N-甲基-D-天冬氨酸受體抑制劑鹽酸美金剛對(duì)老年性癡呆大鼠β-淀粉樣前體蛋白及β分泌酶表達(dá)的影響

吳芳

(重慶三峽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶　404000)

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N-甲基-D-天冬氨酸受體抑制劑鹽酸美金剛對(duì)老年性癡呆大鼠β-淀粉樣前體蛋白及β分泌酶表達(dá)的影響

吳芳

(重慶三峽中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶404000)

摘要:目的探討N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體抑制劑鹽酸美金剛對(duì)老年性癡呆(AD)大鼠β-淀粉樣前體蛋白(APP)及β分泌酶(BACE1)表達(dá)的影響。方法30只SD大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、治療組(鹽酸美金剛組)；除假手術(shù)組外，其余兩組大鼠海馬注射10 μg β-淀粉樣蛋白(Aβ)1-40構(gòu)建AD大鼠模型，治療組大鼠腹腔注射10 mg·kg-1·d-1鹽酸美金剛，其余兩組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14 d，并于第1、3、7、14 天采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，于14 d處死大鼠取血及海馬組織。ELISA法檢測(cè)血清及海馬組織中Aβ含量，western blot及RT-PCR法檢測(cè)海馬組織中APP和BACE1蛋白及mRNA表達(dá)量。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠水迷宮潛伏期延長，Aβ含量顯著提高，APP及BACE1蛋白及mRNA含量顯著提高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，治療組大鼠水迷宮潛伏期縮短，Aβ含量顯著降低，APP及BACE1蛋白及mRNA含量顯著下降，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論鹽酸美金剛能通過阻斷APP裂解，從而抑制AD大鼠海馬組織中Aβ沉積。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病;美金剛;受體,N-甲基-D-天冬氨酸;淀粉樣前體蛋白分泌酶類;大鼠,Sprague-Dawley

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床主要病理特征為老年斑形成，神經(jīng)元纏結(jié)及丟失。β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是老年斑的主要成分，在腦內(nèi)沉積可引起神經(jīng)元的丟失死亡[1-3]。Aβ的形成是神經(jīng)細(xì)胞膜上β-淀粉樣前體蛋白(APP)在β分泌酶(BACE1)作用下產(chǎn)生的[4]。因此，通過抑制APP降解，能有效的抑制Aβ形成，從而緩解AD患者老年斑形成。鹽酸美金剛是是一種新型的，低中度親和力，電壓依賴的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體非競爭性抑制劑，已被美國FDA批準(zhǔn)用于中、重度AD患者的治療。同時(shí)臨床研究也已證實(shí)鹽酸美金剛對(duì)中、重度AD患者具有顯著療效，且鹽酸美金剛治療AD患者的機(jī)制主要集中于能夠拮抗NMDA受體，從而阻滯NMDA引起的谷氨酸興奮性損傷，減輕細(xì)胞凋亡，改善學(xué)習(xí)記憶功能[5-7]。而對(duì)于鹽酸美金剛是否能通過阻止APP裂解，進(jìn)而抑制Aβ生成還未見報(bào)道。因此，本研究擬通過構(gòu)建AD模型大鼠，通過腹腔注射給予鹽酸美金剛，檢測(cè)治療前后大鼠海馬組織中APP，BACE及Aβ含量的變化。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只SD大鼠，體重(200±20)g，清潔級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證(SCXK(滬)2012-0002)。室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.1.2主要試劑及儀器鹽酸美金剛購自丹麥靈北藥廠，批號(hào)：D1420011991；大鼠Aβ1-40檢測(cè)試劑盒(上海豐壽實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：fs-3558)；兔抗APP，BACE1單克隆抗體(美國Epitmics公司)；迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備[4]大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，剔除大鼠頭部毛發(fā)，碘消毒。參考相關(guān)文獻(xiàn)，沿著小鼠大腦矢狀線切開皮膚，使顱骨暴露，并用牙科鉆鉆開顱骨使腦膜暴露出來，將微量注射器垂直插入，緩慢注射2 μL Aβ1-40(10 μg)，5 min注射結(jié)束，并留針5 min。用牙科泥封堵住后，常規(guī)縫合頭部皮膚并消毒。假手術(shù)組注入等量生理鹽水，其余步驟與模型組一致。

1.2.2分組及給藥[8-9]大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、鹽酸美金剛組，于術(shù)后24 h對(duì)模型動(dòng)物注射10 mg·kg-1·d-1鹽酸美金剛，其余兩組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。大鼠處死，并取血分離出血清用于Aβ的檢測(cè)，后心臟灌注生理鹽水取出大腦，并于冰上分離出海馬組織，用于RT-PCR及western blot檢測(cè)。

