鹽酸抗原修復(fù)Brdu免疫組化檢測在腦組織中的應(yīng)用*

王　坦　鄭婉君　高劍峰

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【實(shí)驗(yàn)研究】

鹽酸抗原修復(fù)Brdu免疫組化檢測在腦組織中的應(yīng)用*

王坦1鄭婉君2高劍峰2

1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室(鄭州 450000); 2.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室(鄭州 450000)

摘要：目的探索簡單有效的Brdu免疫組織化學(xué)染色抗原修復(fù)方法，提高實(shí)驗(yàn)成功率和改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果。方法通過實(shí)驗(yàn)對三種抗原修復(fù)方法：①水浴鍋煮沸修復(fù)法，②微波修復(fù)法，③Hcl酸化破膜法，采集圖像進(jìn)行比較，探索出Brdu免疫組織化學(xué)DAB染色最有效方法。結(jié)果①水浴鍋煮沸修復(fù)法：組織抗原暴露不全，背景較深，不能很好的顯示Brdu的陽性結(jié)果。②微波修復(fù)法：組織中Brdu暴露不全，增加加熱時間會使組織切片脫落嚴(yán)重，加熱時間少則背景深，Brdu不能很好的與抗體結(jié)合，實(shí)驗(yàn)多數(shù)為陰性。③Hcl酸修復(fù)法：組織背景色較淺，Brdu陽性與背景色對比明顯，同時能完全檢測Brdu在細(xì)胞中的位置。結(jié)論Hcl酸化修復(fù)法能很好的顯示細(xì)胞核DNA鑲嵌的Brdu，抗體容易進(jìn)入細(xì)胞核中與之結(jié)合，顯色效果明顯，操作簡單易行，同時無熱源，安全性較好，是一種較為理想的檢測方法。

關(guān)鍵詞：Brdu; 免疫組織化學(xué)；抗原修復(fù)

Brdu(5-Bromo-2-deoxyUridine 5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸)是一種參與細(xì)胞DNA(脫氧核糖核酸)合成的核苷酸類物質(zhì)，一般Brdu作為跟蹤劑用于細(xì)胞周期檢測、細(xì)胞分裂增生和DNA合成檢測[1]。細(xì)胞周期包括分裂期和分裂間期，在分裂間期的S期為DNA合成期，細(xì)胞核內(nèi)DNA進(jìn)行半保留復(fù)制，加入Brdu后，Brdu可進(jìn)入新合成的DNA鏈中，在不受紫外線照射細(xì)胞存活情況下可以永久存在。通過檢測Brdu可以得到細(xì)胞存活、分化和增生情況。因此Brdu常用于神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)的跟蹤劑[2]。

動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)腹腔注射Brdu，通過腹膜吸收入血，通過血液運(yùn)輸進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞中。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受損時，Brdu作為核酸類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核DNA中，參與DNA的復(fù)制。神經(jīng)細(xì)胞受損越重但細(xì)胞不能死亡，Brdu進(jìn)入細(xì)胞核DNA中越多，檢測Brdu可以間接得到神經(jīng)細(xì)胞受損和修復(fù)情況。而在檢測石蠟組織中的Brdu表達(dá)，特別是在腦組織中檢測，由于需要福爾馬林的固定，抗原變性，背景色較重，Brdu表達(dá)對比較差。為了得到清晰圖像我們進(jìn)行三種抗原修復(fù)方法進(jìn)行比較，為后期實(shí)驗(yàn)選出合適的修復(fù)方法打下基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑和動物Brdu購自于Solarbio公司(批號：1029C031)，Brdu抗體來源于大鼠單克隆抗體購自于abcam公司(批號：ab6326)，山羊抗大鼠IgG購自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號：bs-0293 g-HRP)，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液山羊血清購自于中杉金橋試劑公司(批號: SAP-9100)，DAB顯色試劑盒購自于武漢博士德生物工程有限公司(批號AR1022)，小鼠 C57BL/6J，體質(zhì)量15～25 g, 購置于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2動物模型制備選用健康清潔級的30日齡C57BL/6J小鼠100只，隨機(jī)分為模型組(無電針)；非穴位組(電針針刺尾部)；電針穴位組(百會、風(fēng)府、雙側(cè)腎俞)。放射線照射后次日開始電針刺激，第一次針刺干預(yù)開始后立即腹腔注射Brdu(40mg/kg)，每天1次，連續(xù)7天，末次Brdu注射后灌注取材。

