丹參多酚鹽對動脈內(nèi)膜增生的影響及其機制研究

王書青，邱明科，代玉鑫，潘暢，汪洋，歐敬民

丹參多酚鹽對動脈內(nèi)膜增生的影響及其機制研究

王書青1，邱明科1，代玉鑫1，潘暢1，汪洋1，歐敬民1

目的 觀察丹參多酚鹽對大鼠頸動脈內(nèi)膜損傷后血管增生的影響，并探討其機制。方法 將18 只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、手術(shù)組、丹參多酚鹽組，每組6只，頸動脈內(nèi)膜損傷術(shù)后14 d分別檢測各組大鼠血清中白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β （TGF-β）水平，并取頸動脈切片作病理形態(tài)學觀察內(nèi)膜增生情況，測量血管新生內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）并計算IT/MT值，RT-PCR和Western Blot分別測定各組管壁 LOX-1mRNA和蛋白的表達變化。結(jié)果 大鼠頸動脈內(nèi)膜損傷后14 d可見血管內(nèi)膜增生，管腔狹窄；與假手術(shù)組比較，手術(shù)組管壁LOX-1mRNA和蛋白的表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），血清中促炎因子IL-6、TNF-α水平上升，抗炎因子IL-10、TGF-β水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與手術(shù)組比較，丹參多酚鹽組內(nèi)膜增生顯著減低，血清IL-6、TNF-α水平下降，IL-10、TGF-β水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），管壁LOX-1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；丹參多酚鹽組與假手術(shù)組比較，大鼠頸動脈IT、MT和IT/MT，血清中IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β水平，管壁LOX-1mRNA和蛋白表達水平，差異不具有統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。結(jié)論 丹參多酚鹽能有效抑制大鼠頸動脈內(nèi)膜損傷后內(nèi)膜的增生，抑制炎癥反應(yīng)，其機制可能與下調(diào)增生內(nèi)膜LOX-1表達有關(guān)。

丹參多酚鹽；內(nèi)膜增生；炎癥因子；LOX-1

動脈硬化是一組以血管管腔狹窄為主的退行性變和增生性病變疾病的總稱，主要病理變化為動脈管壁增厚、變硬，失去彈性［1］。自上世紀60年代以來，經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTA）由于其安全性在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，成為治療動脈狹窄性疾病的重要手段之一，但管腔術(shù)后再狹窄導(dǎo)致的遠期療效不甚滿意。丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的以丹參乙酸鎂為主要成分的化合物，具有抗炎［2］、抗氧化應(yīng)激［3］、免疫調(diào)節(jié)［4］等多重明顯心血管保護作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丹參多酚鹽能通過多種途徑保護血管內(nèi)皮細胞改善血管功能［5］。有關(guān)丹參多酚鹽能否抑制因血管內(nèi)膜損傷引起的血管增生相關(guān)研究較少，且相關(guān)機制未見文獻報道。因此本研究擬通過缺血再灌注損傷建立頸動脈內(nèi)膜增生的動物模型，再予以丹參多酚鹽干預(yù)，探討丹參多酚鹽對內(nèi)膜增生的影響及其作用機制。

1　材料和方法

1.1主要實驗材料 健康同齡雄性SD大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司；羊抗鼠LOX-1抗體，購自美國Abcam公司；大鼠白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、腫瘤壞死因子-β （TGF-β）檢測試劑盒，購自北京四正柏生物公司；丹參多酚鹽，購自上海綠谷制藥公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及造模 18只健康雄性SD大鼠，平均（200±30）g，隨機分為假手術(shù)組、手術(shù)組和丹參多酚鹽組，每組均6只。所有動物普通飼養(yǎng)2周后，用10％水化氯醛腹腔注射麻醉，尾靜脈注射肝素100 U/kg。頸部脫毛后用75％酒精消毒。取頸部正中切口，切口長3 cm。在氣管旁尋找到左頸總動脈。手術(shù)組用眼科鑷鈍性分離血管2 cm左右，用3號線結(jié)扎阻斷近心端的血流，遠心端在頸內(nèi)外動脈分叉處3號線結(jié)扎，夾閉血流30 min后松開絲線后逐層縫合皮下組織與皮膚。假手術(shù)組除不給予絲線結(jié)扎外，余操作步驟與手術(shù)組相同。丹參多酚鹽組自術(shù)前3 d至術(shù)后14 d腹腔注射丹參多酚鹽，劑量為5 mg/（kg·d），手術(shù)過程同手術(shù)組。各組SD大鼠術(shù)前、術(shù)后每日喂食普通飼料，自由飲水。