1.2.3認(rèn)知功能測(cè)定[9]采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。整個(gè)認(rèn)知功能測(cè)試過程中，保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光，物品擺放位置的不變，以排除環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干擾。

1.2.4血清及海馬組織中Aβ含量檢測(cè)根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)血清及海馬組織中Aβ含量。

1.2.5RT-PCR根據(jù)trizol試劑盒(Invitrogen)說明書提取海馬組織總RNA，并檢測(cè)RNA純度。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測(cè)并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s，59 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)。引物如表1。

表1　RT-PCR引物

1.2.6western blot海馬組織經(jīng)勻漿后，加入組織裂解液，離心獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣，SDS凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。一抗孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1-2 h。膜上滴加ECL曝光液，凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用Quantity one軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠水迷宮潛伏期延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，治療組大鼠水迷宮潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2各組大鼠血清及海馬組織中Aβ含量的測(cè)定如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組血清及海馬組織中Aβ含量顯著提高；與模型組比較，治療組血清及海馬組織中Aβ含量顯著降低；均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2　各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

表3各組大鼠血清及海馬組織中Aβ含量的測(cè)定

組別鼠數(shù)血清海馬假手術(shù)組102.48±0.290.22±0.02模型組103.67±0.37a0.43±0.05a治療組102.54±0.26b0.28±0.03bF值9.3767.993P值<0.05<0.05

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

2.3各組大鼠海馬組織中APP及BACE1蛋白含量的測(cè)定如圖1、表4所示，與假手術(shù)組比較，模型組血清及海馬組織中APP及BACE1蛋白含量顯著提高；與模型組比較，治療組血清及海馬組織中APP及BACE1蛋白含量顯著降低；均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1　各組大鼠海馬組織中APP及BACE1蛋白含量的測(cè)定表4　各組大鼠海馬組織中APP及BACE1蛋白 含量的測(cè)定±s

組別鼠數(shù)APP/GAPDHBACE1/GAPDH假手術(shù)組100.13±0.010.12±0.01模型組100.49±0.05a0.46±0.05a治療組100.26±0.02b0.25±0.02bF值15.29112.524P值<0.01<0.01

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

2.4各組大鼠海馬組織中APP和BACE1 mRNA含量的測(cè)定如圖2、表5所示，與假手術(shù)組比較，模型組血清及海馬組織中APP及BACE1 mRNA含量顯著提高；與模型組比較，治療組血清及海馬組織中APP及BACE1 mRNA含量顯著降低；差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2　各組大鼠海馬組織中APP及BACE1 mRNA 含量的測(cè)定表5　各組大鼠海馬組織中APP及BACE1 mRNA 含量的測(cè)定±s

組別鼠數(shù)APP/GAPDHBACE1/GAPDH假手術(shù)組100.15±0.010.15±0.01模型組100.48±0.05a0.67±0.07a治療組100.18±0.02b0.29±0.03bF值17.43621.034P值<0.01<0.01

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3　討論

鹽酸美金剛是美國批準(zhǔn)用于治療AD的谷氨酸NMDA受體非競爭性抑制劑，其治療中、重度AD患者療效顯著。同時(shí)國內(nèi)學(xué)者趙寶敏等[9]發(fā)現(xiàn)鹽酸美金剛能改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并能上調(diào)NR1，NR2A，NR2B。孫玉華等[10]也發(fā)現(xiàn)鹽酸美金剛能清除血管癡呆大鼠海馬區(qū)自由基，減輕組織損傷，并上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)從而保護(hù)神經(jīng)元。而鹽酸美金剛對(duì)于AD模型大鼠的治療作用機(jī)制尚未見報(bào)道。所以本研究擬通過構(gòu)建AD模型大鼠，并通過鹽酸美金剛進(jìn)行干預(yù)，從而探討鹽酸美金剛治療AD的相關(guān)機(jī)制。首先通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)鹽酸美金剛能顯著的縮短水迷宮潛伏期。

