11] Han C, Zhang WC, You S. Advances in the red-mediated recombination[J]. China Biotechnol, 2003, 23(12): 17-21. (in Chinese)

韓聰, 張惟材, 游松. Red 同源重組技術(shù)研究進展[J]. 中國生物工程雜志, 2003, 23(12): 17-21.

[12] Zhu CH, Sun XQ, He SF, et al. Comparison of two methods for constructingSalmonellaenteritidismutants: Red recombination system and suicide vector system[J]. Chin J Pre Vet Med, 2009, 31(2): 81-84. (in Chinese)

朱春紅, 孫曉慶, 何素芬, 等. 基于 Red 同源重組和高效自殺性載體系統(tǒng)構(gòu)建腸炎沙門氏菌突變株方法的比較[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2009, 31(2): 81-84.

[13] Kao CY, Sheu BS, Wu JJ. CsrA regulatesHelicobacterpyloriJ99 motility and adhesion by controlling flagella formation[J]. Helicobacter, 2014, 19(6): 443-454. DOI:10.1111/hel.12148

[14] Tareen AM, Luder CGK, Zautner AE, et al. TheCampylobacterjejuniCj0268c protein is required for adhesion and invasioninvitro[J]. PLoS One, 2013, 8(11): e81069. DOI: 10.1371/journal.pone.0107076

[15] Hammond SM. An overview of microRNAs[J]. Adv Drug Delivery Rev, 2015, 29(87): 3-14. DOI: 10.1016/j.addr.2015.05.001

[16] Huntzinger E, Izaurralde E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay[J]. Nat Rev Genet, 2011, 12(2): 99-110. DOI: 10.1038/nrg2936

[17] Dorsett Y, Tuschi T. siRNAs: application in functional genomics and potential as therapeutics[J]. Nat Rev Drug Discov, 2004, 3(4): 318-329. DOI: 10.1038/nrd1345

[18] Ozcan G, Ozpolat B, Coleman RL, et al. Preclinical and clinical development of siRNA-based therapeutics[J]. Adv Drug Delivery Rev, 2015, 87(29): 108-119. DOI: 10.1016/j.addr.2015.01.007

[19] Peer D, Park EJ, Morishita Y, et al. Systemic leukocyte-directed siRNA delivery revealing cyclin D1 as an anti-inflammatory target[J]. Science, 2008, 319(5863): 627-630. DOI: 10.1126/science.1149859

[20] Ramsay G. DNA chips: state-of-the art[J]. Nat Biotechnol, 1998, 16(1): 40-44. DOI: 10.1038/nbt0198-40

[21] Marshall A, Hodgson J. DNA chips: an array of possibilities[J]. Nat Biotechnol, 1998, 16(1): 27-32. DOI: 10.1038/nbt0198-27

[22] Fang AH, Yin YT. Present application situation and prospect of gene chip technology[J]. China Anim Husb Vet Med, 2009, 5: 75-78. (in Chinese)

房愛華, 尹彥濤. 基因芯片技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2009, 5: 75-78.

[23] Gong M, Xu S, Jin Y, et al. 5′-UTR of malS increases the invasive capacity ofSalmonellaentericaserovarTyphiby influencing the expression of bax[J]. Future Microbiol, 2015, 10(6): 941-954. DOI: 10.2217/fmb.15.12

[24] Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics[J]. Nat Rev Genetics, 2009, 10(1): 57-63. DOI: 10.1038/nrg2484

[25] Butcher J, Handley RA, van Vliet AHM, et al. Refined analysis of theCampylobacterjejuniiron-dependent/independent Fur-and PerR-transcriptomes[J]. BMC genomics, 2015, 16: 498. DOI: 10.1186/s12864-015-1661-7

[26] Templin MF, Stoll D, Schrenk M, et al. Protein microarray technology[J]. Drug Discov Today, 2002, 7(15): 815-822. DOI: 10.1016/S1359-6446(00)01910-2

[27] Marouga R, David S, Hawkins E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology[J]. Analytical Bioanalytical Chem, 2005, 382(3): 669-678. DOI: 10.1007/s00216-005-3126-3

[28] Du JB, Wang LH, Duan JY. 2D-DIGE in proteomics applications[J]. J Biol, 2011, 28(3): 84-87. DOI: 10.3969/j.issn.2095-1736.2011.03.084 (in Chinese)

杜俊變, 王麗惠, 段江燕. 2D-DIGE 技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)雜志, 2011, 28(3): 84-87.

