利用味精廢液發(fā)酵枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方優(yōu)化

劉麗， 曾真， 方萍.3*

(1.浙江大學環(huán)境與資源學院，污染環(huán)境修復與生態(tài)健康教育部重點實驗室，杭州 310058；2.貴州大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境系，貴陽 550025；3.浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點研究實驗室，杭州 310058)

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利用味精廢液發(fā)酵枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方優(yōu)化

劉麗1,2， 曾真1， 方萍1.3*

(1.浙江大學環(huán)境與資源學院，污染環(huán)境修復與生態(tài)健康教育部重點實驗室，杭州 310058；2.貴州大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境系，貴陽 550025；3.浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點研究實驗室，杭州 310058)

以營養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)培養(yǎng)基為對照，通過對比試驗、正交試驗和單因素試驗，對以味精廢液為主要營養(yǎng)源的搖瓶培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌F-2培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以提高F-2發(fā)酵液的活菌密度并實現(xiàn)味精廢液的資源化利用。對比試驗表明，用12.5 g/L濃縮味精廢液(concentrated monosodium glutamate wastewater，CMGW)培養(yǎng)的F-2菌懸液的D(600 nm)值及活菌密度顯著高于NB培養(yǎng)基，其培養(yǎng)F-2后的氨基酸含量顯著降低。通過L16(43×26)正交試驗篩選出F-2的優(yōu)化配方為CMGW 12.5 g/L，牛肉膏1.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，MnSO4·2H2O 0.5 g/L，H3BO30.02 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。按此優(yōu)化配方接種培養(yǎng)F-2菌株，其菌液的活菌密度分別是未經(jīng)優(yōu)化的CMGW培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基的2.9倍和6.3倍。通過單因素試驗，篩選出基于該優(yōu)化配方的F-2菌株適宜的初始pH范圍為6.5～7.5，適宜的培養(yǎng)溫度為30～35 ℃。以上結果顯示，培養(yǎng)基CMGW對菌株F-2的發(fā)酵效果優(yōu)于NB培養(yǎng)基，其優(yōu)化配方的效果更佳。

濃縮味精廢液； 枯草芽孢桿菌； 正交試驗設計； 培養(yǎng)基優(yōu)化； 氨基酸

The purpose of this study was to investigate a cost-effective resource utilization of CMGW by increasing the density ofB.subtilisF-2 viable cells in cultures. The CMGW medium which was 80-fold diluent of the wastewater,i.e., 12.5 g/L CMGW, was served as the main carbon and nitrogen sources of strain F-2. Contrast experiments of shaking cultures, orthogonal and single factor experiments were applied to find the optimal CMGW medium formula and its culturing condition.

The contrast experiments showed that theD(600 nm) value of F-2 suspension and viable cell density of the CMGW medium was significantly higher than that of nutrient broth (NB) medium, and the amino acid content in the CMGW medium decreased significantly after culturing. The optimal formula identifying F-2 by the orthogonal experiment of L16(43×26) was as follows: 12.5 g/L CMGW, 1.0 g/L beef extracts, 4.0 g/L peptone, 0.5 g/L MnSO4·2H2O, 0.02 g/L H3BO3, 0.1 g/L FeSO4·7H2O and 0.5 g/L MgSO4·7H2O. The viable cell density in the optimized CMGW medium was 2.9 and 6.3 times of the CMGW medium and NB medium, respectively. Furthermore, according to the results of single factor experiment, the proper initial pH and culturing temperature of the optimized CMGW medium were screened as pH 6.5-7.5 and 30-35 ℃.

In conclusion, the CMGW medium is an ideal substitute for NB medium in the fermentation ofB.subtilisF-2， providing a practicable and promising approach to reuse and recover CMGW. Moreover, the CMGW medium is superior to NB medium, and the fermentation effect is even better after the medium and culturing condition are optimized.

