mTOR信號通路調(diào)控1,25二羥維生素D3抑制喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞增殖的研究*

桂明才，李　兵，戚思國，周長華

(1.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 635000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，重慶400016)

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·論著·

mTOR信號通路調(diào)控1,25二羥維生素D3抑制喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞增殖的研究*

桂明才1，李兵2△，戚思國1，周長華1

(1.四川省達(dá)州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 635000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，重慶400016)

目的研究1,25二羥維生素D3抑制喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞增殖作用以及對雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的影響。方法用不同劑量1,25二羥維生素D3(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)分別處理Hep-2細(xì)胞24、48、72 h，四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測Hep-2細(xì)胞的增殖情況，并計(jì)算抑制率；采用流式細(xì)胞儀分析1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞周期分布的影響，Western blot檢測1,25二羥維生素D3對mTOR信號通路的影響。結(jié)果不同濃度1,25二羥維生素D3均可抑制Hep-2細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞周期分布,使G0/G1期Hep-2細(xì)胞比例增高。1,25二羥維生素D3干預(yù)后Hep-2細(xì)胞TSC1、TSC2蛋白表達(dá)較對照組增高(P<0.01)，Rheb蛋白表達(dá)明顯降低；mTOR蛋白及其磷酸化水平表達(dá)與對照組比較均降低(P<0.01)，mTOR蛋白磷酸化表達(dá)降低尤為明顯(P<0.01)；4EBP-1蛋白表達(dá)較對照組增高(P<0.01)。結(jié)論1,25二羥維生素D3改變喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞周期分布，影響mTOR信號通路蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖。

1,25二羥維生素D3；Hep-2細(xì)胞；增殖抑制；雷帕霉素靶蛋白

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種重要的調(diào)節(jié)基因，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞能量代謝等途徑發(fā)揮生理功能，在細(xì)胞增殖、生長、分化過程中起核心調(diào)控作用。mTOR還參與感受營養(yǎng)信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與增殖[1]。維生素D傳統(tǒng)上被認(rèn)為是一種脂溶性維生素。1,25二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]是維生素D的活性形式。1,25(OH)2D3除了經(jīng)典的調(diào)節(jié)腎、腸道的鈣、磷代謝外，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的作用[2]，其中對腫瘤細(xì)胞的影響近年來倍受關(guān)注。本研究旨在觀察1,25(OH)2D3抑制喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞增殖及其對mTOR信號通路的影響，初步探討1,25(OH)2D3對Hep-2細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料人喉上皮樣癌Hep-2 細(xì)胞株購自南京凱基生物有限公司；TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、p-mTOR和β-actin 單克隆抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化酶標(biāo)記物山羊抗小鼠IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；1,25(OH)2D3及雷帕霉素購自美國Sigma公司，溶于RPMI1640 培養(yǎng)基制成10 mmol/L的母液，過濾除菌后-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組人喉癌Hep-2 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1 640 培養(yǎng)液中，置入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳及飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行分組：對照組，干預(yù)組1[1,25(OH)2D3濃度為10-8mol/L]，干預(yù)組2[1,25(OH)2D3濃度為10-7mol/L]，干預(yù)組3[1,25(OH)2D3濃度為10-6mol/L]，雷帕霉素組(雷帕霉素濃度20 nmol/L)。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后各取出1塊培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，孵育4 h，棄上清液加入DMSO終止反應(yīng)，振蕩10 min，于波長570 nm處測吸光度(OD)值。細(xì)胞抑制率(%)=(OD陰性對照-OD實(shí)驗(yàn))/OD陰性對照×100%。

1.2.3細(xì)胞周期檢測將培養(yǎng)48 h的細(xì)胞用PBS沖洗后快速注入裝有預(yù)冷750 mL/L乙醇1 mL的EP管中，混勻，4 ℃過夜。將等體積的細(xì)胞懸液和碘化丙啶(PI)染液混合，4 ℃放置30 min，以激發(fā)波長488 nm測定，死亡細(xì)胞呈紅色熒光，以健康人淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)參數(shù)，數(shù)據(jù)用Modifit1.0軟件分析。計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%。

1.2.4Western blotting檢測各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白。凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。封閉后加稀釋一抗抗體(靶蛋白抗體)4 ℃過夜。加入稀釋的二抗室溫孵育2 h，顯色，曝光、顯影和定影。吸光度掃描分析后計(jì)算各組細(xì)胞靶蛋白相對表達(dá)量。

