雙正交法優(yōu)化醇洗-水提黑皮雞樅菌多糖的研究*

孫　凱　郭曉萌　牟德華　李　艷，***（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊　05008）（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊　05008）

雙正交法優(yōu)化醇洗-水提黑皮雞樅菌多糖的研究*

孫凱1**郭曉萌1牟德華1李艷1，2***
1（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）
2（河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018）

采用雙正交法優(yōu)化黑皮雞樅菌的多糖提取率，為其深加工和多糖產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。首先采用正交試驗(yàn)優(yōu)化黑皮雞樅菌多糖提取中的醇洗工藝條件，然后再采用正交試驗(yàn)優(yōu)化其水提工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，每1 g黑皮雞樅菌粉加入25 mL水浸潤，并調(diào)整乙醇體積濃度為80%，超聲30 min，洗滌1次，離心去除上清液后的殘?jiān)?0 mL去離子水，在沸水中提取30 min，反復(fù)提取3次，測定合并液的多糖含量，最終多糖提取率達(dá)到92.21%，該工藝簡單，無有機(jī)溶劑，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

黑皮雞樅菌；多糖；正交試驗(yàn)；醇洗；水提

大型子實(shí)體真菌具有豐富的營養(yǎng)和多種對人體有益的功效成分，傳統(tǒng)中醫(yī)也常將其作為主要或者輔助藥材用于治療疾病和保健養(yǎng)生。食用菌多糖是食用菌中最主要的生物活性成分之一，能起到免疫調(diào)節(jié)劑的作用，在增強(qiáng)免疫力、降血糖、治療高血壓、治療腫瘤疾病以及病毒性疾病等方面具有很好的療效。雞樅菌（Termitomyces albuminosus） 是一種世界范圍內(nèi)的珍貴食藥用菌，也叫傘把菇，白蟻菇，生物學(xué)分類地位為真菌界，擔(dān)子菌門，擔(dān)子菌綱，傘菌目，口蘑科，雞樅菌屬（Termitomyces）。全世界共有雞樅菌28種，其中黑皮雞樅菌品質(zhì)最佳，以多糖為代表的雞樅菌生物活性物質(zhì)具有調(diào)節(jié)生物反應(yīng)、抑制癌細(xì)胞生長、降低血壓和膽固醇的作用。最近幾年，我國科研工作者成功將黑皮雞樅菌實(shí)現(xiàn)人工栽培，為生理活性物質(zhì)提取及產(chǎn)品開發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。目前已有諸多學(xué)者研究黑皮雞樅菌的栽培技術(shù)、固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，以及皂甙等有效成分的功效，但未見黑皮雞樅菌多糖提取工藝優(yōu)化和產(chǎn)品開發(fā)的研究報(bào)道。本文以人工栽培的黑皮雞樅菌粉為原料，采用2次正交試驗(yàn)組合優(yōu)化黑皮雞樅菌多糖提取的醇洗和水提工藝參數(shù)，目的是提高多糖提取率，為黑皮雞樅菌多糖產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

原料：人工栽培黑皮雞樅菌粉，由北京金珠滿江生物科技有限公司提供。

試劑：濃硫酸、葡萄糖，天津永大化學(xué)試劑有限公司；苯酚，天津市博迪化工有限公司；體積濃度95%乙醇，石家莊新宇三陽實(shí)業(yè)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

精密電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋、鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ5200型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LXJ-IIB離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1原料多糖含量的測定

依照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NYT 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》中的方法測定黑皮雞樅菌粉原料中的多糖含量，試驗(yàn)時(shí)先將原料進(jìn)行干燥，恒重后測定，所有試驗(yàn)平行測定3組。

1.3.2黑皮雞樅菌多糖提取工藝流程

雞樅菌粉→加水浸潤→乙醇洗滌→超聲處理→水提多糖→提取液濃縮→多糖含量測定

1.3.3正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取的醇洗工藝條件

以乙醇體積濃度（%）、超聲時(shí)間（min）和醇洗次數(shù)為變化因素，進(jìn)行三水平正交優(yōu)化組合，確定最佳醇洗工藝條件。固定超聲功率200 W，水提多糖條件為：1 g菌粉的醇洗沉淀加去離子水50 mL，100℃水浴提取1 h，重復(fù)2次，測定合并液的多糖含量，計(jì)算多糖提取率。醇洗正交優(yōu)化試驗(yàn)因素水平見表1。

