中山市部分地區(qū)金黃色葡萄球菌感染的臨床分布及耐藥基因研究

林顏玉　陳文偉　王柏旺　盧玉平

廣東省中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(中山 528421)

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中山市部分地區(qū)金黃色葡萄球菌感染的臨床分布及耐藥基因研究

林顏玉陳文偉王柏旺盧玉平

廣東省中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(中山 528421)

【摘要】目的了解中山市7家醫(yī)院金黃色葡萄球菌感染的臨床分布，并對耐藥基因進(jìn)行檢測，為臨床經(jīng)驗(yàn)治療金黃色葡萄球菌感染提供用藥及分子生物學(xué)依據(jù)。方法收集2015年1月—2015年6月中山市7家醫(yī)院分離到的金黃色葡萄球菌，使用ATB半自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀(法國梅里埃)對分離到的菌株進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)，使用PCR技術(shù)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的耐藥基因進(jìn)行檢測。結(jié)果7家醫(yī)院共分離到89株金黃色葡萄球菌，其中MRSA檢出33株，檢出率為37.1%。金黃色葡萄球菌主要來源于呼吸內(nèi)科(32株，36.0%)、骨科(20株，22.5%)，主要分離自痰(41株，46.1%)，傷口分泌物(16株，18%)，對萬古霉素、替考拉寧、奎奴普丁/達(dá)福普丁、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、諾氟沙星具有較高敏感性，MRSA對常用抗菌藥物耐藥率高于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌。共有32株MRSA檢出blamecA基因，檢出率為97%。結(jié)論MRSA耐藥情況較為嚴(yán)峻，臨床科室應(yīng)根據(jù)微生物培養(yǎng)報(bào)告合理使用抗菌藥物。blamecA基因在MRSA檢出較高，是MRSA主要的耐藥機(jī)制。

【關(guān)鍵字】耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗菌藥物耐藥性blamecA基因

金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然環(huán)境中，也可定植于正常人的皮膚黏膜及上呼吸道，是醫(yī)療機(jī)構(gòu)常見病原菌之一[1-2]。近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，侵入性操作、免疫抑制治療及抗菌藥物在臨床上的廣泛使用均導(dǎo)致金黃色葡萄球菌感染在院內(nèi)時(shí)有發(fā)生，尤其耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的出現(xiàn)，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)，已成為世界性難題[3-4]。MRSA預(yù)計(jì)在美國每年可導(dǎo)致大約80500例感染，是引起免疫低下患者死亡的重要原因[5]。同時(shí)MRSA感染不但增加了醫(yī)療支出及平均住院日，而且給患者造成極大的痛苦[6]。因此統(tǒng)計(jì)分析金黃色葡萄球菌尤其MRSA對常用抗菌藥物的耐藥率，對指導(dǎo)臨床在金黃色葡萄球菌感染早期經(jīng)驗(yàn)用藥有著十分重要的意義，同時(shí)本文通過檢測MRSA常見耐藥基因blamecA，為金黃色葡萄球菌院內(nèi)感染控制提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1菌株來源收集2015年1月—2015年6月中山市古鎮(zhèn)人民醫(yī)院、三鄉(xiāng)醫(yī)院、東鳳醫(yī)院、橫欄醫(yī)院、黃圃人民醫(yī)院、東升醫(yī)院、陳星海醫(yī)院共7家醫(yī)院從各類送檢標(biāo)本中分離到的金黃色葡萄球菌，剔除同一患者重復(fù)菌株。

1.2質(zhì)控菌株ATCC25922大腸埃希菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC29213金黃色葡萄球菌、ATCC29212糞腸球菌均由廣東省臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.3菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)使用ATB半自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀對分離到的菌株進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)，使用梅里埃ID 32 STAPH卡進(jìn)行金黃色葡萄球菌鑒定，使用ATB STAPH 5卡進(jìn)行最低抑菌濃度檢測。

1.4抗菌藥物及MRSA判定共檢測12種常用抗菌藥物敏感性，包括復(fù)方新諾明、紅霉素、四環(huán)素、萬古霉素、利福平、左氧氟沙星、青霉素、慶大霉素、克林霉素、替考拉寧、諾氟沙星、奎奴普丁/達(dá)福普丁。根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)文件2013版判定抗菌藥物敏感性。耐藥數(shù)據(jù)使用WHONET 5.6版進(jìn)行分析。金黃色葡萄球菌對苯唑西林最低抑菌濃度大于4 μg/mL即為MRSA。

