脊髓背角神經(jīng)元上調(diào)Nav1.8通道參與缺血再灌注損傷后痛覺過(guò)敏的機(jī)制

李曉倩，張?jiān)倮?，馬　虹

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脊髓背角神經(jīng)元上調(diào)Nav1.8通道參與缺血再灌注損傷后痛覺過(guò)敏的機(jī)制

李曉倩，張?jiān)倮颍R虹*

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽(yáng) 110001

[摘要]目的觀察鞘內(nèi)注射鈉通道抑制劑619C89對(duì)脊髓缺血再灌注損傷引起的痛覺過(guò)敏大鼠的痛閾、脊髓背角神經(jīng)元中Nav1.8通道表達(dá)的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(S組)、痛覺過(guò)敏組(H組，缺血再灌注前3 d鞘內(nèi)注射30 μL生理鹽水)、鈉通道抑制劑組(I組，缺血再灌注前3 d鞘內(nèi)注射619C89 5 μg/30 μL)。S組僅暴露主動(dòng)脈弓而不結(jié)扎，其他各組開胸后無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉主動(dòng)脈弓14 min后再開放，建立SCIRI引起的痛覺過(guò)敏模型。各組手術(shù)前均于L5-6鞘內(nèi)置管并連續(xù)注射3 d。術(shù)后1、3、5、7、14 d分別測(cè)定各組大鼠的熱痛閾及機(jī)械性痛閾；取第4～6節(jié)腰段脊髓，采用免疫雙熒光法觀察背角神經(jīng)元狀態(tài)及其Nav1.8的表達(dá)，Real time-PCR法檢測(cè)各組大鼠脊髓組織Nav1.8表達(dá)。結(jié)果與S組相比，術(shù)后各觀察點(diǎn)(尤以第7天為著)H組大鼠熱痛閾和機(jī)械性痛閾降低，損傷后7 d脊髓組織中Nav1.8 mRNA的表達(dá)增加(P<0.05)；I組大鼠熱痛閾和機(jī)械性痛閾值明顯提高(P<0.05)，脊髓組織中Nav1.8 mRNA的表達(dá)降低(P<0.05)。免疫雙熒光染色顯示，損傷后7 d，H組大鼠脊髓背角Nav1.8的熒光強(qiáng)度明顯增加，且主要表達(dá)在NeuN表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元的胞漿中；且與S組相比，H組中NeuN/Nav1.8雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而I組雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)。結(jié)論脊髓背角神經(jīng)元通過(guò)上調(diào)Nav1.8通道參與缺血再灌注損傷后痛覺過(guò)敏的形成。

[關(guān)鍵詞]痛覺過(guò)敏；神經(jīng)元；鈉通道抑制劑;Nav1.8通道

0　引言

痛覺過(guò)敏(Hyperalgesia)是指?jìng)π源碳は?，在受損部位及周圍或遠(yuǎn)處可產(chǎn)生各種敏感性增強(qiáng)的疼痛或痛覺過(guò)敏區(qū)域，引起的更加強(qiáng)烈的疼痛，是外周和中樞敏感化的結(jié)果[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近50%的人曾遭受不同程度痛覺過(guò)敏的影響，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、加重社會(huì)負(fù)擔(dān)。痛覺過(guò)敏的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，主要與傷害性感受神經(jīng)元的電活動(dòng)形成有關(guān)。進(jìn)一步研究表明，初級(jí)痛覺過(guò)敏主要是由于外周受損部位神經(jīng)末梢傷害性感受器不斷受到刺激產(chǎn)生，而二級(jí)痛覺過(guò)敏與神經(jīng)中樞尤其是脊髓神經(jīng)元興奮性發(fā)生的改變有關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，河豚毒素不敏感(TTX-R)的Nav1.8通道專一表達(dá)在外周感覺神經(jīng)元上，可以產(chǎn)生慢失活TTX-R鈉電流，是所在細(xì)胞動(dòng)作電位去極化期的鈉電流的主要通道。炎癥痛模型中發(fā)現(xiàn)，小鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglia，DRG)神經(jīng)元中Nav1.8通道表達(dá)上調(diào)、TTX-R鈉電流明顯增加[3-4]。此外，通過(guò)遺傳學(xué)的方法敲除小鼠Nav1.8基因后，小鼠對(duì)傷害性機(jī)械性刺激表現(xiàn)出明顯的痛覺缺失[5]。因此，Nav1.8在疼痛通路特別是在外周敏化的作用是痛覺過(guò)敏機(jī)制的研究熱點(diǎn)。目前對(duì)脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury,SC IRI)后引起的疼痛過(guò)敏模型中電壓門控性鈉通道表達(dá)調(diào)節(jié)的相關(guān)研究還罕見報(bào)道。本研究擬通過(guò)觀察鞘內(nèi)注射鈉通道抑制劑619C89[4氨基2(4甲基1哌嗪)5(2,3,5三氯苯基)嘧啶]對(duì)IRI致痛覺過(guò)敏的鎮(zhèn)痛作用，并探討Nav1.8表達(dá)在脊髓背角神經(jīng)元中的作用。