表1　多糖提取時(shí)醇洗工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

1.3.4正交試驗(yàn)優(yōu)化水提多糖的工藝條件

在正交試驗(yàn)優(yōu)化醇洗工藝的基礎(chǔ)上，對水提多糖步驟進(jìn)行正交優(yōu)化。以加水量、水提次數(shù)和時(shí)間為變化因素，以多糖提取率為評價(jià)值，正交優(yōu)化組合試驗(yàn)的因素水平見表2。

表2　水提雞樅菌多糖工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

1.3.5多糖提取率的計(jì)算

多糖提取率定義為提取液中的多糖質(zhì)量占原料中多糖質(zhì)量的百分比。提取液中的多糖質(zhì)量根據(jù)苯酚-硫酸法，在490 nm處測定的黑皮雞樅菌多糖提取液吸光度與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得，原料中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)依照步驟1.3.1進(jìn)行測定，多糖提取率的計(jì)算公式為：

式中：A——多糖提取率，%；

m——提取得到的多糖質(zhì)量，g；

M——原料含有的多糖質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1原料多糖含量及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

經(jīng)檢測黑皮雞樅菌粉中粗多糖的含量為5.63%，比金針菇（4.49%）和雙孢菇（4.34%）的粗多糖含量高，但比白靈菇（7.24%）、平菇（8.37%）、香菇（6.79%）和杏鮑菇（6.37%）的低。

用苯酚-硫酸法建立的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=6.026 6x-0.001 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值存在良好的線性關(guān)系。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取時(shí)的醇洗工藝條件

黑皮雞樅菌粉中除含有多糖外還含有其他多種雜質(zhì)，在提取多糖前對原料進(jìn)行預(yù)處理可改善提取效果，方法有脫色、脫脂、微波處理、超微粉碎等，如甲醇脫脂，正丁醇法除蛋白，活性炭吸附脫色等。本研究采用乙醇洗滌工藝，乙醇為非電解質(zhì)，不會發(fā)生電離，采用乙醇處理不改變原料性質(zhì)，并可溶解原料中的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)類等非多糖類雜質(zhì)，有助于黑皮雞樅菌多糖的溶出，還有研究表明滲入原料中的乙醇在加熱后會發(fā)生內(nèi)部的沸騰，從而強(qiáng)化多糖提取的效果，更重要的是乙醇無毒，符合食品安全要求。

超聲波法廣泛用于輔助有效成分提取，超聲波的機(jī)械能對細(xì)胞壁有破壞作用，能增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)，有利于胞內(nèi)成分的溶出?？紤]到成本和操作的可實(shí)現(xiàn)性，選用超聲波法輔助醇洗工藝。以乙醇濃度、超聲處理時(shí)間和洗滌次數(shù)為變化因素的三因素三水平醇洗正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

從表3中可以看出，多糖提取率最高為90.64%，試驗(yàn)條件是乙醇體積濃度80%，超聲時(shí)間30 min，洗滌1次。影響黑皮雞樅菌多糖提取率的因素主次順序?yàn)椋捍枷创螖?shù)＞乙醇體積濃度＞超聲時(shí)間。乙醇洗滌次數(shù)增加，多糖提取率反而降低。黑皮雞樅菌多糖提取率隨乙醇體積濃度的提高而增加。由此確定，黑皮雞樅菌多糖提取的醇洗工藝步驟最佳條件為：乙醇體積濃度80%，超聲時(shí)間30 min，洗滌1次，此工藝條件下多糖提取率為90.64%。

表3　多糖提取時(shí)醇洗工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化水提多糖的工藝條件

食用菌多糖提取的方法很多，包括溶劑提取法、酸堿提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法等，本研究依據(jù)黑皮雞樅菌多糖易溶于熱水的原理，采用沸水提取，將加水量、提取次數(shù)和提取時(shí)間作為影響黑皮雞樅菌多糖提取的主要因素，進(jìn)行多糖提取率的評價(jià)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　水提雞樅菌多糖工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表

