關(guān)于男性生育力的人精子頂體內(nèi)頂體蛋白酶和透明質(zhì)酸酶作用解析

李林　吳勵(lì)梅　羅一平　田小燕　李彩英　徐妙容（廣東省佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院生殖健康與不孕科　佛山528300）

關(guān)于男性生育力的人精子頂體內(nèi)頂體蛋白酶和透明質(zhì)酸酶作用解析

李林吳勵(lì)梅羅一平田小燕李彩英徐妙容
（廣東省佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院生殖健康與不孕科佛山528300）

目的：解析精子透明質(zhì)酸酶（HYD）和精子頂體蛋白酶（ACE）在男性生育力中所起的作用。方法：以不育者為實(shí)驗(yàn)組，以來我院檢查身體的健康正常生育男性為對(duì)照組，用明膠底物膜法對(duì)精子樣本檢驗(yàn)，并進(jìn)行組間對(duì)比。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組精子畸形率較高，ACE陽性率、活性強(qiáng)度、HYD陽性率、活性強(qiáng)度均低于對(duì)照組，且精子密度及活性與上述指標(biāo)呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：HYD 及ACE在男性生育能力中起到至關(guān)重要的作用。

男性生育力；精子；ACE；HYD

有研究認(rèn)為精子透明質(zhì)酸酶（HYD）和精子頂體蛋白酶（ACE）與男性生育能力相關(guān)，但其具體所起的作用卻未經(jīng)證實(shí)［1～2］。本研究采用細(xì)胞染色技術(shù)對(duì)不育癥患者精液樣本進(jìn)行觀察，并通過與正常人的精液比較來探討其作用?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1　資料與方法

1.1臨床資料本研究選取2013年4月～2015年9月期間在我院生殖健康與不孕科就診的不育癥患者為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)以身體健康正常生育男性為對(duì)照組。診斷標(biāo)準(zhǔn)：前向運(yùn)動(dòng)（PR）級(jí)精子百分率＞32%、精子密度＞15×106/ml為正常［3］。納入標(biāo)準(zhǔn)：已婚且有1年以上同居經(jīng)歷；夫妻性生活正常；處在正?？缮挲g范圍內(nèi)（本研究選取24～35歲患者）。排除標(biāo)準(zhǔn)：因女方原因?qū)е虏挥?。?jīng)納入、排除后共選入對(duì)象70例。實(shí)驗(yàn)組20例，年齡24～35歲，平均年齡（29.32±2.16）歲，按精子活動(dòng)率和精子密度各分為三組。對(duì)照組50例，年齡24～35歲，平均年齡（29.15±2.09）歲。兩組一般資料對(duì)比，無明顯差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法用明膠底物膜法對(duì)精子樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)比正常男性與不育者精子樣本差異，分析人精子頂體蛋白酶與透明質(zhì)酸酶的作用。研究對(duì)象需要禁欲3～7 d，采用手淫法取精液，全部收集于干燥無菌取精杯中，放置37℃恒溫箱內(nèi)孵育，待液化后精液樣本處理。通過人工鏡檢法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)精子畸形率、活動(dòng)率、密度。移取精液于15 ml錐形管內(nèi)，相對(duì)離心力900 g離心10 min，將精漿上層去除，用磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)沉淀物洗滌，用2倍體積的PBS將洗滌后的沉淀物懸浮，取1～2滴懸浮液，滴于明膠膜片上，保持溫度在37℃恒溫內(nèi)3 h，干燥后涂片、孵育、對(duì)其進(jìn)行觀察。

HYD檢測法：在0.2 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液中放入藥盒底膜片，緩沖液PH值為4，保持20 min，以矯正PH值。將以上的PBS精子懸浮液取1～2滴在藥盒底膜片上涂抹，并放在溫度為37℃的恒濕恒溫箱中孵育。孵育3 h后取出，并在室溫下進(jìn)行干燥，干燥后置于普通光鏡下對(duì)孵育結(jié)果觀察。ACE檢測法：把藥盒底膜片放入巴比妥鈉醋酸緩沖液當(dāng)中，10 s后取出，進(jìn)行干燥處理。干燥后將精子PBS懸浮液均勻鋪開在底膜片上1～2滴，放于溫度為37℃的恒溫恒濕箱當(dāng)中孵育，于2 h后取出，并在室溫下做干燥鏡檢［4］。

觀察組患者根據(jù)精子密度不同進(jìn)一步分組，其中M1組精子濃度＞40×106/ml，M2組精子濃度15～40×106/ml，M3組精子濃度＜15×106/ml。同時(shí)，根據(jù)精子活動(dòng)率不同進(jìn)一步分組，其中H1組PR＞50%，H2組PR32%～50%，H3組PR＜32%。

1.3評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［5～6］本次實(shí)驗(yàn)檢測用顯微鏡型號(hào)均為Leica DME，一般檢測所用視野六個(gè)左右即可，隨即選取200個(gè)精子頭部對(duì)其進(jìn)行觀察檢測。檢測結(jié)果顯示其頭部周圍存在不同程度的暈環(huán)情況即可判定為HYD或ACE陽性。確定陽性后，醫(yī)護(hù)人員需要選取專業(yè)合理的測微尺測量精子頭部周圍暈環(huán)的直徑，整理分析不同測量數(shù)據(jù)，最終得出平均值，根據(jù)該數(shù)值能夠?qū)YD或ACE的活性強(qiáng)度進(jìn)行判定。