[29] Condell O, Sheridan A, Power KA, et al. Comparative proteomic analysis ofSalmonellatolerance to the biocide active agent triclosan[J]. J Proteomics, 2012, 75(14): 4505-4519. DOI: 10.1016/j. jprot.2012.04.044

[30] Vikis HG, Guan KL. Glutathione-S-transferase-fusion based assays for studying protein-protein interactions[M]. Humana Press: Protein-protein interactions. 2004: 175-186. DOI: 10.1385/1-59259-762-9:175

[31] Huang Y, Chen SM, Huang QS, et al. Interaction between YggG and Era inEscherichiacoli[J]. China Biotechnol, 2009, 29(11): 36-40. DOI: 10.13523/j.cb.20091107 (in Chinese)

黃勇, 陳蘇民, 黃慶生, 等. 大腸桿菌 YggG 與結(jié)合蛋白 Era 的相互作用研究[J]. 中國生物工程雜志, 2009, 29(11): 36-40.

[33] Minamino T, Kinoshita M, Imada K, et al. Interaction between FliI ATPase and a flagellar chaperone FliT during bacterial flagellar protein export[J]. Mol Microbiol, 2012, 83(1): 168-178. DOI:10.1111/j.1365-2958.2011.07924.x

[34] Minamino T, Kinoshita M, Hara N, et al. Interaction of a bacterial flagellar chaperone FlgN with FlhA is required for efficient export of its cognate substrates[J]. Mol Microbiol, 2012, 83(4): 775-788. DOI:10.1111/j.1365-2958.2011.07964.x

[35] Kinoshita M, Hara N, Imada K, et al. Interactions of bacterial flagellar chaperone-substrate complexes with FlhA contribute to co-ordinating assembly of the flagellar filament[J]. Mol Microbiol, 2013, 90(6): 1249-1261. DOI:10.1111/mmi.12430

[36] Guo C. Study progress of co-immunoprecipitation technology[J]. Guiding J TCM, 2007, 13(12): 86-88. (in Chinese)

郭純. 免疫共沉淀技術(shù)的研究進展[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報, 2007, 13(12): 86-88.

[37] Lung TWF, Giogha C, Creuzburg K, et al. Mutagenesis and functional analysis of the bacterial arginine glycosyltransferase effector NleB1 from enteropathogenicEscherichiacoli[J]. Infect Immun, 2016: IAI. 01523-15. DOI: 10.1128/IAI.01523-15

[38] Huang Q, Xu WX, Li HB, et al. Protein-protein interaction between Rv3425 and Rv3614c inMycobacteriumtuberculosis[J]. J Microbes Infect, 2015, 10(4): 235-240. (in Chinese)

黃琪, 徐文璽, 粟海波, 等. 結(jié)核分枝桿菌 Rv3425 與 Rv3614c 的相互作用[J]. 微生物與感染, 2015, 10(4): 235-240.

[39] Monti M, Orru S, Pagnozzi D, et al. Interaction proteomics[J]. Biosci Reports, 2005, 25(1/2): 45-56. DOI: 10.1007/s10540-005-2847-z

[40] Masters SC, Yang H, Datta SR, et al. 14-3-3 inhibits Bad-induced cell death through interaction with serine-136[J]. Mol Pharmacol, 2001, 60(6): 1325-1331. DOI: 10.1124/mol.60.6.1325

Strategy for pathogen novel gene function research

DU Xue-qing, HUANG Jin-lin

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

With the development of high-throughput sequencing technology and proteomics technology, more and more pathogen novel genes were discovered. To explore novel genes of pathogen is helpful to prevent and control the diseases caused by these pathogen better. In the perspective of bioinformatics, acquisition and deletion of novel gene, analysing novel gene encoding product, this article reviews strategies that are suitable for the research of pathogenic bacteria novel gene, which provides a reference for genetic and molecular biology. Combined with conventional methods, this article penetrates chip technology, 2D-DIGE technology into the pathogen novel gene research strategy. It enables researchers to find a new breakthrough of gene function research and further formulate feasible research plan of novel gene function.

pathogen novel gene; bioinformatics; gene function; protein interaction

Supported by the National Natural Science Foundation of China Grant (No.31372449) and the National Key Technology R&D Program (No. 2014BAD13B02)

Huang Jin-lin, Email: jinlin@yzu.edu.cn

黃金林，Email：jinlin@yzu.edu.cn

揚州大學(xué)，江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009

R378

A

1002-2694(2016)07-0665-05

2015-11-26；

2016-04-24

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.015

國家自然科學(xué)基金(No.31372449)、國家支撐計劃(2014BAD13B02)