正交試驗法優(yōu)選芪貞降糖顆粒提取工藝

丁麗玉，張丹，許瑩，吳飛2d

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,a藥劑科，b內分泌科，上?！?00437；2.上海中醫(yī)藥大學,c中藥學院，d中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上?！?01203)

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正交試驗法優(yōu)選芪貞降糖顆粒提取工藝

丁麗玉1a，張丹1b，許瑩2c，吳飛2c2d

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院,a藥劑科，b內分泌科，上海200437；2.上海中醫(yī)藥大學,c中藥學院，d中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海201203)

摘要：目的優(yōu)選芪貞降糖顆粒的提取工藝。方法采用HPLC法測定枸櫞酸、特女貞苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量；以3個成分轉移率和出膏率為指標，通過L9(34 )正交試驗考察加水量、提取時間、提取次數對提取工藝的影響，并設計了驗證試驗。結果最佳提取工藝條件為加10倍量水提取3次，每次1.5 h。結論優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，提取率高。

關鍵詞：正交試驗；黃芪；女貞子；中藥工藝改進

芪貞降糖方是上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院內分泌科用于治療Ⅱ型糖尿病或糖調節(jié)異常的協(xié)定方，由烏梅、靈芝、黃芪和女貞子4味中藥組成，其中烏梅為君，靈芝為臣，黃芪和女貞子為佐使。配伍合理，組方精煉，臨床應用10余年，在改善患者胰島素抵抗、調節(jié)糖代謝等方面療效顯著[1-6]。

沿襲臨床用法，本實驗采用水提取工藝，對溶劑用量、提取時間、提取次數等因素進行系統(tǒng)考察，以枸櫞酸、特女貞苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷[7]轉移率以及出膏率作為監(jiān)控指標，采用正交試驗法[8-9]對芪貞降糖顆粒的提取工藝進行優(yōu)選并驗證，得到最佳提取工藝參數，為處方的整個制劑工藝奠定基礎。

1　材料

1.1儀器1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Kromasil 100-5C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，FA2104N型電子天平(0.1 mg,上海精密科學儀器有限公司)，XP205型電子天平(0.01mg，梅特勒-托利多中國有限公司),DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，TGL-18C型高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，HWS26型水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2試藥枸櫞酸(批號100396-201302)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號111920-201102)，特女貞苷對照品(批號111926-201404)：均購自中國藥品生物制品檢定所。

黃芪(批號141210，甘肅)，制烏梅(批號140913，浙江)，制女貞子(批號141125，湖南)，靈芝(批號141105，山東)：均購自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司。

2　方法

2.1出膏率的測定取200 mL水煎液，減壓濃縮后轉移至已恒重的干燥蒸發(fā)皿中，水浴(105℃)蒸至近干，置真空烘箱80℃下減壓干燥至恒重，計算出膏率。

2.2枸櫞酸的含量測定

2.2.1色譜條件流動相為0.1%磷酸溶液，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，波長210 nm，對照品進樣10 μL，樣品進樣5 μL。見圖1。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取枸櫞酸對照品適量，加甲醇制成濃度為0.5290 g·L-1的溶液。

2.2.3供試品溶液的制備按處方比例分別稱取烏梅、靈芝、黃芪和女貞子，以水煎煮提取，提取液高速離心5 min后，取上清液進行HPLC測定。同法制備缺烏梅的陰性樣品。

2.2.4精密度試驗精密吸取枸櫞酸對照品溶液10 μL，重復進樣6次，記錄峰面積。峰面積RSD為0.2%，說明進樣精密度良好。

2.2.5線性關系考察分別精密吸取枸櫞酸對照品溶液0.5，1，2，5，10，20和50 μL，進行HPLC分析，以進樣質量對峰面積進行線性回歸，得回歸方程Y=65.222 4X+2.021 4(r=1.000 0)，表明枸櫞酸進樣質量在0.26～26.45 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.3特女貞苷的含量測定

2.3.1色譜條件流動相為水∶甲醇(60∶40)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，波長224 nm，對照品進樣2.5 μL，樣品進樣10 μL。見圖2。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取特女貞苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.2515 g·L-1的溶液。