2　結(jié)　果

2.11,25(OH)2D3對Hep-2細(xì)胞增殖的抑制作用1,25(OH)2D3在10-6～10-8mol/L濃度對Hep-2細(xì)胞增殖均有抑制作用，但程度不同，各劑量組對癌細(xì)胞的抑制率見圖1。3個(gè)劑量組對喉癌細(xì)胞的抑制率隨作用時(shí)間的延長以及藥物濃度的上升而增加，且呈時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：A為對照組；B為1,25(OH)2D3濃度10-8mmol/L；C為1,25(OH)2D3濃度10-7mmol/L；D為1,25(OH)2D3濃度10-6mmol/L。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖11,25(OH)2D3對Hep-2細(xì)胞增殖能力的影響

2.21,25(OH)2D3對喉癌細(xì)胞周期影響1,25(OH)2D3對細(xì)胞株Hep-2干預(yù)后，細(xì)胞周期分布及細(xì)胞增殖指數(shù)見表1和圖2。不同濃度1,25(OH)2D3作用48 h后，G0/G1期細(xì)胞較對照組明顯增多(P<0.05)，細(xì)胞增殖指數(shù)明顯減少(P<0.05)。

表1　1,25(OH)2D3作用48 h后Hep-2細(xì)胞周期分布

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：A為對照組；B為1,25(OH)2D3濃度10-8mmol/L；C為1,25(OH)2D3濃度10-7mmol/L；D為1,25(OH)2D3濃度10-6mmol/L。

圖21,25(OH)2D3對Hep-2細(xì)胞周期的影響

注：A為對照組；B為1,25(OH)2D3濃度10-8mmol/L；C為1,25(OH)2D3濃度10-7mmol/L；D為1,25(OH)2D3濃度10-6mmol/L；E為雷帕霉素干預(yù)組。

圖31,25(OH)2D3對Hep-2細(xì)胞mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響

2.3Western blotting檢測蛋白表達(dá)結(jié)果如圖3所示，Hep-2細(xì)胞1,25(OH)2D3干預(yù)組與對照組比較TSC1、TSC2蛋白表達(dá)均增高，TSC2蛋白表達(dá)增高尤為明顯(P<0.01)，隨1,25(OH)2D3濃度增加，蛋白表達(dá)增高尤為明顯，而雷帕霉素組表達(dá)改變不明顯(P>0.05)；Rheb蛋白在1,25(OH)2D3干預(yù)后表達(dá)降低，不同濃度表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，雷帕霉素組表達(dá)也降低(P<0.05)；mTOR蛋白及其磷酸化水平在1,25(OH)2D3干預(yù)后表達(dá)降低，mTOR蛋白磷酸化表達(dá)降低尤為明顯(P<0.01)，雷帕霉素組mTOR蛋白改變不明顯(P<0.05)，而mTOR蛋白磷酸化表達(dá)降低明顯(P<0.01)；4EBP-1在1,25(OH)2D3干預(yù)后表達(dá)增高，不同濃度表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，雷帕霉素組表達(dá)也增高(P<0.05)。

3　討　論

喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，占人類所有惡性腫瘤的2%[3-4]。雖然近幾十年來傳統(tǒng)的喉癌治療方式已有很大提高，但喉癌患者總體生存率一直沒有提高，因此尋求高效、低毒的抗腫瘤藥物成為研究的熱點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3對乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可以抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞生長，該作用呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，在作用48 h后抑制作用最為顯著。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，細(xì)胞增殖最終發(fā)生在細(xì)胞周期水平。以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期為策略是抗腫瘤治療的新途徑，細(xì)胞周期阻滯包括G0/G1期阻滯和G2/M期阻滯。本研究結(jié)果顯示，隨著1,25(OH)2D3濃度的增加，Hep-2細(xì)胞G0/G1期所占比例逐漸上升，而G2/M期細(xì)胞和S期細(xì)胞所占比例逐漸下降。表明1,25(OH)2D3能使Hep-2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

mTOR 是腫瘤發(fā)生過程中的一個(gè)關(guān)鍵因子，主要是通過PI-3K/AKT/mTOR及AKT/TSC1-TSC2/mTOR 信號通路對細(xì)胞的生長和增殖產(chǎn)生調(diào)控作用，信號通路的過度激活和調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。1994年由PaulWorley發(fā)現(xiàn)Rheb，最初研究表明Rheb在誘導(dǎo)癲癇后的神經(jīng)元表達(dá)增高，推測Rheb對外界應(yīng)激反應(yīng)中具有突觸可塑性[7]。更有研究證明Rheb是TSC基因下游作用因子，具有內(nèi)源性GTP酶活性，作為TSC2的靶分子，與有GTP酶激活蛋白(GAP)的TSC2直接作用[8]，而且在TSC患者中mTOR通路異常激活，而TSC蛋白和Rheb蛋白分別為mTOR通路的負(fù)性和正性調(diào)控因子[9]。

