油茶炭疽病病原菌生物學特性研究

王義勛　劉偉　鄭露　陳京元　唐嵐

摘要：對引起油茶炭疽病的膠孢炭疽菌的生物學特性進行了研究.結果表明，該病菌在10～35℃的溫度范圍內均能生長以及分生孢子正常萌發(fā)，其中30℃最適宜菌絲生長和分生孢子萌發(fā)；在pH3.0～11.0范圍內菌絲均能生長和分生孢子均可萌發(fā)，pH6.0最利于菌絲生長，pH5.0～7.0最適宜分生孢子萌發(fā)。連續(xù)光照有利于菌絲的生長，光暗交替有利于分生孢子的萌發(fā)?？扇苄缘矸酆湍蛩乩诰z生長；乳糖和麥芽糖與谷氨酸的不利于菌絲生長。甘露醇和甘氨酸有利于產孢，半乳糖和硝酸鉀不利于產孢；菌絲和分生孢子的最低致死溫度為55℃，10min。

關鍵詞：油茶；膠孢炭疽菌；生物學特性

中圖分類號：S435.659 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2016）03-0040-05

油茶Camelliae oleifera是我國南方林區(qū)重要的木本油料樹種之一，適宜在荒山、丘陵區(qū)種植。其種子榨出的食用油（茶油）素有“東方橄欖油”美譽，不僅保障我國糧油安全，而且提升人民健康水平。此外，荒山、丘陵區(qū)種植油茶，不與糧棉爭地，能夠改善生態(tài)環(huán)境，具有重要生態(tài)價值。在我國各產區(qū)油茶炭疽病普遍發(fā)生，引起落果、落蕾、枝梢枯死等，甚至整株衰亡，造成重大經濟損失，可減產10%～30%，重病區(qū)40%～50%。近年來，隨著油茶種植面積不斷擴大，炭疽病危害程度越來越嚴重，已限制我國油茶產業(yè)健康發(fā)展。

該病的病原菌為膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，但是膠孢炭疽菌分布廣泛，寄主泛多，存在種問遺傳多樣性。杜宜新等研究發(fā)現，番木瓜炭疽病菌菌絲生長最適溫度為25～28℃，分生孢子萌發(fā)的最適溫度為28～30℃；最適pH為6，分生孢子萌發(fā)的最適pH為5；黑暗條件下生長速度最快；葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉能促進分生孢子的萌發(fā)和形成；該菌的致死溫度為55℃，10min.高洋等對墨蘭炭疽病菌生物學特性進行研究，結果表明菌絲生長和孢子萌發(fā)最適溫度為26℃，產生孢子最適溫度為30℃；菌絲生長最適pH為7～8，產生孢子最適pH為7～9，孢子萌發(fā)最適pH為7；26℃下連續(xù)光照產孢量最多。目前，關于油茶炭疽病菌的生物學特性未見詳細報道，需要深入了解病原菌特性，才能掌握該病害發(fā)病規(guī)律且制定科學防治技術措施。因此，本文對油茶炭疽病菌的生物學特性進行研究，以期為病害的科學防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

按照常規(guī)組織分離方法，供試菌株YX-1、MC-8和HA-7分離于采自陽新、麻城和紅安的油茶發(fā)病葉片，經單孢純化后保存在PDA斜面上，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 溫度對病原菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

從活化菌株YX-1、MC-8和HA-7菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊，將菌絲塊接種于PDA平板中央，每皿接種1個菌絲塊，然后分別置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃等不同溫度進行菌絲生長培養(yǎng)。5d后用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理設置5個重復。

從供試菌株YX-1、MC-8和HA-7菌落挑取分生孢子團，用無菌水稀釋成濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液。將200μL分生孢子液置于凹槽玻片，分別于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃等不同溫度進行孢子萌發(fā)試驗。每個處理設置5個重復。培養(yǎng)12h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)數，計算孢子萌發(fā)率（%）。

1.3 pH值對病原菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

用HCl和NaOH調節(jié)液體培養(yǎng)基的pH值。設置3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0、10.0，11.0等9個不同pH處理。打取直徑為6mm菌絲塊接種在不同pH值的PDB培養(yǎng)液中，置于25℃恒溫搖床（120rpm）條件下培養(yǎng)。每處理重復5次。培養(yǎng)5d后，收集菌絲、烘干并稱重。