2.3.3供試品溶液的制備按處方比例分別稱取烏梅、靈芝、黃芪和女貞子，以水煎煮提取，高速離心5 min后，取上清液進行HPLC測定。同法制備缺女貞子的陰性樣品。

2.3.4精密度試驗精密吸特女貞苷對照品溶液2.5 μL，重復進樣6次，記錄峰面積。峰面積RSD為0.2%，說明進樣精密度良好。

2.3.5線性關系考察分別精密量取對照品溶液0.2，0.5，1，2，5和10 μL，進行HPLC分析，以進樣質量對峰面積進行線性回歸，得回歸方程Y=1164.9483X+29.2150(r=0.999 9)，表明特女貞苷進樣質量在0.05～2.52 μg 范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定

2.4.1色譜條件[10]流動相為乙腈(A)和0.2%甲酸溶液(B)梯度洗脫(0～13 min，13%～15% A；13～23 min，15%～20% A；23～30 min，20%～40% A；30～40 min，40%A)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，波長260 nm，對照品1 μL，樣品30 μL。見圖3。

A：枸櫞酸對照品

B：供試品

C：缺烏梅陰性樣品

圖1芪貞降糖顆粒提取液中枸櫞酸測定的HPLC圖譜

A：特女貞苷對照品

B：供試品

C：缺女貞子陰性樣品

圖2芪貞降糖顆粒提取液中特女貞苷測定的HPLC圖譜

A：毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品

B：供試品

C：缺黃芪陰性樣品

圖3芪貞降糖顆粒提取液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷測定的HPLC圖譜

2.4.2對照品溶液的制備精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成濃度為56.75 mg·L-1的溶液。

2.4.3供試品溶液的制備按處方比例分別稱取烏梅、靈芝、黃芪和女貞子，以水煎煮提取，高速離心5 min后，取上清液進行HPLC測定。同法制備缺黃芪的陰性樣品。

2.4.4精密度試驗精密吸取枸櫞酸對照品溶液1 μL，重復進樣6次，記錄峰面積。峰面積RSD為2.8%，說明進樣精密度良好。

2.4.5線性關系考察精密量取上述對照品溶液0.2，0.5，1，2和5 μL，進行HPLC分析，以進樣質量對峰面積進行線性回歸，得回歸方程Y=3.703 5X+1.958 2(r=1.000 0)，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷進樣質量在11.35～283.75 ng 范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5正交試驗設計分別稱取烏梅15 g、靈芝15 g、黃芪12 g和女貞子12 g，采用正交試驗法優(yōu)選水提取工藝，以加水量、提取時間、提取次數為考察因素，每個因素設3個水平，以特女貞苷、枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率和出膏率的綜合評分為考察指標，每組平行處理2份。因素水平見表1。

表1　芪貞降糖顆粒的提取工藝正交試驗因素水平表

3　結果

3.1正交試驗正交試驗結果見表2～5。

根據直觀分析結果，對4個指標影響最大的因素是提取次數，其次為提取時間和加水倍量。枸櫞酸轉移率最佳的提取工藝為A3B3C3，毛蕊異黃酮葡萄糖苷轉移率最佳的提取工藝為A3B3C3，特女貞苷轉移率最佳的提取工藝為A3B3C2，出膏率最佳的提取工藝也是A3B3C3。

表3方差分析結果表明，提取次數對4個指標均有顯著性影響，提取時間對毛蕊異黃酮葡萄糖苷的轉移率有顯著性影響，加水倍量對特女貞苷的轉移率有顯著性影響。

表2　正交試驗工藝及結果

注： 4個因素(A、B、C和D)中1、2和3指的是各因素的3個水平。

表3　方差分析結果

表4　提取工藝正交試驗綜合評分直觀分析表

表5　提取工藝正交試驗綜合評分方差分析表

注：D為空白項，F0.05(2，2)=19.0。

綜合4組結果，最佳因素水平組合略存在分歧，為統(tǒng)一結果，以枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷轉移率的綜合評分，對正交實驗結果進行分析。評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化處理，再根據各成分在處方中地位，烏梅是君藥，黃芪和女貞子處方中均屬佐使藥，3藥的用量接近，其活性成分的轉移情況對判斷工藝均具有重要的指導意義，故將枸櫞酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷的權重系數均設為0.3。綜合評分直觀及方差分析結果如下表4、5。