1.2.2取材及標本制備 術(shù)后14 d處死大鼠，常規(guī)分離血清和取病變明顯的頸總動脈約2.0 cm，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3光鏡下觀察血管形態(tài)學變化 多聚甲醛液固定的標本，梯度酒精逐步脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度為 5 μm，HE染色，在光鏡下觀察其病理學改變并拍照，用圖像分析系統(tǒng)測微尺測量內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）并計算IT/MT值。

1.2.4血清中IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β含量的測定 血清中IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β含量的測定，嚴格按ELISA試劑盒說明書進行定量測定。

1.2.5大鼠頸動脈LOX-1 mRNA的測定 取血管組織約100 mg迅速剪碎加1 ml Trizol試劑，置于組織勻漿器中勻漿，抽提總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度和純度。依據(jù)Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于ABI Prism7900 PCR儀進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μl。目標基因和內(nèi)參基因引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。LOX-1上游序列：5'-CCTCACCTGGAAGCTAA ACG-3'，下游序列：5'-CCTGCTCTTTGGATTTCTCG-3'。內(nèi)參β-actin上游序列： 5′-GGTGCTGAGTATGTCG TGGA-3'，下游序列：5′-CTTCTGAGTGGCA GTGATGG-3′。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 600 s，變性95℃ 15 s，退火60℃ 60 s，延伸72℃ 90 s，最后延伸600 s 40個循環(huán)，計算相對表達量。

1.2.6大鼠頸動脈LOX-1蛋白表達的檢測 取血管組織約50 mg加入RIPA裂解液（含PMSF）提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量。取各組總蛋白30 μg進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以5％ BSA封閉1 h，加入一抗于4℃孵育過夜。再加入1：5000倍稀釋的二抗，37℃孵育1 h，PBS洗滌，顯影，定影。 將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，SPSS 17.0統(tǒng)計軟件被用來做所有的統(tǒng)計學分析。三組均數(shù)比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。對于所有的統(tǒng)計分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1血管壁病理形態(tài)學觀察 HE染色的結(jié)果顯示，動脈內(nèi)膜缺血灌注損傷2周后，手術(shù)組大鼠頸總動脈有明顯的內(nèi)膜增生，管腔不均一狹窄，內(nèi)膜平滑肌細胞增生，中膜可見增厚（圖1B）；假手術(shù)組大鼠頸總動脈內(nèi)膜可見單層內(nèi)皮細胞，動脈彈力層結(jié)構(gòu)清楚（圖1A）；丹參多酚鹽組血管內(nèi)膜增生不明顯，可見多層內(nèi)膜細胞（圖1C）。

2.2動脈管壁的增生的情況 與假手術(shù)組比較，手術(shù)組IT、MT和IT/MT明顯增大，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與手術(shù)組比較，丹參多酚鹽組IT、MT和IT/MT明顯減低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；丹參多酚鹽組與假手術(shù)組比較，IT、MT和IT/MT差異無統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）（表1）。

2.3大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β水平的測定 ELISA法檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠血清中促炎因子IL-6和TNF-α水平增高，抗炎因子IL-10和TGF-β水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與手術(shù)組比較，丹參多酚鹽組大鼠血清中促炎因子IL-6和TNF-α水平增高，抗炎因子IL-10和TGF-β水平減低，差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；與假手術(shù)組比較，丹參多酚鹽組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β水平差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），（圖2）。

