三種豬肝DNA粗提取方法的比較

周穎慧 胡雪峰

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 350108)

“DNA的粗提取與鑒定”是高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。豬肝易獲取且DNA含量豐富，適合作為實(shí)驗(yàn)材料。經(jīng)查閱資料發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有豬肝粗提取DNA的方法中，存在破裂細(xì)胞膜不徹底和粗提取DNA過(guò)程不能很好除雜的問(wèn)題，這些都對(duì)實(shí)驗(yàn)效果有一定的影響。為改良實(shí)驗(yàn)效果，本文設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別用洗滌劑和SDS破裂細(xì)胞膜、改進(jìn)實(shí)驗(yàn)除雜方法，比較了三種方法的實(shí)驗(yàn)效果，提出了優(yōu)化方案。

1 實(shí)驗(yàn)原理

DNA位于細(xì)胞核中，可以使用洗滌劑裂解細(xì)胞膜與核膜，釋放細(xì)胞核中的DNA。DNA在1～2 mol/L氯化鈉溶液中溶解度較大，釋放出來(lái)的DNA可較大量地溶解在氯化鈉溶液中。溶解后的DNA中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，65℃高溫使蛋白質(zhì)變性，而DNA不降解。此外，還根據(jù)DNA不溶于酒精溶液，而細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可溶解于酒精溶液，得到雜質(zhì)更少的DNA。

洗滌劑裂解細(xì)胞膜，其有效成分是SDS。SDS除了能夠裂解細(xì)胞膜與核膜，還能與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合，當(dāng)溶液中SDS遇到鉀離子時(shí)，鉀離子可以置換SDS中的鈉離子，而產(chǎn)生不溶于水的PDS沉淀從而可以去除蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)利用二苯胺鑒定DNA，其原理是DNA在高溫和強(qiáng)酸的條件下，嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，2-脫氧核糖脫水后生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，后者與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)。利用這一原理，在配制試劑時(shí)增加強(qiáng)酸的量[1]，將產(chǎn)生更多的ω-羥基-γ-酮基戊醛與二苯胺試劑反應(yīng)，顯色效果更明顯。

2 材料用具

新鮮豬肝、2 mol/L的氯化鈉溶液、蒸餾水、洗潔精、10%SDS溶液、10%氯化鉀溶液、95%乙醇、二苯胺試劑，量筒、燒杯、試管、玻璃棒、試管夾、紗布、水浴鍋、標(biāo)簽紙、剪刀、研缽、水浴鍋、離心機(jī)。

二苯胺試劑的配制：量取100 mL的冰醋酸至燒杯中，再沿?zé)瓋?nèi)壁緩慢加入15 mL濃硫酸，邊加邊攪拌，待溶液冷卻后，稱(chēng)取加入2 g二苯胺，攪拌至二苯胺完全溶解后，倒入棕色瓶保存[1]。(二苯胺試劑有毒，使用時(shí)需注意安全，建議鑒定時(shí)試劑由老師幫學(xué)生加入)

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 制取豬肝研磨液 ①稱(chēng)取3 g新鮮豬肝，加入2 g食鹽，用剪刀把豬肝剪到盡可能碎，在研缽中快速研磨成勻漿；②用量筒量取20 mL蒸餾水加入研缽中，攪拌成勻漿后轉(zhuǎn)移到燒杯。

3.2 提取DNA濾液 應(yīng)用三種方法提取DNA濾液(表1)：

表1 三種方法提取DNA濾液的步驟

3.3 加酒精沉淀DNA 量筒量取2倍濾液體積的95%乙醇沿著燒杯壁緩慢加入濾液中。靜置3 min，可見(jiàn)白色絮狀物生成。

3.4 鑒定 ①取4支試管,分別編為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)，各加入2 mL的2 mol/L氯化鈉溶液；②將上述三種方法得到的白色絮狀物分別溶解在對(duì)應(yīng)試管。其中，編號(hào)1：空白組(不加)；編號(hào)2：方法1組得到的白色絮狀物；編號(hào)3：方法2組得到的白色絮狀物；編號(hào)4：方法3組得到的白色絮狀物；③向4支試管中各加入2 mL的二苯胺試劑；④混合均勻后，將試管置于沸水浴中加熱5 min，待試管冷卻后觀察顏色變化。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

豬肝DNA的三種提取方法中，方法3顯色效果最好，顏色深藍(lán)且純凈，方法2比方法1的顯色更深，但藍(lán)色溶液渾濁(表2)。用雙縮脲去鑒定方法2的白色絮狀物質(zhì)，結(jié)果呈紫色。根據(jù)現(xiàn)象進(jìn)行推測(cè)，雜質(zhì)中應(yīng)該含有大量的蛋白質(zhì)，可能是與SDS結(jié)合的蛋白沒(méi)有除去，這部分蛋白與二苯胺反應(yīng)干擾了顯色。方法3通過(guò)加鉀離子沉淀SDS蛋白復(fù)合物，可以把這部分蛋白去除，起到很好的除雜作用，實(shí)驗(yàn)效果有明顯的提高。

綜上所述，豬肝DNA的提取方法3用SDS裂解細(xì)胞膜再通過(guò)沉淀SDS蛋白復(fù)合物除雜的綜合實(shí)驗(yàn)效果最為理想。用時(shí)基本能控制在45 min內(nèi)(表2)。在實(shí)際教學(xué)中，豬肝研磨液可由教師在課前統(tǒng)一制備，學(xué)生實(shí)驗(yàn)用時(shí)可進(jìn)一步縮短。

表2三種DNA提取方法的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象比較

方法材料用量析出DNA狀態(tài)顯色情況顏色透明度實(shí)驗(yàn)用時(shí)13g豬肝顏色偏黃淺藍(lán)色透明36min23g豬肝顏色略黃藍(lán)色略渾濁36min33g豬肝顏色潔白深藍(lán)色透明42min