1　材料和方法

1.1儀器和試藥雄性Sprague-Dawley大鼠90只，體重260～280 g；619C89(江蘇倍達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)；兔抗大鼠NeuN單克隆抗體，小鼠抗大鼠Nav1.8多克隆抗體、Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體、Alexa Fluor594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG抗體(Abcam公司)；one step RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；鼠爪機(jī)械痛閾測(cè)定儀(型號(hào):3740,UGO BASILE公司,意大利);大鼠爪熱痛閾測(cè)定(型號(hào):7370,UGO BASILE公司，意大利)；圖像分析系統(tǒng)(武漢華海公司，HIPAS-1000型)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK公司，EIx800型)由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組大鼠隨機(jī)分為3組，每組30只。非假手術(shù)組參照文獻(xiàn)[6]制備損傷后痛覺過(guò)敏模型，并行L5-6鞘內(nèi)置管。假手術(shù)組(S組):損傷前3 d鞘內(nèi)注射生理鹽水30 μL，開胸并暴露主動(dòng)脈弓而不阻斷；H組：損傷前3 d鞘內(nèi)注射生理鹽水30 μL，開胸暴露主動(dòng)脈弓并用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉14 min后開放；I組：損傷前3 d鞘內(nèi)注射10 μg 619C89 (30 μL)，其余同H組。

1.2.2缺血再灌注損傷后痛覺過(guò)敏模型的建立[6]水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，常規(guī)消毒，右側(cè)臥位，四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，胸背部去毛，消毒鋪巾。沿肋緣切口逐層分離并暴露左肺上葉，面紗條肺部保護(hù)后由心包處開始分離主動(dòng)脈，至主動(dòng)脈弓左鎖骨上動(dòng)脈發(fā)出處上無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉14 min，后撤除動(dòng)脈夾，逐層縫合傷口。腹腔注射0.3 mL氨芐青霉素(100 mg/mL)。術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

1.2.3機(jī)械性痛閾及熱痛閾測(cè)定參照Obata等[7]方法，分別于CCI前2 d及術(shù)后1、3、5、7、14 d，采用電子自動(dòng)爪觸覺測(cè)試儀測(cè)定各組大鼠右足機(jī)械刺激縮爪閾值(Paw withdrawal threshold，PWT)。照射內(nèi)側(cè)第1足趾的著力點(diǎn)，采用輻射熱測(cè)痛儀測(cè)定各組大鼠右足輻射熱刺激縮爪潛伏期(Paw withdrawal latency，PWL)，單次照射不超過(guò)20 s，以免損傷照射部位。測(cè)定值精確到0.1 s。各時(shí)點(diǎn)各指標(biāo)分別測(cè)定3次，每次間隔5 min，取平均值。

1.2.4免疫雙熒光法觀察大鼠脊髓背角神經(jīng)元和Nav1.8分布脊髓組織固定和浸糖，冰凍連續(xù)切片(厚度為20 μm)后放入含1%胎牛血清和0.3% Triton X-100的PBS室溫封閉30 min。分別加入兔抗大鼠NeuN(1∶300)和小鼠抗大鼠Nav1.8(1∶500)的一抗孵育過(guò)夜，沖洗后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶800)和Alexa Fluor 594標(biāo)記的驢抗小鼠IgG的二抗，室溫避光孵育2 h。封固后用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)，取3個(gè)平面計(jì)數(shù)平均值。

1.2.5Real time-PCR測(cè)定大鼠脊髓組織中Nav1.8 mRNA的表達(dá)按試劑盒說(shuō)明書操作。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)提取總RNA的質(zhì)量和濃度。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢Nav1.8、NeuN和GAPDH序列，設(shè)計(jì)與合成引物。引物序列如下:Nav1.8(正向):5′-CAGAAGGAACAGGAGGTG-3′,(反向)：5′-GAAGCTCTYCT GCCCTGTAGT-3′；GAPDH(正向)5′-TCGGCATTGTGGAGGGGCTC-3′，(反向)5′-TCCCGTTCAGCTCGGGGATG-3′。在FTC2000型熒光定量PCR儀上行PCR。擴(kuò)增條件如下：①94 ℃ 1 min，②94 ℃ 10 s，③55 ℃ 30 s，④72 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)。退火期為55 ℃ 30 s。結(jié)束后，系統(tǒng)根據(jù)各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)指數(shù)(DRn)繪制擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線和確定至特定閾值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，采用2-△△CT法處理數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