從表4結(jié)果可以看出，影響黑皮雞樅菌多糖提取率的因素主次順序?yàn)椋核岽螖?shù)＞加水量＞水提時(shí)間。水提次數(shù)越多，多糖提取率越高。從極差R值可以看出，加水量和水提時(shí)間對黑皮雞樅菌多糖提取效果的影響程度相似。通過均值K1、K2、K3可以看出最理想的提取條件為加水量50 mL，水提3次，每次水提30 min，此工藝條件下多糖提取率達(dá)到92.19%。

綜合黑皮雞樅菌多糖提取的醇洗和水提雙正交最佳工藝條件，再進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到粗多糖提取平均為92.21%。在此條件下放大到千克以上中試獲得同樣效果，較相關(guān)文獻(xiàn)中的多糖提取率有較大程度提高。

3　結(jié)論

黑皮雞樅菌多糖提取的最佳工藝條件為，每1 g黑皮雞樅菌粉，加25 mL水浸潤，調(diào)整乙醇體積濃度為80%，進(jìn)行超聲處理30 min，離心棄去上清液回收乙醇，殘?jiān)皿w積濃度80%乙醇懸浮洗滌離心1次，加水50 mL，沸水提取3次，每次30 min，多糖提取率92.21%。該工藝簡單、無有機(jī)溶劑殘留、符合食品安全要求，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］ SULLIVAN R，ROWAN N J，SMITH J E.Medicinal mushrooms and cancer therapy：translating a traditional practice into Western medicine［J］.Perspectives in biology and medicine，2006，49（2）：159-170.

［2］ ElENSHASYHA，HATTI-KAULR.Mushroom immunomodulators：uniquemoleculeswithunlimited applications［J］.Trends in biotechnology，2013，31（12）：668-677.

［3］ VETVICKA V，VETVICKOVA J.Immune enhancing effects of WB365，a novel combination of ashwagandha （withania somnifera）and maitake（grifola frondosa）extracts ［J］.North American journal of medical sciences，2011，3 （7）：320.

［4］ 劉蘇，姜玥，羅建平，等.5種食用菌多糖理化性質(zhì)及免疫活性的比較研究［J］.食品科學(xué)，2015，36（13）：252-256.

［5］ 代榮，劉如明，肖建輝.菌類中藥多糖降血糖效應(yīng)機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2015，40（2）：174-179.

［6］ 喬進(jìn)，薛華，孟國梁，等.靈芝多糖對2型糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮功能的保護(hù)作用［J］.中國動(dòng)脈硬化雜志，2009（9）：709-713.

［7］ KIDD P M.The use of mushroom glucans and proteoglycans in cancer treatment［J］.Alternative Medicine Review，2000，5（1）：4-27.

［8］ WU L P，WU Z J，LIN D，et al.Characterization and amino acid sequence of y3，an antiviral protein from the mushroom Coprinus comatus［J］.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2008，24（7）：597-603.

［9］ AANEN D K，ROS V I D，LICHT H H F，et al.Patterns of interactionspecificityoffungus-growingtermitesand termitomycessymbiontsinSouthAfrica［J］.BMC evolutionary biology，2007，7（1）：1.

［10］章笑.從蟻窩中長出的美味菌——雞樅［J］.云南林業(yè)，2006，27（5）：30.

［11］張玉金，郭華春，李榮春.雞樅的馴化栽培現(xiàn)狀［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010（10）：1 288-1 292.

［12］黎勇，王小丹，付前發(fā)，等.黑皮雞樅菌的人工栽培技術(shù)研究［J］.食用菌，2012（1）：37-39.

［13］付前發(fā)，王曉東，王菊瓊，等.黑雞樅菌的分離純化及固液體培養(yǎng)特性研究［J］.食用菌，2013（4）：18-19.

［14］薛林浩，王曉東，蔡虹，等.黑皮雞樅菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（10）：24-27.