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，具有促進作物生長[9-11]、抑制植物病原菌[12-14]、加快畜禽糞便及日常生活廢棄物堆肥的腐熟進程等功能[15-17]，是用于制備有機廢棄物堆肥發(fā)酵菌劑[16]或生物有機肥的重要功能菌[17]。關于通過優(yōu)化枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基以提高發(fā)酵的活菌密度的研究報道較多[18-20]，但大多以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或大豆粉、玉米粉等為主料，生產(chǎn)成本較高且需要消耗大量資源[21]。鑒于此，本研究以營養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)培養(yǎng)基為對照，通過一系列搖瓶培養(yǎng)試驗，對以濃縮味精廢液為主要營養(yǎng)源的枯草芽孢桿菌F-2液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化研究，以達到提高F-2菌株發(fā)酵的活菌密度、降低微生物菌劑的生產(chǎn)成本并實現(xiàn)廢棄物資源化利用的目的。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試菌株為枯草芽孢桿菌F-2，由本研究室自某商品有機肥中分離、篩選獲得，經(jīng)中國普通微生物菌種保藏管理中心鑒定并保藏，保藏號為CGMCC No.3882。該菌株能產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)豐原素(fengycin)[22]，對18種植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用，對西瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporumf. sp.niveum)的抑制率高達93%。

濃縮味精廢液(concentrated monosodium glutamate wastewater， CMGW)為味精廢液的蒸發(fā)濃縮液(由安徽環(huán)宇肥料有限公司提供)，pH 3.1，電導率33.2 mS/cm；營養(yǎng)元素含量分別為全碳25.5%，全氮5.13%，全鉀2.07%，全磷0.16%，鈉5.51%，硫15.1%，鐵0.26 g/kg，鈣0.62 g/kg，鎂0.93 g/kg，鉬9.17 g/kg，鋅2.16 mg/kg，銅2.54 mg/kg，鎳2.29 mg/kg；其他重金屬含量見表1，均低于城鎮(zhèn)垃圾農(nóng)用控制標準[23]。

表1濃縮味精廢液中重金屬含量及控制標準

Table 1Heavy metal contents in concentrated monosodium glutamate wastewater (CMGW) and its control standard μg/kg

元素ElementsAsCdCrHgPb濃縮味精廢液CMGW0.520.01000.07城鎮(zhèn)垃圾農(nóng)用控制標準Controlstandardsforurbanwastesforagriculturaluse30.003.003005100.00

1.2培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加水至1 000 mL，pH 7.0；1×105Pa滅菌30 min。

NB固體培養(yǎng)基：在NB培養(yǎng)基的基礎上加入瓊脂20.0 g；1×105Pa滅菌30 min。

CMGW培養(yǎng)基：CMGW 12.5 g，加水稀釋至1 000 mL，pH 7.0；1×105Pa滅菌30 min。

1.3F-2種子菌液制備

取1環(huán)F-2斜面菌苔于NB固體培養(yǎng)基平板上劃線，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min下 振蕩培養(yǎng)18 h(經(jīng)前期F-2生長曲線測定試驗確定),獲得F-2種子菌液。

1.4試驗設計

1.4.1CMGW和NB培養(yǎng)基對F-2培養(yǎng)對比試驗

按1%接種量分別接種F-2種子菌液于CMGW培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基處理各重復5次，于30 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)18 h，觀察2種培養(yǎng)基培養(yǎng)F-2后菌懸液濃度及活菌密度。

1.4.2基于CMGW的F-2菌株培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗

1.4.3基于優(yōu)化配方的F-2培養(yǎng)條件優(yōu)選試驗

以1.4.2節(jié)所篩選的優(yōu)化配方對菌株F-2進行不同培養(yǎng)基初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和不同培養(yǎng)溫度(25、30、35、40 ℃)的振蕩培養(yǎng)試驗。各處理的F-2種子液接種量均為1%，并在150 r/min下振蕩培養(yǎng)18 h。其中，不同初始pH試驗的培養(yǎng)溫度為30 ℃，不同培養(yǎng)溫度試驗的培養(yǎng)基初始pH為優(yōu)選確定的初始pH。各處理重復3次。

1.5測定項目與方法

1.5.1菌懸液細胞濃度測定

在一定濃度范圍內(nèi)，菌懸液的細胞濃度與其濁度即光密度成正比[24]80-84。以各培養(yǎng)基的原液為空白，采用紫外可見分光光度計(PerkinElmer Lambda 35，美國)測定在600 nm處相應處理培養(yǎng)終止時的菌懸液光密度值，記作D(600 nm)，用以表示該菌懸液的細胞濃度。

表2　L16(43×26)正交設計試驗方案

括號內(nèi)的數(shù)據(jù)為各因子水平的實際量，g/L.

The data in parentheses are the actual dosage of the level of each factor in the medium, g/L.