2.1大鼠機(jī)械性痛閾及熱痛閾的變化與S組相比，術(shù)后各觀察點(diǎn)(尤以第7天為著)H組大鼠右足PWT值和PWL值明顯降低(P<0.05)；與H組相比，I組術(shù)后各觀察點(diǎn)PWT值和PWL值明顯升高(P<0.05)，見圖1、圖2。

圖1　缺血再灌注損傷后第1、3、5、7、14 d大鼠右足機(jī)械刺激縮爪閾值(PWT)變化

圖2　缺血再灌注損傷后第1、3、5、7、14 d大鼠右足熱刺激縮爪潛伏期(PWL)變化

2.2免疫雙熒光觀察大鼠脊髓背角神經(jīng)元及Nav1.8通道變化NeuN作為神經(jīng)元特異性標(biāo)記物，與S組相比，損傷后7 d鏡下可見，H組大鼠脊髓背角Nav1.8的熒光強(qiáng)度(紅色)明顯增加，且主要表達(dá)在NeuN表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元的胞漿中(綠色)，黃色部分即Nav1.8和NeuN重疊的部分，定量后可見Nav1.8/NeuN雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯增加(P<0.05)；與H組相比，I組損傷后Nav1.8和NeuN熒光強(qiáng)度明顯降低，且Nav1.8/NeuN雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量也明顯減少(P<0.05)，見圖3。

圖3　缺血再灌注損傷后第7天大鼠脊髓背角神經(jīng)元與Nav1.8通道變化及Nav1.8/NeuN雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.3大鼠脊髓組織Nav1.8 mRNA表達(dá)的變化RT-PCR結(jié)果顯示:與S組相比，術(shù)后各觀察點(diǎn)H組大鼠脊髓組織中Nav1.8 mRNA表達(dá)均增高，尤以第7天為著(P<0.05)；與H組相比，I組大鼠脊髓組織中Nav1.8 mRNA表達(dá)在術(shù)后明顯下降(P<0.05)，見表1。

3　討論

SCIRI臨床常見于脊柱手術(shù)、血管畸形以及心臟手術(shù)體外循環(huán)期間等，以損傷平面以下感覺功能異常和運(yùn)動(dòng)功能缺失最為常見，且后果嚴(yán)重，給患者帶來(lái)巨大的痛苦和社會(huì)負(fù)擔(dān)[6,8]。本研究采用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉14 min后再開放模擬缺血再灌注過(guò)程，術(shù)后2周內(nèi)大鼠雙下肢出現(xiàn)了明顯的自發(fā)性疼痛(縮足現(xiàn)象)、不敢著地以及明顯的觸誘發(fā)痛和熱痛敏，而未現(xiàn)下肢癱瘓和感染等征象，標(biāo)志著術(shù)后痛覺過(guò)敏的成功建立。

表1　各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織Nav1.8 mRNA表達(dá)

注：與S組比較，*P<0.05；與H組比較，#P<0.05

關(guān)于痛覺過(guò)敏的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，通常認(rèn)為與神經(jīng)元異常電活動(dòng)形成有關(guān)[2]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)外周感覺神經(jīng)元上特異性表達(dá)Nav1.8鈉通道，在神經(jīng)損傷后可以產(chǎn)生慢失活河豚毒素不敏感(TTX-R)鈉電流，誘發(fā)動(dòng)作電位產(chǎn)生，進(jìn)而誘發(fā)痛覺過(guò)敏[9-10]。Lai等[11]采用鞘內(nèi)連續(xù)注射反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，AMO)的方法成功緩解損傷后3 d大鼠術(shù)側(cè)痛覺過(guò)敏的癥狀，但在術(shù)后5 d沒有明顯治療作用。這可能與AMO易被機(jī)體消化酶分解，且只有足量的AMO進(jìn)入靶細(xì)胞才能發(fā)揮有效的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，因此限制了AMO對(duì)長(zhǎng)期痛覺過(guò)敏的治療作用。而基因敲除的方法雖可有效緩解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛覺缺失[5]，但目前尚無(wú)在人體中應(yīng)用的先例。因此，選擇有效的抑制鈉通路的藥物對(duì)治療和預(yù)防痛覺過(guò)敏至關(guān)重要。