1.3組織制備動物經(jīng)2%戊巴比妥鈉，0.1ml/10 g麻醉，心臟灌注福爾馬林固定液固定，取腦組織，常規(guī)脫水石蠟包埋。

1.4抗原修復(fù)將石蠟組織切片2μm貼到粘附片上，共計(jì)33張，用水浴鍋煮沸修復(fù)、微波修復(fù)和Hcl破膜暴露三種方法進(jìn)行Brdu暴露[3]。 具體方法如下：石蠟切片脫蠟至水，把切片放入0.3%的H2O2溶液中浸泡20分鐘，溫度為37℃孵育，雙蒸水洗2次，每次3分鐘，溫度37℃，去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后分別進(jìn)行水浴鍋煮沸修復(fù)、微波修復(fù)和Hcl修復(fù)。水浴鍋煮沸法修復(fù)：將孵育好的切片11張放入0.01ml/L檸檬酸鈉緩沖修復(fù)液中，置于電熱爐上，待水沸騰后計(jì)時30分鐘，放入PBS溶液中3次×3分鐘。微波法修復(fù)：將孵育好的切片11張放入0.01ml/L檸檬酸鈉緩沖修復(fù)液中，置于微波爐中，中火20分鐘，放入PBS溶液中3次×3分鐘。Hcl修復(fù)：將孵育好的切片11張放入2M 的Hcl中，室溫10分鐘，恒溫箱37℃，20分鐘，放入硼酸鹽溶液(0.1M/L)中室溫10分鐘，恒溫箱37℃，20分鐘。PBS溶液洗3次×3分鐘。

1.5免疫組織化學(xué)DAB染色[4]將三種抗原修復(fù)法修復(fù)后的切片用山羊血清封閉，37℃，15分鐘，甩去多余血清，不洗。Brdu一抗?jié)饪s液按梯度1/20、1/80、1/120、1/200和1/500濃度。PBS溶液稀釋進(jìn)行滴加,每個濃度抗體滴加2張，1張滴加PBS代替一抗作為陰性對照。4℃冰箱過夜，取出后室溫30分鐘。PBS溶液洗3次×3分鐘，山羊抗大鼠二抗?jié)饪s液用PBS溶液進(jìn)行1/100和1/200梯度稀釋分別滴加。PBS溶液洗3次×3分鐘，滴加辣根酶底物，37℃，15分鐘。PBS溶液洗3次×3分鐘用雙蒸水1ml加入濃縮雙氧水2滴，DAB濃縮液2滴和DAB稀釋液2滴配成DAB工作液進(jìn)行DAB染色，室溫下10分鐘，鏡下觀察染色情況。PBS溶液洗3次×3分鐘，雙蒸水洗3分鐘，蘇木精復(fù)染，進(jìn)入蘇木精后2秒拿出，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠加入二甲苯進(jìn)行稀釋封片。

1.6圖像采集用OLMPUS圖像采集系統(tǒng)采集攝片[6]。

2.1水浴鍋煮沸法修復(fù)結(jié)果根據(jù)圖片顯示(圖A)，一抗?jié)舛葹?/80，二抗?jié)舛葹?/100切片中Brdu顯色效果較好，但背景色和Brdu顯色對比較差，濃度較高的切片中背景色較重，Brdu陽性結(jié)果對比較差，隨著一抗?jié)舛冉档停尘吧兊?，Brdu顯色液變淡。

2.2微波修復(fù)結(jié)果顯示(圖B)，一抗?jié)舛仍?/80，二抗?jié)舛葹?/100切片中Brdu顯色效果較好，但背景色較深，隨著一抗?jié)舛鹊慕档停尘吧兊?，同時Brdu顯色變淡。

2.3 Hcl修復(fù)結(jié)果顯示(圖C), 一抗?jié)舛仍?/80，二抗?jié)舛葹?/100切片中Brdu顯色效果好,背景色較淺，Brdu顯示明顯，隨一抗?jié)舛仍黾?，背景色變深，對比性減弱。隨一抗?jié)舛冉档捅尘吧儨\，Brdu顯色也隨之變淺，不能明確的顯示Brdu為陽性。

2.4PBS代替一抗結(jié)果顯示(圖D), 整張切片整體為陰性沒有出現(xiàn)棕黃色，細(xì)胞核內(nèi)無明顯棕黃色顆粒，細(xì)胞質(zhì)無著色。

2　結(jié)果

圖A　煮沸修復(fù)法DAB×400圖B　微波修復(fù)法DAB×400圖C　Hcl酸化孵育法DAB ×400圖D　PBS陰性DAB ×400

3　討論

Brdu是一種類似于核酸樣的物質(zhì)，在細(xì)胞受到損傷的時候能夠進(jìn)入細(xì)胞核并參與DNA修復(fù)，取代胸腺嘧啶嵌入DNA雙螺旋鏈其中一條鏈中，在細(xì)胞存活沒有紫外線照射狀態(tài)下Brdu能夠持續(xù)長期存在。因此Brdu作為一種跟蹤劑可以檢測細(xì)胞的活性和增值狀態(tài)。