1.5.2培養(yǎng)液活菌密度測定

采用平板菌落計數(shù)法統(tǒng)計相關處理培養(yǎng)液的活菌數(shù)[24]327-333。

1.5.3總碳和總氮測定

本系統(tǒng)是一個以傳感器數(shù)據(jù)采集、物聯(lián)網(wǎng)窄帶通信傳輸、數(shù)據(jù)庫應用、網(wǎng)絡平臺分享為一體的數(shù)據(jù)采集、分析管理系統(tǒng)。通過各類傳感器數(shù)據(jù)采集后進行匯聚，采用PHP+MYSQL技術實現(xiàn)本系統(tǒng)的開發(fā)。PHP語言簡單、功能強大，而MYSQL是一個非常優(yōu)秀的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，方便使用，性能穩(wěn)定。國內(nèi)外許多知名網(wǎng)站和應用均使用該數(shù)據(jù)庫作為數(shù)據(jù)的存儲。

采用碳氮分析儀(Analytik Jean multi N/C 3100，德國)測定培養(yǎng)液的總碳和總氮，并計算碳氮比(C/N)。

1.5.4氨基酸測定

取1.000 g培養(yǎng)液樣品于25 mL刻度試管中，加6 mol/L鹽酸10 mL，抽真空密封后，于110 ℃水解24 h，定容到25 mL。取上清液0.5 mL，于70 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮干燥后加2 mL 0.022 mol/L稀鹽酸，完全溶解后過0.225 μm水相濾膜。濾液采用全自動氨基酸分析儀(HITCHI L-8900，日本)測定氨基酸含量。

1.6數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理并作圖，利用DPS 14.5軟件[25]進行單因素試驗和正交試驗結果的方差分析。

2　結果與分析

2.1枯草芽孢桿菌F-2在CMGW與NB培養(yǎng)基中的生長量比較

如圖1所示，振蕩培養(yǎng)18 h后，CMGW培養(yǎng)基中F-2菌液的D(600 nm)值顯著高于NB培養(yǎng)基(P=0.000 3)。通過平板計數(shù)測得活菌密度，前者為1.55×108CFU/mL，后者為7.10×107CFU/mL，兩者相差1倍以上?？梢姡怨┰嚌饪s味精廢液的80倍水稀釋液(CMGW 12.5 g/L)培養(yǎng)F-2菌株的效果優(yōu)于常規(guī)NB培養(yǎng)基。

2.2CMGW培養(yǎng)基與NB培養(yǎng)基的碳、氮源比較

作為微生物細胞的基本構成物質(zhì)，碳源和氮源在微生物生長繁殖過程中有著至關重要的作用[24]80-84。CMGW與NB培養(yǎng)基的總碳和總氮含量如圖2所示，氨基酸組分含量如圖3所示。盡管CMGW的總碳、總氮及總氨基酸含量均顯著低于NB，分別為后者的55.9%、36.9%和48.9%，且除γ-氨基丁酸(G-ABA)外，各氨基酸組分含量也均低于NB培養(yǎng)基，但CMGW的碳氮比(C/N)(4.97)顯著高于NB(3.28)(P=0.008)，且F-2菌株在CMGW中的生長優(yōu)于NB。這說明供試的CMGW的80倍水稀釋液所提供的總碳源、總氮源及氨基酸能夠滿足F-2生長之需。

短柵上的不同大寫字母表示在P<0.01水平差異有統(tǒng)計學意義。Different capital letters above bars represent statistically significant differences at the 0.01 probability level. 圖1　CMGW與NB培養(yǎng)基中F-2菌懸液的 D(600 nm)值比較Fig.1　Comparison of D(600 nm) values of F-2 suspension in CMGW and NB media

短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences between CMGW and NB media treatments at the 0.05 probability level.圖2　CMGW與NB培養(yǎng)基的總碳和總氮含量比較Fig.2　Comparisons of total carbon (TC) and total nitrogen (TN) contents in CMGW and NB media

圖3　CMGW與NB培養(yǎng)基的氨基酸組分含量比較Fig.3　Comparisons of amino acid contents in CMGW and NB media

進一步分析CMGW培養(yǎng)基在培養(yǎng)F-2前后的氨基酸組分及總量變化，結果表明：培養(yǎng)F-2后氨基酸總量較培養(yǎng)前顯著降低(P=0.000 4)(圖4)，降低率達12%；除半胱氨酸(Cys)有所上升外，其余氨基酸組分均不同程度地降低，其中谷氨酸(Glu)降低了129.6 mg/L，天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)也都至少降低了51.5 mg/L(圖5)。可見，在味精廢液中豐富的氨基酸可作為氮源或生長因子為F-2所利用，同時在F-2的代謝過程中可能還產(chǎn)生了半胱氨酸(Cys)。