維生素D參與鈣、磷代謝和維持骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。而較多研究發(fā)現(xiàn)其新的功能，研究表明，維生素D具有廣泛的生物學(xué)活性，不僅在機(jī)體骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡的重要作用[10-11]。在抗凋亡機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3能夠在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)DDIT4表達(dá)，后者可通過調(diào)控mTOR信號通路中TSC1/2復(fù)合物及Rheb的活性來抑制mTOR激活，而激活后的mTOR通過調(diào)控4EBP-1表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3干預(yù)Hep-2細(xì)胞TSC1、TSC2蛋白表達(dá)與對照組比較均增高。而干預(yù)組Rheb蛋白表達(dá)降低、mTOR蛋白及其磷酸化水平降低、4EBP-1蛋白表達(dá)增高。同時(shí)設(shè)立mTOR抑制劑雷帕霉素作為對照，檢測mTOR下游蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)mTOR蛋白及其磷酸化水平、4EBP-1蛋白表達(dá)水平與1,25(OH)2D3干預(yù)組類似。由此可見，1,25(OH)2D3抑制Hep-2細(xì)胞中Rheb表達(dá)、mTOR蛋白及其磷酸化水平，增加4EBP-1蛋白水平表達(dá)，抑制mTOR信號通路，影響TSC1/2/Rheb/mTOR/4EBP-1信號通路蛋白表達(dá)，從而抑制Hep-2細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)不足之處在于盡管參照了較多研究的文獻(xiàn)進(jìn)行1,25(OH)2D3濃度選擇，但是就本部分實(shí)驗(yàn)的完整性而言需要進(jìn)一步選擇不同1,25(OH)2D3的作用濃度進(jìn)行研究；檢測了mTOR總的蛋白，而沒有進(jìn)行細(xì)胞核蛋白和膜蛋白的分別檢測，這也是本課題組后期擬進(jìn)一步檢測的內(nèi)容；本實(shí)驗(yàn)僅反映體外實(shí)驗(yàn)，尚無體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，需要進(jìn)一步進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)研究。本課題組將在后期實(shí)驗(yàn)中完善這一部分。

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mTOR signaling pathway for regulating inhibition of 1,25 dihydroxyvitamin D3on Hep-2 cells proliferation in laryngeal carcinoma*

GUI Mingcai1,LI Bing2△,QI Siguo1,ZHOU Changhua1

(1DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,DazhouMunicipalCentralHospital,Dazhou,Sichuan635000,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo explore the inhibition role of 1,25 dihydroxyvitamin D3on laryngeal cancer Hep-2 cell proliferation and its influence on mTOR signal pathway.MethodsHep-2 cells were treated with different concentrations of 1,25 dihydroxyvitamin D3(10-8,10-7,10-6mol/L) for 24,48,72 h respectively.The proliferation situation of Hep-2 cells was detected by the MTT method and the inhibition rate was calculated.The effect of 1,25 dihydroxyvitamin D3on Hep-2 cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry.The influence of 1,25 dihydroxyvitamin D3on mTOR signaling pathway was detected by Western blot.ResultsDifferent concentrations of 1,25 dihydroxyvitamin D3could inhibit the proliferation of Hep-2 cells,changed the cell cycle distribution and increased the proportion of Hep-2 cells in G0/G1phase.The expressions of TSC1 and TSC2 protein after 1,25 dihydroxyvitamin D3intervention were increased compared with the control group(P<0.01),while the Rheb protein expression was significantly decreased(P<0.01):mTOR protein and phosphorylation level were significantly decreased compared with the control group (P<0.01),the decrease of mTOR protein phosphorylation was especially obvious(P<0.01);4EBP-1 protein expression was increased compared with the control group(P<0.01).Conclusion1,25-dihydroxyvitamin D3alters the Hep-2 cell cycle distribution,affects the protein expression of mTOR signaling pathway,thus inhibits the cell proliferation.

1,25 dihydroxyvitamin D3;Hep-2 cell;proliferation;mTOR

2016-02-02修回日期：2016-05-16)

重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(cstc2013jcyjA10059)。

桂明才，男，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻喉頭頸外科方面的研究?！?/p>

，E-mail:634339717@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.006

A

1673-4130(2016)15-2065-03