免疫組織化學(xué)是目前最常用的蛋白檢測方法[6]。在對組織進(jìn)行石蠟包埋過程中，需要使用福爾馬林溶液固定組織，造成細(xì)胞內(nèi)的蛋白決定簇被醛基交聯(lián)封閉以至于不能直接與抗體結(jié)合，所以在進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測的時候需要對抗原進(jìn)行修復(fù)，打開被醛基交聯(lián)的蛋白集團(tuán)，暴露抗原。免疫組織化學(xué)常用的抗原修復(fù)有熱修復(fù)、微波修復(fù)和胰蛋白酶消化修復(fù)等。但Brdu是位于細(xì)胞核中的DNA鏈中，常規(guī)的抗原修復(fù)很難把Brdu抗原暴露，因此應(yīng)用常規(guī)免疫組織化學(xué)進(jìn)行抗原修復(fù)后組織表達(dá)Brdu效果不理想，甚至出現(xiàn)陰性結(jié)果。

給予上述原因，我們通過2M Hcl溶液對細(xì)胞膜和核膜進(jìn)行酸化破解，能夠很好的解決一抗進(jìn)入細(xì)胞核中的問題，因此Brdu的DAB染色也具有特異性。

在本實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵的步驟是Hcl的濃度和硼酸中和的時間和濃度，同時在進(jìn)行粘附片吸附組織切片時一定要展開，無褶皺組織和載玻片能充分的接觸，避免組織在修復(fù)過程中脫落或者卷起皺縮。

鹽酸酸化破膜法檢測Brdu，實(shí)驗(yàn)操作簡單，過程基本上與常規(guī)免疫組織化學(xué)SP法相似，無需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，操作簡單，用時少，并且染色結(jié)果明顯好于熱修復(fù)和微波修復(fù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Tsuji T, Itoh M kikuchi R, Repeated exposure to 5-bromo-2'-deoxyuridine causes decreased proliferation and low-grade inflammation in the lungs of mice[J]. Experimental and Toxicologic Pathology,2015,21(15): S0940-2993.

[2]Asano M, Yamamoto T, Tsuruta T,Dual labeling with 5-bromo-2'-deoxyuridine and 5-ethynyl-2'-deoxyuridine for estimation of cell migration rate in the small intestinal epithelium [J]. Dev Growth Differ, 2015;57(1):68-73.

[3]黃菊芳,劉晨,王慧，等. 一種改良的Brdu免疫組織化學(xué)染色抗原修復(fù)技術(shù)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,11(10):1972-1974.

[4]紀(jì)小龍.新編免疫組織化學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2005: 19.

[5]王伯沄.病理學(xué)技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2001: 368.

[6]潘琳.實(shí)驗(yàn)病理學(xué)技術(shù)圖譜[M]. 北京：科學(xué)出版社，2012:302-343.

*基金項(xiàng)目：國家自然基金(No.81373852)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.10.023

文章編號：1003-8914(2016)-10-1398-03

收稿日期：(本文校對：武鑫2015-08-19)

Application Hydrochloric Acid Repair Antigen of Brdu in Immunohistochemical Detection in Brain Tissue

WANG Tan1ZHENG Wanjun2GAO Jianfeng2

(1.Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences of Henan University of TCM, Henan, Zhengzhou 45000, China;2.Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences of Henan University of TCM, Henan Zhengzhou 45000, China)

Abstract：ObjectiveTo get the simple and effective method that antigen of Brdu repair in immunohistochemical staining, and improve success rate and result of the experiment. MethodsBased on the three kinds of experimental antigen repair methods as follows: Boil repair, Microwave repair and Hcl acid repair. Comparison image from Olympus image acquisition system, explore the most effective method of Brdu in immunohistochemistry detection by DAB staining. ResultBoil repair method: tissue antigen exposure was not complete, and the background was dark, display of Brdu positive results was not good. Microwave repair method: The organization exposure was not complete. Increasing heating time can broke tissue section, less heating time make background deep, Brdu was not good combination with first antibody, and the results were most negative. Hcl acid repair method: The background color of organization was shallow, Brdu staining contrasts with the background was remarkable, and can detect Brdu completely in the positions of the cells. ConclusionHcl acid for good critical nucleus DNA repair method of Brdu, antibodies into the nucleus, and easily color effect is obvious, and the operation is simple and easy, without heat source function at the same time. It has better security, and is an ideal method.

Key words：Brdu; IHC; Antigen retrieval