老年斑是AD病理學(xué)特征之一，大量存在于AD患者的大腦皮層及海馬區(qū)。Aβ是老年斑的主要成分，是AD發(fā)生，發(fā)展的促進(jìn)因素，能導(dǎo)致神經(jīng)元纏結(jié)及神經(jīng)元缺失，因此由Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞或動(dòng)物模型常作為AD模型進(jìn)行相關(guān)研究，也說明了通過清除Aβ的沉積能阻止AD的發(fā)展[4,11]。Aβ是由APP裂解產(chǎn)生的。APP是種Ⅰ型跨膜糖蛋白，定位于人染色體21q21.2，表達(dá)于中樞神經(jīng)細(xì)胞，在生理水平下能維持細(xì)胞與細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)間的信號(hào)，參與神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)識(shí)別、細(xì)胞粘附，凋亡及神經(jīng)保護(hù)等生理過程。其氨基酸具有保守生長因子樣區(qū)域，通過α、γ或β、γ等分泌酶的剪切，參與多種靶蛋白的調(diào)控。APP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物亦常作為AD動(dòng)物模型進(jìn)行研究[12]。在正常生理狀況下，APP主要通過α途徑進(jìn)行代謝，不產(chǎn)生Aβ，在病理狀況下通過β途徑，在BACE1等酶作用下，裂解產(chǎn)生Aβ，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生[13]。BACE1廣泛存在于多種組織中，其中腦組織中的皮層、海馬及小腦中表達(dá)較高，而在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量幾乎沒有。已有研究證實(shí)BACE1反義寡核苷酸能夠顯著抑制APP的β裂解[14]。同時(shí)也有研究證實(shí)BACE1-/- AD小鼠認(rèn)知功能得到顯著改善，并使Aβ形成減少[15]。因此通過抑制BACE1表達(dá)，進(jìn)而抑制APP的β裂解，最終減少Aβ形成，不失為治療AD的一種有效策略。

所以，本研究通過Aβ注射SD大鼠海馬，從而構(gòu)建AD大鼠模型，并于術(shù)后24 h腹腔注射鹽酸美金剛，連續(xù)給藥14 d后，取血及海馬組織，ELISA法檢測(cè)血清及海馬組織中Aβ含量，結(jié)果表明模型組中Aβ含量顯著提高，而鹽酸美金剛能顯著的降低AD大鼠血清及海馬組織中Aβ含量。因此我們進(jìn)一步檢測(cè)Aβ來源物及生成關(guān)鍵酶，即APP和BACE1蛋白及mRNA含量，western blot及RT-PCR結(jié)果均表明鹽酸美金剛能顯著降低AD大鼠海馬組織中APP和BACE1表達(dá)。

綜上所述，鹽酸美金剛能顯著的降低AD大鼠血清及海馬組織中Aβ的形成，并能下調(diào)海馬組織中APP及BACE1蛋白與mRNA的表達(dá)，從而說明鹽酸美金剛通過抑制BACE1表達(dá)，從而阻止APP的β裂解，減少Aβ的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療AD大鼠的目的。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.006

(收稿日期：2016-02-09，修回日期：2016-04-01)

Effect of NMDA on the expression of APP and BACE1 in Alzheimer’s disease rats

WU Fang

(DepartmentofNeurology,SanxiaCentralHospital,Chongqing404000,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor inhibitor(memantine) on the expression of amyloid precursor protein(APP) and β-secretase(BACE1) in Alzheimer’s disease(AD) rats.MethodsThirty SD rats were randomized into three groups:sham operation group(n=10),model group(n=10),treatment group(memantine group)(n=10).The AD rats model was built by injecting 10 μg β-amyloid protein(Aβ)1-40 to hippocampus.The rats received intraperitoneal injection of 10 mg·kg-1·d-1memantine for 8 d in treatment group,while the rats were given the same amount of normal saline in normal and model group.The spatial learning and memory ability of rats was detected by Morris water maze test in 1,3,7,and14 d.The level of Aβ in serum and hippocampus was examined by ELISA method.The expressions of APP and BACE1 protein and mRNA in hippocampus were assayed by Western blot and RT-PCR.ResultsCompared with ham operation group,the escape latency in the water maze training prolonged,the level of Aβ in serum and hippocampus increased,and the expressions of APP and BACE1 protein and mRNA in hippocampus were upregulated in model group with statistically significant difference(P<0.01).Compared with model group,the escape latency in the water maze training decreased,the level of Aβ in serum and hippocampus decreased,and the expressions of APP and BACE1 protein and mRNA in hippocampus were downregulated in treatment group with statistically significant difference(P<0.01).ConclusionsThese results suggested that memantine could inhibit the APP cleavage,thereby inhibiting Aβ deposition of hippocampal tissue in AD rats.

Key words:Alzheimer disease;Memantine;Receptors,N-Methyl-D-Aspartate;Amyloid precursor protein secretases;Rats,Sprague-Dawley