1.5細(xì)菌基因組DNA提取將分離到的MRSA接種于血平板，35℃培養(yǎng)過夜，挑取2～3個(gè)菌落，使用購自上海生工生物工程有限公司快速柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，加入100 μl CE緩沖液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6引物設(shè)計(jì)登錄http://www.kegg.jp/查找blamecA基因序列，使用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，引物由上海生工生物工程有限公司合成。blamecA基因上游引物序列為：5′-AAAGCAATCGCTAAAGAACTAAG-3′，下游引物序列：5′-TCACCTGTTTGAGGGTGGA-3′，PCR擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物大小為518bp。

1.7PCR檢測blamecA基因 PCR反應(yīng)總體系為20 μl，其中PCR master mix(上海捷瑞)10 μl，上下游引物各0.6 μl，模板1.4 μl，雙蒸水7.4 μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min,然后94℃變性30 s, 58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。

1.8PCR產(chǎn)物檢測配制濃度為2%的瓊脂糖，加入5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，100 V電壓電泳35 min,最后使用紫外成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，觀察518 bp處是否出現(xiàn)預(yù)期條帶。

2結(jié)果

2.1標(biāo)本來源情況7家醫(yī)院共分離到金黃色葡萄球菌89株，分離MRSA 33株，MRSA檢出率為37.1%。89株金黃色葡萄球菌主要來源于痰(41株，46.1%)，傷口分泌物(16株，18%)，穿刺液(11株，12.4%)。MRSA主要分離自痰標(biāo)本(18株)，且MRSA檢出率較高。見表1。

表1　89株金黃色葡萄球菌標(biāo)本分布及MRSA檢出情況

2.2科室分布情況金黃色葡萄球菌主要分離自呼吸內(nèi)科(32株，36.0%)、骨科(20株，22.5%)、神經(jīng)外科(12株，13.5%)、重癥醫(yī)學(xué)科(8株，9.0%)。MRSA主要分離自呼吸內(nèi)科(13株)、骨科(6株)、神經(jīng)外科(5株)、重癥醫(yī)學(xué)科(4株)，重癥醫(yī)學(xué)科MRSA檢出率最高(50.0%)。見表2。

表2　89株金黃色葡萄球菌科室分布及MRSA檢出情況

2.3耐藥情況89株金黃色葡萄球菌對青霉素(89.9%)、紅霉素(51.7%)、四環(huán)素(44.9%)具有較高的耐藥率，對萬古霉素、替考拉寧、奎奴普丁/達(dá)福普丁、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、諾氟沙星敏感性較好。除青霉素外甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)對常用抗菌藥物敏感性均較好。MRSA對常用抗菌藥物敏感性均較差，除萬古霉素、替考拉寧、奎奴普丁/達(dá)福普丁外對其他9種抗菌藥物敏感性均低于MSSA。見表3。

2.4blamecA基因檢出情況 經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳并拍照，可在518 bp位置見一明顯條帶，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小相符。33株MRSA共有32株檢出blamecA基因。見圖1。

表3　89株金黃色葡萄球菌耐藥率及MSSA和MRSA耐藥率比較

注：MSSA 甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌

3討論

金黃色葡萄球菌是引起院內(nèi)感染最為重要的病原菌之一，2013—2014年CHINET耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示金黃色葡萄球菌是所有革蘭陽性球菌中分離率最高的病原菌[7- 8]。金黃色葡萄球菌可引起多種類型的感染，尤其是MRSA可以起皮膚軟組織感染、肺炎、心內(nèi)膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎，甚至引起嚴(yán)重威脅患者生命的血流感染及膿毒血癥[9]。

中山市7家醫(yī)院2015年1月—2015年6月共分離到89株金黃色葡萄球菌，其中MRSA 33株，檢出率為37.1%，檢出率低于國內(nèi)相關(guān)報(bào)道，但高于歐洲[8, 10]，低于國內(nèi)報(bào)道，可能與這7家醫(yī)院均為中山市基層醫(yī)院有關(guān)。金黃色葡萄球菌主要來源于痰、傷口分泌物、穿刺液、血等標(biāo)本，說明金黃色葡萄球菌主要引起呼吸系統(tǒng)感染、傷口皮膚軟組織感染、化膿性感染及血流感染，這與前述文獻(xiàn)報(bào)道一致。痰標(biāo)本MRSA檢出率較高，說明金黃色葡萄球菌引起的呼吸系統(tǒng)感染耐藥率高于其他部位的感染。金黃色葡萄球菌主要分離自呼吸內(nèi)科，其他科室可見于骨科、神經(jīng)外科、重癥醫(yī)學(xué)科等科室，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道相似[11]，再次說明金黃色葡萄球菌是引起肺部感染及傷口皮膚軟組織感染的重要病原菌。呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科及重癥醫(yī)學(xué)科MRSA檢出率較高，這可能是因?yàn)檫@3個(gè)科室患者多數(shù)病人接受了廣譜抗菌藥物治療，且神經(jīng)外科及重癥醫(yī)學(xué)科多以重癥患者為主，多數(shù)患者存在輔助通氣、氣管切開、外傷等，這些均可能是MRSA檢出率較高的原因。