短柵上的不同大寫字母表示在P<0.01水平差異有統(tǒng)計學意義。Different capital letters above bars represent statistically significant differences at the 0.01 probability level.圖4　培養(yǎng) F-2前后CMGW培養(yǎng)基的氨基酸總量比較Fig.4　Comparison of total amino acid contents in CMGW medium before and after culturing F-2

圖5　CMGW培養(yǎng)基的氨基酸組分在培養(yǎng)F-2后的減少量Fig.5　Reduction amount of amino acids in CMGW medium after culturing F-2

上述結果表明，CMGW培養(yǎng)基的碳源和氮源總量、C/N及氨基酸組分及含量可滿足F-2生長繁殖的需求，但均與NB培養(yǎng)基有一定差別，若對其組分作適當改進可望進一步提高F-2菌液的菌體密度。

2.3基于CMGW的F-2培養(yǎng)基配方優(yōu)化

方差分析結果表明，F(xiàn)-2菌懸液D(600 nm)值在L16(43×26)正交試驗的16個處理組合(1～16)及NB(17)處理間差異顯著(圖6)，除處理4、8、9、10和13外，其余處理的D(600 nm)值均顯著高于NB，其中處理11最高，其平板計數(shù)的活菌密度為3.55×108CFU/mL，比前述未經(jīng)優(yōu)化的CMGW培養(yǎng)基的活菌密度提高了1.3倍，比NB培養(yǎng)基提高了4.0倍。

處理(1～16)的配方方案詳見表2；處理17為NB培養(yǎng)基。短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Please see Table 2 for the details of the culture medium formula of the first 16 treatments, and the treatment 17 is NB medium. Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.圖6　L16(43×26)正交試驗不同處理及NB處理的F-2菌懸液D(600 nm)值比較Fig.6　Comparisons of F-2 suspension D(600 nm) values among the treatments of the orthogonal array experiments and NB medium

由圖7可見，F(xiàn)-2菌懸液D(600 nm)值除了在因子E(Mo)的水平間未見統(tǒng)計學上的顯著差異外，在其余8個供試因子的水平間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中：效應最大的因子為C，表現(xiàn)為D(600 nm)值隨CMGW稀釋倍數(shù)的增加而降低，其優(yōu)選稀釋倍數(shù)為80倍(12.5 g/L)；其次為因子B，其D(600 nm)值隨蛋白胨用量提高呈先升后降趨勢，其優(yōu)選用量為4.0 g/L；因子F(Co)對D(600 nm)值表現(xiàn)為負效應，其余因子均有正效應。各因子的優(yōu)選水平列于表3。按此組合配制培養(yǎng)基接種培養(yǎng)F-2，其菌液的活菌密度為4.45×108CFU/mL，分別是正交試驗中處理11、未經(jīng)優(yōu)化的CMGW培養(yǎng)基和NB培養(yǎng)基的1.3倍、2.9倍和6.3倍。

2.4基于CMGW優(yōu)化配方的F-2培養(yǎng)條件優(yōu)選

按表3所列的各因子優(yōu)選水平組合配制不同初始pH培養(yǎng)基對F-2進行培養(yǎng)，測得各pH處理下的F-2菌懸液D(600 nm)值如圖8所示。方差分析表明，培養(yǎng)基初始pH對D(600 nm)值有顯著影響(P=0.045)，其中在初始pH 6.5～7.5范圍內(nèi)D(600 nm)值均高于1.35，顯著高于pH 8的

(A～I)表示的含義詳見表2。圖中不同小寫字母表示同一因子水平間在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Please see Table 2 for the details of factors A to I. Different lowercase letters represent statistically significant differences among levels of the same factor at the 0.05 probability level. 圖7　F-2菌懸液D(600 nm)值在正交試驗各因子水平間的比較Fig.7　Comparisons of D(600 nm) values of F-2 suspensions among different levels of each factor in orthogonal array experiment

Table 3Range,Pvalue and optimal dosage of each orthogonal array factor

因子Factors極差RangeP值Pvalue優(yōu)選量Optimaldosage g L A 牛肉膏Beefextract 0 13292 00×10-41 0B 蛋白胨Peptone 0 35481 35×10-214 0C CMGW 0 78231 35×10-3312 5D MnSO4·2H2O 0 13704 79×10-150 5E Na2MoO4 0 00230 81480 00F CoCl2·6H2O 0 36767 17×10-280 0G H3BO3 0 17306 45×10-180 02H FeSO4·7H2O 0 17306 45×10-180 1I MgSO4·7H2O 0 12495 96×10-140 5