2.4大鼠頸動脈LOX-1 mRNA的表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，手術(shù)組頸動脈組織LOX-1 mRNA表達增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與手術(shù)組比較，丹參多酚鹽組頸動脈組織LOX-1 mRNA的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.5大鼠頸動脈LOX-1蛋白的表達 Western Bolt測定結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，手術(shù)組LOX-1蛋白的表達變化增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）；與手術(shù)組比較，丹參多酚鹽組LOX-1蛋白的表達變化降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），與假手術(shù)組比較，丹參多酚鹽組大鼠管壁組織LOX-1蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4）。

圖1　大鼠頸動脈內(nèi)膜損傷后14 d頸動脈切片光鏡觀察結(jié)果（A：假手術(shù)組；B：手術(shù)組；C：丹參多酚鹽組；HE染色；×10/×20）

表1　動脈內(nèi)膜損傷后血管內(nèi)膜增生的影響

圖2　大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β水平的測定（與假手術(shù)組比較，bP＜0.01；與手術(shù)組比較，cP＜0.05，dP＜0.01）

3　討論

動脈硬化是一組以血管管腔狹窄為主的退行性變和增生性病變疾病的總稱。由于生活水平的提高，生活方式及食物結(jié)構(gòu)的變化，使本病的發(fā)生率逐年增高。動脈粥樣硬化（AS）是動脈硬化疾病中常見的類型，也是并發(fā)嚴重心血管意外主要病因之一［6，7］。其中，下肢動脈硬化閉塞癥（ASO）已成為導(dǎo)致患者肢體殘疾的重要病因之一。自上世紀60年代以來， PTA由于其創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)勢在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，成為治療動脈狹窄性疾病的重要手段之一。經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA）包括球囊擴張術(shù)和血管內(nèi)支架置入術(shù)，短期療效顯著，能迅速開通血管，改善組織或器官的缺血狀況。但遠期療效不甚滿意，術(shù)后再狹窄率高達20％～35％［8］。據(jù)研究報道，腘動脈支架置入術(shù)后1年再狹窄率高達20％～60％［9，10］。血管的彈性回縮、血管負性重塑及內(nèi)膜過度增生是公認的三大術(shù)后再狹窄的原因［11，12］，但確切的機制尚不明確。其中內(nèi)膜增生占到了PTA術(shù)后再狹窄的40％左右［13］。

圖3　大鼠頸動脈LOX-1 mRNA的表達（與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與手術(shù)組相比，cP＜0.05）

圖4　大鼠頸動脈LOX-1 蛋白的表達（與假手術(shù)組相比，bP＜0.01；與手術(shù)組相比，cP＜0.05）

上世紀九十年代學者Ross［14］首先提出AS的免疫炎癥學說后，該學說被逐漸證實，使得該學說在AS發(fā)病中的機制受到人們越來越多的關(guān)注。既往研究提示，慢性炎癥反應(yīng)貫穿AS的整個過程，眾多炎性介質(zhì)參與其中，形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在PTA術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。促炎因子 （如IL-6、IL-1、TNF-α等）與抗炎因子（如IL-4、IL-10、TGF-β）相互作用，通過改變體內(nèi)物質(zhì)代謝、能量代謝和細胞（包括免疫細胞和VSMCs等）的生物學特性等，造成了血管壁結(jié)構(gòu)紊亂，最終決定了AS和PTA術(shù)后再狹窄的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。本實驗中，手術(shù)組大鼠血清促炎因子IL-6和TNF-α水平增高，抗炎因子IL-10和TGF-β水平減低，且內(nèi)膜增生明顯，進一步證實免疫炎癥參與AS的過程。

LOX-1是一種新型ox-LDL受體，屬于C類血凝素家族，與已知的ox-LDL受體，包括A類和B類清道夫受體以及CD68都沒有同源性［15］。LOX-1除介導(dǎo)ox-LDL作用外，LOX-1還可以誘導(dǎo)ROS生成，經(jīng)過一系列的級聯(lián)反應(yīng)使Fas/Bcl-2失衡，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞遷移及增殖［16，17］，引起管腔狹窄。本實驗發(fā)現(xiàn)在頸動脈內(nèi)膜損傷組管壁LOX-1的表達顯著增高，提示LOX-1 與AS具有一定相關(guān)性。既往研究顯示，一些與致動脈硬化有關(guān)的因素刺激TNF-α、佛波醇酯、AT-Ⅱ、血流切應(yīng)力等都可引起內(nèi)皮細胞LOX-1表達增強［18］；減少LOX-1 的表達能起到抗血栓抗AS 的作用［19］，亦提示LOX-1在動脈粥樣硬化病理變化過程中起著關(guān)鍵的作用。

丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的以丹參乙酸鎂為主要成分的化合物，是中藥丹參主要活性成分。近年基礎(chǔ)研究顯示，其在動脈硬化、減輕心臟缺血再灌注損傷、降低心臟耗氧量、抑制血小板聚集和防治血栓形成等方面具有明顯的作用，臨床上也已廣泛應(yīng)用于冠心病的治療［20］。吳蘭等研究表明，丹參多酚酸鹽對Cu2+誘導(dǎo)的氧化修飾有較強的抑制作用，提示其對防治動脈粥樣硬化有重要意義［21］。Huang等研究表明，丹參多酚酸鹽能誘導(dǎo)新生血管內(nèi)膜細胞凋亡，而凋亡對細胞的數(shù)量起穩(wěn)定作用，從而可以防止血管內(nèi)膜的增厚，預(yù)防再狹窄［22］。丹參多酚酸鹽作用機制涉及自由基清除、降低細胞內(nèi)膽固醇及其酯的合成、提高內(nèi)皮細胞抗氧化酶的活力以及抑制某些細胞因子的分泌等［3］。我們研究結(jié)果顯示，丹參多酚鹽能有限抑制手術(shù)組大鼠頸動脈內(nèi)膜的增生，降低血清中促炎因子的濃度，增加抗炎因子，同時下調(diào)管壁LOX-1的表達。

綜上所述，丹參多酚鹽通過增加機體抗炎因子，而降低促炎因子的濃度，并降低增生動脈LOX-1的表達，提示丹參多酚鹽抗AS作用可能與下調(diào)LOX-1表達有關(guān)，此將有助于推進以丹參多酚酸鹽為代表的中藥防治AS提供新的思路與理論支持。但丹參多酚鹽如何通過LOX-1抗AS細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制尚未清楚，有待于進一步研究。

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本文編輯：李楊，田國祥

The mechanism and effect of salvianolate on the proliferation of vascular intima

WANG Shu-qing*， QIU Ming-ke， DAI Yu-xin， PAN Chang， WANG Yang， OU Jing-min. *Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200092

OU Jing-min； E-mail： jingminou@163.com

Objective To observe the effect of salvianolate on the proliferation of vascular intima and study mechanism behind. Methods 18 SD rats were randomly divided into sham operation group， operation group，salvianolate group. After operation for 14 days， IL-6， IL-10， TNF-α and TGF-β levels were measured in serums， and pathological morphology of carotid artery sections were observed， including the intimal hyperplasia，intimal thickness （IT）， Medium thickness （MT） and calculate IT/MT value. RT-PCR and Western Blot were used to measure the expression of LOX-1 mRNA and proteins in vascular. Results Intimal hyperplasia and vascular luminal stenosis were observed at 14 days in the rat carotid artery after vascular intimal injury. Compared with sham operation group， the expression of LOX-1 mRNA and proteins in operation group were increased in vascular walls （P＜0.05）. IL-6， TNF-α levels in serum were increased， while IL-10， TGF-β levels were decreased （P＜0.05）. Compared with the operation group， the intimal hyperplasia was significantly decreased in the salvianolate group， as well as serum IL-6 and TNF-α levels. However， IL-10 and TGF-β levels were increased （P＜0.05）， and LOX-1 mRNA and proteins expression level significantly were decreased （P＜0.05）. There was no statistic difference between salvianolate group and sham operation group in above items （P＞0.05）. Conclusion Salvianolate can effectively inhibit the intimal hyperplasia and inflammatory response after carotid artery injury， it may be related to the downregulation of the expression of LOX-1 in intimal hyperplasia.

Salvianolate； Intimal hyperplasia； Inflammatory factor； LOX-1

R543.5

A

1674-4055（2016）06-0749-04

1200092 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院

歐敬民，E-mail：jingminou@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.06.32