1.4觀察指標(biāo)主要對(duì)兩組患者的精子密度及活性指標(biāo)進(jìn)行觀察，同時(shí)觀察分析實(shí)驗(yàn)組患者精子密度與ACE和HYD及精子活動(dòng)率與ACE和HYD之間的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將所有研究數(shù)據(jù)納入SPSS19.0軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)。判定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2　結(jié)果

2.1健康人與不育患者的精子密度及活性相關(guān)指標(biāo)比較HYD陽性率、活性強(qiáng)度及ACE陽性率和活性程度比較，實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組，而精子畸形率比較，則實(shí)驗(yàn)組較高，P＜0.05。見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組精子密度及活性指標(biāo)比較（±s）

表1　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組精子密度及活性指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別　n　HYD活性強(qiáng)度（μm）　HYD陽性（%）　精子畸形率（%）　ACE活性強(qiáng)度（μm）　ACE陽性（%）實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組20 50 tP 28.31±17.32*49.21±17.25 11.359 0.015 37.25±15.32*76.35±9.26 20.315 0.001 53.30±10.22*42.15±6.31 12.580 0.021 27.02±12.31*46.21±7.98 19.214 0.002 44.01±7.32*84.02±8.51 20.145 0.001

2.2不同精子密度下的相關(guān)指標(biāo)比較相比對(duì)照組而言，精子密度越低則ACE及HYD陽性和活性相關(guān)指標(biāo)越低，組間對(duì)比均經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證證實(shí)，P＜0.05。見表2。

表2　精子密度為因變量下的相關(guān)指標(biāo)比較±s）

表2　精子密度為因變量下的相關(guān)指標(biāo)比較±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別　n　ACE陽性（%）ACE活性強(qiáng)度（μm）HYD陽性（%）HYD活性強(qiáng)度（μm）M1組M2組M3組對(duì)照組9655 0 55.25±12.64*39.25±6.20*29.49±5.21*84.02±8.51 38.52±17.25*22.34±5.01*11.94±2.64*46.21±7.98 52.31±10.34*35.35±7.89*12.42±72.25*76.35±9.26 39.80±12.45*21.63±8.65*15.65±3.42*49.21±17.25

2.3不同精子活動(dòng)率下的相關(guān)指標(biāo)比較相比對(duì)照組而言，精子活動(dòng)率越低則ACE及HYD陽性和活性相關(guān)指標(biāo)越低，組間對(duì)比均經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證證實(shí)，P＜0.05。見表3。

表3　精子活動(dòng)率為因變量下的相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表3　精子活動(dòng)率為因變量下的相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

組別　n　ACE陽性（%）ACE活性強(qiáng)度（μm）HYD陽性（%）HYD活性強(qiáng)度（μm）H1組H2組H3組對(duì)照組10 555 0 51.14±12.32*40.25±6.21*33.51±5.23*84.02±8.51 38.52±17.25*22.34±5.21*12.97±2.65*46.21±7.98 47.25±15.02*29.35±7.54*25.15±76.25*76.35±9.26 37.31±15.32*22.98±3.65*15.65±3.42*49.21±17.25

3　討論

HYD在精子頂體內(nèi)酶組中發(fā)揮重要作用，其細(xì)胞顆粒在卵泡附近呈分散式分布，能促使精子通過。并利用相關(guān)酶系以及其他頂體蛋白酶，在配合作用下創(chuàng)造適宜于精子和卵子結(jié)合的環(huán)境條件［7］。在當(dāng)前醫(yī)學(xué)界對(duì)人體微觀認(rèn)知中，酶共有24種，除了HYD之外，另一種重要的酶就是ACE。ACE在精子獲能時(shí)形成透明帶，并與HYD相配合促進(jìn)精子通過。所以兩者均成為對(duì)精子活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)。加之兩者之間的配合關(guān)系，對(duì)HYD和ACE進(jìn)行協(xié)同檢測則能通過綜合反饋的信息，對(duì)男性生育能力做出準(zhǔn)確的評(píng)估［8］。另外，精子內(nèi)含HYD及ACE數(shù)量可以通過其頭部亮環(huán)進(jìn)行觀察而得出，一般來說亮環(huán)亮度越強(qiáng)、范圍越大則HYD及ACE數(shù)量也就越多，并且酶活性越高。

本次研究證實(shí)，ACE和HYD指標(biāo)均能有效反應(yīng)男性生育能力，通過兩者綜合測量能在常規(guī)檢查的基礎(chǔ)上提高診斷準(zhǔn)確率。從研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，男性不育癥患者精子畸形率較高，并且HYD陽性率、活性強(qiáng)度及ACE陽性率和活性程度比較結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組。相比對(duì)照組而言，精子密度越低則ACE及HYD陽性和活性相關(guān)指標(biāo)越低。精子活動(dòng)率越低則ACE及HYD陽性和活性相關(guān)指標(biāo)越低。綜上所述，HYD及ACE在男性生育能力中起到至關(guān)重要的作用，在對(duì)因不育的男性患者進(jìn)行臨床檢查時(shí)，應(yīng)采取ACE及HYD協(xié)同檢測方法，以加強(qiáng)診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。

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R698.2

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10.13638/j.issn.1671-4040.2016.05.012

2016-04-18）