短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.圖8　基于CMGW優(yōu)化配方的培養(yǎng)基初始pH對F-2生長的影響Fig.8　Effects of initial pH on F-2 growth cultured in optimal CMGW medium

D(600 nm)值，而pH 6.0與8.0之間的差異未達統(tǒng)計學上的顯著水平(P>0.05)。說明基于該優(yōu)化配方的適宜F-2生長的初始pH范圍為6.5～7.5。

圖9表明，在培養(yǎng)基優(yōu)化配方及優(yōu)選初始pH條件下，培養(yǎng)溫度對F-2菌懸液的D(600 nm)值也具有統(tǒng)計學上的顯著影響(P=0.000 6)。在供試溫度范圍內(nèi)，D(600 nm)值呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，以30～35 ℃范圍內(nèi)D(600 nm)值最高(均大于1.35)，在25 ℃和40 ℃時D(600 nm)值顯著降低。說明基于該優(yōu)化配方的F-2適宜生長的培養(yǎng)溫度為30～35 ℃。

短柵上的不同小寫字母表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學意義。Different lowercase letters above bars represent statistically significant differences at the 0.05 probability level.圖9　基于CMGW優(yōu)化配方及優(yōu)選pH的培養(yǎng)溫度對F-2生長的影響Fig.9　Effects of temperatures on F-2 growth cultured in optimal CMGW medium at preferred initial pH

3　討論

味精廢液是一類難處理的食品工業(yè)有機廢水，因含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，仍具有極高的資源化利用價值。GU等[5]研究指出，以味精廢液為主要氮源，以馬鈴薯淀粉廢液為主要碳源，可提高菌株EBL-06的發(fā)酵產(chǎn)量。BAI等[6]指出，以味精廢液為主要氮源，以甜菜渣為主要碳源，能提高黑曲霉發(fā)酵中果膠酶和果膠裂解酶的產(chǎn)量。本研究表明，供試的濃縮味精廢液不僅含有大量氮元素，也含有豐富的碳元素，可以為微生物提供充足的氮源和碳源；同時，該濃縮味精廢液用水稀釋80倍并調(diào)節(jié)pH至7.0后作為培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌F-2進行搖瓶振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)后F-2菌懸液的D(600 nm)值及活菌密度均顯著高于對照NB培養(yǎng)基。說明可采用CMGW培養(yǎng)基代替NB培養(yǎng)基發(fā)酵F-2。測定CMGW與NB培養(yǎng)基的碳、氮源與氨基酸總量及組分含量后發(fā)現(xiàn)，CMGW培養(yǎng)基的總碳、總氮、總氨基酸含量均顯著低于NB培養(yǎng)基，極大部分氨基酸組分含量也低于NB；然而，CMGW的C/N卻顯著高于NB。趙瑞[26]研究表明，高C/N更有利于枯草芽孢桿菌TU100的生長代謝。由此推測，相對于NB培養(yǎng)基，CMGW培養(yǎng)基中F-2菌懸液具有更高的D(600 nm)值及活菌密度可能與其較高的C/N有關。進一步檢測培養(yǎng)F-2后CMGW培養(yǎng)基的氨基酸組分變化發(fā)現(xiàn)，氨基酸總量降低12%，除半胱氨酸(Cys)外，其余氨基酸組分含量均明顯降低。表明CMGW培養(yǎng)基的氨基酸或許為F-2的氮源和生長因子，并且通過發(fā)酵菌株F-2能有效達到資源化回收該工業(yè)廢水之目的。此外，由于微生物生長受多種因素限制，盡管CMGW培養(yǎng)基的氨基酸大部分未被F-2利用，其氮源以外的碳源及其他營養(yǎng)物質(zhì)、氨基酸以外的其他生長因子、礦質(zhì)養(yǎng)分和能源等的匱乏和均衡情況以及培養(yǎng)條件等都會影響到發(fā)酵的活菌密度；因此，為進一步提高F-2的活菌密度，有必要對CMGW培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