［15］聶曉東.雞樅菌絲體及其皂甙的深層發(fā)酵條件的優(yōu)化［D］.無錫：江南大學(xué)，2009.

［16］趙艷，畢榮宇，牟德華.利用酶標(biāo)儀測定6種食用菌中多糖含量［J］.食用菌，2013（1）：59-61.

［17］羅璽，唐慶九，張勁松，等.靈芝多糖樹脂法脫色工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2011，32（16）：5-10.

［18］王守現(xiàn)，劉宇，趙爽，等.平菇多糖提取工藝中脫脂方法研究［J］.北方園藝，2010（17）：215-216.

［19］CHEN C，SHAO Y，TAO Y，et al.Optimization of dynamic microwave-assisted extraction of Armillaria polysaccharides using RSM，and their biological activity［J］.LWT-Food Science and Technology，2015，64（2）：1 263-1 269.

［20］李婷婷，楊焱，劉艷芳，等.超微粉碎對桑黃子實(shí)體粗多糖理化性質(zhì)和刺激巨噬細(xì)胞活性的影響［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（2）：333-337.

［21］SUN Y，LIANG H，ZHANG X，et al.Structural elucidation and immunological activity of a polysaccharide from the fruitingbodyofArmillariamellea［J］.Bioresource Technology，2009，100（5）：1 860-1 863.

［22］陳曉光，韋藤幼，彭夢微，等.內(nèi)部沸騰法提取香菇多糖的工藝優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2011，32（10）：31-34.

［23］CHEUNG Y C，WU J Y.Kinetic models and process parameters for ultrasound-assisted extraction of water-soluble components and polysaccharides from a medicinal fungus［J］. Biochemical Engineering Journal，2013，79：214-220.

［24］ZHENG Y，LI Y，WANG W.Optimization of ultrasonicassisted extraction and in vitro antioxidant activities of polysaccharides from Trametes orientalis［J］.Carbohydrate polymers，2014，111：315-323.

［25］CHEUNG Y C，SIU K C，LIU Y S，et al.Molecular properties and antioxidant activities of polysaccharide-protein complexes from selected mushrooms by ultrasound-assisted extraction［J］.Process Biochemistry，2012，47（5）：892-895.

［26］張黎明，李珊，谷守娜，等.堿法一步提取鮮山藥中多種水溶性成分的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2011（5）：242-244.

［27］王大為，單玉玲.超臨界CO2萃取對蒙古口蘑多糖提取率的影響［J］.食品科學(xué)，2006，27（3）：107-110.

Optimization ofethanolleaching-water extraction oftermitornyces badius polysaccharides by double orthogonaltest*

SUN Kai1**GUO Xiaomeng1MOU Dehua1LI Yan1，2***
1（College ofbioscience and bioengineering，Hebei universityofscience and technology，Hebei Shijiazhuang 050018，China）
2（R&Dcenter for fermentation engineeringofHebei province，Hebei Shijiazhuang 050018，China）

The double orthogonal test was employed toimprove the extractionrate ofT.badius polysaccharides,and the relatively high extraction rate laid the foundation of deep processing and polysaccharides products development.In this trial,the first orthogonal method was used to optimize ethanol leaching process and the second orthogonal method was used tooptimize water extraction process.Result was that each mushroomsample at 1gwas mixed with distilled water and ethanol（ethanol concentration:80%,total volume:25 mL）and placed it in a ultrasonic cleanerfor 30 min once.The precipitatecollectedbycentrifugationwasextractedwith50mLdistilled water at100℃for 3times（30 min each time）. After extraction,thepolysaccharidescontentofliquid extract was determined and the rate ofT.badiuspolysaccharides was 92.21%.This optimal extraction technology is suitable for industrial production because of its simple and no organic solvent.

termitornyces badius；polysaccharides；orthogonal test；ethanol leaching；water extraction

2016-04-28

TS251.6+7

A

1673-6044（2016）02-0035-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.02.011

2015年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2015016）。
**孫凱，男，1994年出生，河北科技大學(xué)發(fā)酵工程專業(yè)，在讀碩士研究生。
***李艷，通訊作者，E-mail：lymdh58852@163.com.