圖1　33株MRSA blamecA基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

89株金黃色葡萄球菌對青霉素耐藥率最高，這可能與國內(nèi)多數(shù)金黃色葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶陽性有關(guān)。對奎奴普丁/達(dá)福普丁、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、諾氟沙星敏感性較好，未檢出萬古霉素及替考拉寧耐藥金黃色葡萄球菌。33株MRSA對常用抗菌藥物耐藥率較高，僅對奎奴普丁/達(dá)福普丁、復(fù)方新諾明、萬古霉素及替考拉寧敏感性較高。66株MSSA對青霉素以外的常用抗菌藥物敏感性均較好。MRSA對常用抗菌藥物耐藥率明顯高于MSSA，提示MRSA存在更為復(fù)雜的耐藥機(jī)制。33株MRSA經(jīng)檢測32株攜帶有blamecA基因，檢出率為97%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相似[12]。MRSA攜帶的blamecA基因可以編碼一種新的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a，PBP2a對β-內(nèi)酰類抗菌藥物親和力較低，從而使β-內(nèi)酰類抗菌藥失去對金黃色葡萄球菌的殺菌效果[13]。同時(shí)blamecA基因存在于金黃色葡萄球菌染色體盒(SCCmec)上，SCCmec是一個(gè)可移動(dòng)的基因元件，SCCmec除可攜帶blamecA基因基因外還可攜帶其他多種耐藥基因，從而導(dǎo)致多重耐藥[14]，這可能是MRSA對常用抗菌藥物耐藥率明顯高于MSSA的原因。

綜上，金黃色葡萄球菌主要引起肺部感染及傷口皮膚軟組織感染，治療金黃色葡萄球菌感染經(jīng)驗(yàn)用藥建議使用奎奴普丁/達(dá)福普丁、復(fù)方新諾明、左氧氟沙星、諾氟沙星，重癥感染患者建議使用萬古霉素或者替考拉寧。MRSA對常用抗菌藥物敏感性較差，耐藥性形式嚴(yán)峻，建議臨床應(yīng)根據(jù)微生物培養(yǎng)報(bào)告合理選擇抗菌藥物。

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基金項(xiàng)目：中山市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014AIFC058)

通信作者:E-mail:levyhan@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.003

(收稿日期：2015-11-18)

Clinical distribution and drug resistance gene of meticillin-resistant staphylococcus aureus infections in parts of Zhongshan city

LinYanyu,ChenWenwei,WangBowang,etal.

ZhongshanGuzhenPeople’sHospital,Zhongshan528421,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze clinical distribution of Staphylococcus aureus infections from 7 hospitals in Zhongshan city, as well as to provide basis of empirical treatment and molecular biology for Staphylococcus aureus infections.MethodsStaphylococcus aureus were collected from January 2015 to June 2015 in Zhongshan city, and then the strains were identified and tested antibiotic susceptibility by using ATB semiautomatic analyzer(Merieux). Resistance gene of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) was detected by polymerase chain reaction.Results89 strains of Staphylococcus aureus were isolated from 7 hospitals and with prevalence of 33 strains of MRSA. Of all strains, 32(36.0%) were isolated from respiratory medicine and 20(22.5%) from orthopedics. 41(46.1%) strains of Staphylococcus aureus were isolated from sputum and 16(18.0%) from wound secretion. 89 strains of Staphylococcus aureus had highly susceptibility to vancomycin, teicoplanin, quinupristin/dalfopristin, cotrimoxazole, levofloxacin, norfloxacin. Resistance rates to commonly used antimicrobial drugs of MRSA were significantly higher than methicillin-sensitive. A total of 32 MRSA were detected carrying blamecAgene with the detection rate of 97%.ConclusionClinical departments should be based on microbial culture report for rational use of antibiotics because of MRSA with more serious drug resistance. The gene of blamecAis the main mechanism of resistance for MRSA.

【Key words】Meticillin-resistant Staphylococcus aureus; Antibiotic; Drug resistance; blamecAgene