既往研究發(fā)現(xiàn)，鈉通道抑制劑619C89[4氨基2(4甲基1哌嗪)5(2,3,5三氯苯基)嘧啶通過(guò)影響損傷神經(jīng)軸突區(qū)鈉通道異常堆積[12-13]，限制神經(jīng)末梢突觸前的谷氨酸和天冬氨酸釋放，減輕卒中患者腦水腫[14]。因此，本研究通過(guò)觀察鞘內(nèi)注射619C89對(duì)缺血再灌注損傷后引起的痛覺過(guò)敏大鼠的熱痛閾和機(jī)械痛閾的影響，探討脊髓背角神經(jīng)元中Nav1.8表達(dá)在其中的作用。同樣，在本實(shí)驗(yàn)中，損傷前3 d鞘內(nèi)連續(xù)注射619C89能夠明顯提高大鼠雙足PWL值和PWT值，證實(shí)抑制鈉通道可以明確減輕神經(jīng)元反復(fù)、異常的電活動(dòng)所引起痛覺過(guò)敏。本實(shí)驗(yàn)中PWT值和PWL值在術(shù)后7 d變化最明顯，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選擇損傷后第7天觀察脊髓背角病理學(xué)變化和對(duì)脊髓組織中Nav1.8 mRNA表達(dá)的影響。免疫熒光技術(shù)是近年來(lái)最常用的直接顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)是否存在目的抗原或半抗原的實(shí)驗(yàn)手段[6,8]。本實(shí)驗(yàn)采用熒光雙染的方法通過(guò)觀察神經(jīng)元與Nav1.8在脊髓背角是否存在一致性分布，確認(rèn)兩者間的內(nèi)在聯(lián)系。NeuN作為神經(jīng)元特異性標(biāo)記物，痛覺過(guò)敏后鏡下可見大鼠脊髓背角中神經(jīng)元的胞體明顯增大，熒光強(qiáng)度(綠色)增加，同時(shí)，脊髓背角中Nav1.8的熒光強(qiáng)度(紅色)明顯增加，且Nav1.8主要表達(dá)在NeuN表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元胞漿中，即黃色重疊部分。定量分析結(jié)果顯示，給予鈉通道抑制劑可以明顯減少痛覺過(guò)敏引起的Nav1.8/NeuN雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量增加，由此推測(cè)Nav1.8參與了痛覺過(guò)敏中神經(jīng)元的激活。同時(shí)使用PCR法檢測(cè)術(shù)后第1、3、5、7、14天脊髓組織中Nav1.8 mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在各時(shí)間點(diǎn)H組Nav1.8 mRNA含量明顯高于S組，與PWT值和PWL值呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)脊髓背角神經(jīng)通過(guò)上調(diào)Nav1.8參與痛覺過(guò)敏的形成，與Li等[15-16]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究通過(guò)觀察鞘內(nèi)注射鈉通道抑制劑619C89對(duì)缺血再灌注損傷后痛覺過(guò)敏大鼠痛閾和脊髓病理學(xué)變化的影響，證實(shí)脊髓背角神經(jīng)元Nav1.8參與痛覺過(guò)敏的發(fā)生和發(fā)展，為臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新的治療靶點(diǎn)。

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收稿日期：2016-01-27

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2012408002)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607003

Mechanisms of ischemia-reperfusion induced hyperalgesia via up-regulation of neuronal Nav1.8 channel in spinal dorsal horn

LI Xiao-qian,ZHANG Zai-li,MA Hong*

(Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of intrathecal injection (IT) of Nav1.8 channel inhibitor 619C89 on hyperalgesia and spinal cord levels of neuronal Nav1.8 expressions in rat model of spinal cord ischemia-reperfusion injury (SCIRI).MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:group S,group H (SCIRI+IT NS) and Nav1.8 channel inhibitor group (group I,SCIRI+IT 5 μg/30 μL 619C89).The lumbar intrathecal catheters were implanted in L5-6of rats and SCIRI models were established by aortic arch occlusion for 14 min.The thermal and mechanical nociceptive thresholds were assessed by paw withdrawal latency (PWL) to radiant heat and von Frey filaments.The 619C89 was administered intrathecally for 3 days before surgery.The spinal mRNA expression of Nav1.8 was assessed by Real time-PCR and double immunofluorescence staining was performed for examination of the distribution of neurons and Nav1.8 and also quantification of NeuN/Nav1.8 positive cells of dorsal horn at 1,3,5,7 and 14 days after surgery. ResultsCompared with group S,animals in group H had significantly lower mechanical and thermal pain thresholds,but higher spinal mRNA expression of Nav1.8 (P<0.05).Rats in group I had significantly higher mechanical and thermal pain thresholds and significantly lower mRNA expression of Nav1.8 compared with those in group H (at any observed time points after IR,but most significantly at 7 days,P<0.05).Double fluorescent staining showed the distribution of increased fluorescence intensity of Nav1.8 was similar to that of fluorescent staining of NeuN (neuronal marker).The number of NeuN/Nav1.8 positive cells was greatly increased in group H,whereas the number was obviously decreased in group I (P<0.05).ConclusionUp-regulation of neuronal Nav1.8 channel in spinal dorsal horn plays a role in IR-induced hyperalgesia.

Key words：Hyperalgesia;Neuron;Na channel inhibitor;Nav1.8 channel