考慮到CMGW培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分低于NB培養(yǎng)基，適當提高碳、氮及氨基酸等含量也可能有利于提高F-2的活菌密度。但在前期研究中發(fā)現(xiàn)，CMGW稀釋倍數(shù)越低，Na含量越高，電導率越大，F(xiàn)-2生長受到抑制；因此，不宜通過降低CMGW的稀釋倍數(shù)來提高CMGW培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)含量。而若提高其稀釋倍數(shù)又必然會導致培養(yǎng)基營養(yǎng)成分尤其是碳、氮源的降低；因此，在提高其稀釋倍數(shù)的同時有必要添加適量的碳、氮營養(yǎng)。牛肉膏和蛋白胨作為天然有機營養(yǎng)物質(zhì)可同時滿足在CMGW培養(yǎng)基優(yōu)化中對碳、氮源和多種營養(yǎng)物質(zhì)的需求。同時，為了考察在CMGW培養(yǎng)基的基礎上添加礦質(zhì)養(yǎng)分是否有益，本研究通過L16(43×26)正交試驗，對包括CMGW稀釋倍數(shù)、牛肉膏和蛋白胨添加量和6個礦質(zhì)養(yǎng)分在內(nèi)的9個正交因子的水平進行了優(yōu)化。結果表明：CMGW稀釋倍數(shù)對F-2菌懸液的D(600 nm)值影響效應最大，從80倍(12.5 g/L)到約300倍(3.3 g/L)范圍內(nèi)D(600 nm)值隨稀釋倍數(shù)加大而降低，而適量添加牛肉膏和蛋白胨均有助于D(600 nm)值的升高；在6個礦質(zhì)養(yǎng)分因子中，Mo的營養(yǎng)效應不顯著，Co有顯著負效應，其余4個營養(yǎng)因子Mn、B、Fe和Mg都具有正效應?？梢姡?2.5 g/L CMGW培養(yǎng)基(即CMGW的80倍水稀釋液)的基礎上增大其稀釋倍數(shù)不能滿足F-2的生長所需，而向培養(yǎng)基中添加適量的牛肉膏、蛋白胨以及礦質(zhì)養(yǎng)分如Mn、B、Fe和Mg有助于提高F-2的活菌密度。綜合各因子的影響效應及用料成本，優(yōu)選出基于味精廢液的F-2培養(yǎng)基配方為CMGW 12.5 g/L，牛肉膏1.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，MnSO4·2H2O 0.5 g/L，H3BO30.02 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0。采用該優(yōu)化配方培養(yǎng)F-2所獲得的菌懸液活菌密度達4.45×108CFU/mL，比NB培養(yǎng)基提高了5.3倍。

培養(yǎng)基的初始pH和培養(yǎng)溫度是影響微生物生長代謝的重要環(huán)境因子[26]。本研究結果表明，利用CMGW優(yōu)化配方培養(yǎng)F-2，其適宜的培養(yǎng)基初始pH范圍為 6.5～7.5，適宜的培養(yǎng)溫度為30～35 ℃。

綜上所述，供試濃縮味精廢液的80倍水稀釋液(CMGW 12.5 g/L)可作為枯草芽孢桿菌F-2的培養(yǎng)基，其培養(yǎng)效果優(yōu)于肉湯培養(yǎng)基；對該培養(yǎng)基作進一步優(yōu)化可明顯提高發(fā)酵液的F-2活菌密度。因此，以味精廢液作為枯草芽孢桿菌F-2的培養(yǎng)基可實現(xiàn)廢棄物的資源化利用和降低菌劑生產(chǎn)成本的雙重目的。

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LIU Li1,2, ZENG Zhen1, FANG Ping1,3*

(1.KeyLaboratoryofEnvironmentRemediationandEcologicalHealthoftheMinistryofEducation,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2.DepartmentofAgriculturalResourceandEnvironment,CollegeofAgriculture,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 3.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofSubtropicalSoilandPlantNutrition,CollegeofEnvironmentalandResourceSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

concentrated monosodium glutamate wastewater (CMGW);Bacillussubtilis; orthogonal experiment design; medium optimization; amino acid

國家自然科學基金(31272242)；國家水體污染防治與治理重大專項(2014ZX07101-012)；貴州大學引進人才科研項目(貴大人基合字[2015]010號).

Corresponding author)：方萍(http://orcid.org/0000-0001-7784-7873)，Tel:+86-571-88982480,E-mail:pfang@zju.edu.cn

聯(lián)系方式：劉麗(http://orcid.org/0000-0002-4210-7450)，E-mail:liuliz706@sina.com

2015-08-29；接受日期(Accepted)：2016-01-13；網(wǎng)絡出版日期(Published online)：2016-07-18

TQ 920.6; X 703

A

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160718.2034.012.html