表4直觀分析結果表明，最佳因素水平組合為A3B3C3，對綜合指標影響最大的因素是提取次數，其次為提取時間和加水倍量。

表5方差分析結果表明加水倍量無顯著性影響，提取次數和提取時間均差異有統(tǒng)計學意義。需要設計驗證實驗進行最佳工藝的驗證。

3.2驗證試驗對提取次數和提取時間進行擴大水平驗證，同時對加水倍量進行擴展驗證，實驗設計和結果見表6。

比較第1組和第4組，隨著提取次數增加1次，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和特女貞苷的轉移率顯著增加，但是枸櫞酸卻有明顯下降，綜合動力成本和工藝的可行性考慮，確定提取次數為3次。

表6　提取正交驗證試驗結果表

比較第1、2和3組，隨著提取時間的繼續(xù)增加，3個指標的轉移率未能大幅度增加，選定提取時間為1.5 h。

比較第1組和第5組，隨著提取溶劑體積的繼續(xù)增加，特女貞苷轉移率顯著增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷基本無變化，但是枸櫞酸有明顯下降，最后選定加水倍量為10倍。

根據正交試驗驗證實驗的結果，確定芪貞降糖顆粒的最佳提取工藝為：加水10倍量，提取3次，每次1.5 h。

4　討論

根據新的中藥制劑質量控制思路，需要選擇能夠特征性指示工藝可靠性的成分來監(jiān)控制劑過程中的工藝變化。本處方包含4味藥，本研究選擇其中3味重要的藥材中的水溶性良好的特征性成分結合出膏率作為正交試驗考察的指標，可以有效篩選出最佳的制劑工藝。

女貞子中的指標性成分特女貞苷水溶性良好，但是提取效率不高，可能是因為女貞子藥用部位是干燥的果實，質地硬實，特女貞苷不易浸出。一些研究[11-13]在制劑時預先將女貞子雜碎或者粉碎過篩，可以有效提高提取效率。但是筆者認為醫(yī)院制劑若與臨床用法保持一致，則首先需要保證處方成分的炮制或提取前處理方法一致，不能盲目為提高一些指標性成分而直接更改飲片的處理工藝，除非進行相應的制劑臨床效果對比評價。

對于HPLC法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的方法，文獻中已有一些報道[14-15]，主要分為等度洗脫、梯度洗脫，本文參考了李圓圓等[10]的分離條件。

之前的臨床研究中，也曾委托加工單位進行制劑的加工，并以這些加工的顆粒進行相關的臨床試驗[3-6]，但是一直未有對處方比例進行固定，也未曾系統(tǒng)考察過制劑工藝。本研究首次系統(tǒng)對提取工藝進行考察，以正交試驗優(yōu)化最佳提取參數并驗證，為將芪貞降糖方開發(fā)成為標準的醫(yī)院制劑打下堅實的基礎。

參考文獻

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基金項目：上海市衛(wèi)計委中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑能力提升項目(ZY3-JSFC-2-2017)

通信作者：吳飛，男，副研究員，研究方向：中藥制劑分析和藥物分析，E-mail:a1983d3891h@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.005

(收稿日期：2016-02-18，修回日期：2016-05-08)

Optimization of extraction process parameters for Qizhenjiangtang Granules by orthogonal test

DING Liyu1a,ZHANG Dan1b,XU Ying2,et al

(1a.DepartmentofPharmacy;1b.DepartmentofEndocrinology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China;2.CollegeofChineseMaterialMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction process parameters of Qizhenjiangtang granules．MethodsHPLC was used to determine the contents of citric acid,specnuezhenide and calycosin-7-O-β-D-glycoside.With 3 component transfer ratios and solid contents as indexes,the parameters(amount of water,extraction time,times of extraction) on extraction technology were investigated by L9(34 ) orthogonal test．ResultsOptimal extraction technology conditions were as follows:extracted for 3 times with 10 folds the amount of water，1.5 h per time．ConclusionThe optimized extraction technology was stable and feasible with high extraction rate of the index components．

Key words:Orthogonal test；Astragalus membranaceus；Fructus ligustri lucidi；Technology improving(TCD)