設置3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0、10.0，11.0共9個梯度pH緩沖液。取200μL濃度為1×10⁶個/mL分生孢子液分別與5mL不同pH緩沖液充分混合，然后取200μL混合液放入凹槽玻片，置于25℃恒溫條件下培養(yǎng)。每個處理設置5個重復。培養(yǎng)12h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)數，計算孢子萌發(fā)率（%）。

1.4 光照對病原菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

用直徑6mm的打孔器在活化菌株YX-1、MC-8和HA-7菌落邊緣打取菌絲塊，將菌絲塊接種于PDA平板中央，每皿接種1個菌絲塊。將培養(yǎng)皿置于25℃人工氣候培養(yǎng)箱。設置連續(xù)黑暗、12h光暗交替、連續(xù)光照3個處理（光源為普通日光燈18w，22cm），每個處理設置5個重復。5d后用十字交叉法測量菌落直徑。

將200μL濃度為1×10⁶個/mL分生孢子液于凹槽玻片，設置連續(xù)黑暗、1h光暗交替、連續(xù)光照3個處理（光源為普通日光燈18W，22cm）。每個處理設置5個重復，25℃恒溫培養(yǎng)6h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)數，計算孢子萌發(fā)率（%）。

1.5 碳源對病原菌菌絲生長及產孢量的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎，分別以相同碳含量的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、可溶性淀粉代替蔗糖而配成含不同碳源的培養(yǎng)液。從預先活化菌落邊緣挑取直徑為6mm的菌絲塊接種到不同碳源的100mL培養(yǎng)液中，于25℃、120rpm震蕩培養(yǎng)。5d后，收集菌絲、烘干并稱重。用血球計數板測量孢子濃度。以不加任何碳源為對照，每處理5個重復。

1.6 氮源對病原菌菌絲生長及產孢量的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎，分別以相同氮元素含量的氯化銨、尿素、蛋白胨、氯化銨、谷氨酸、硝酸鉀、硝酸鈉、酵母膏代替硝酸鉀而配成含不同氮源的培養(yǎng)液。從預先活化菌落邊緣挑取直徑為6mm的菌絲塊接種到含不同氮源的100mL培養(yǎng)液中，于25℃、120rpm震蕩培養(yǎng)。5d后，收集菌絲、烘干并稱重。用血球計數板測量孢子濃度。以不加任何氮源為對照，每處理5個重復，

1.7 菌絲與孢子的致死溫度測定

將直徑6mm菌絲塊置于無菌離心管中，加入2mL無菌水，然后分別在40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃水浴處理10min，冷卻后將菌絲塊置于PDA平板中央，25℃恒溫光照培養(yǎng)。5d后觀察其生長情況。每處理重復5次，

分生孢子懸浮液的制備方法同上。取1mL孢子懸浮液于1.5mL離心管中，分別置于40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃水浴處理10min，冷卻，25℃恒溫光照培養(yǎng)12h后統(tǒng)計孢子萌發(fā)數。每個處理5次重復。

1.8 數據統(tǒng)計與分析

采用EXCEL進行作圖。采用DPS軟件（V3.01）進行數據統(tǒng)計分析，并用最小顯著差數法（LSD）比較各處理之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 溫度對病原菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

不同溫度對菌株YX-1、MC-8和HA-7菌絲生長具有顯著影響（圖1）。試驗結果表明，3個菌株在10～35℃的范圍內均能生長，其中25～30℃的溫度范圍生長較好；菌絲生長最適溫度為30℃。3個菌株在5℃和40℃時，菌絲均不生長。

不同溫度對菌株YX-1、MC-8和HA-7的孢子萌發(fā)率有明顯差異（圖2）。實驗結果表明，3個菌株的孢子萌發(fā)溫度范圍為10～35℃。在10～30℃范圍內，分生孢子隨著溫度的升高，萌發(fā)率逐漸增加，在30℃萌發(fā)率達到最高。在5℃和40℃條件下供試菌株的分生孢子均不萌發(fā)。

2.2 pH值對病原菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

不同pH對菌株YX-1、MC-8和HA-7菌絲生長的影響存在顯著差異（圖3）。試驗結果表明，菌株YX-1、MC-8和HA-7菌絲在pH為5.0～7.0范圍的范圍生長較好，其中pH6.0最為適宜。在pH為3.0～6.0范圍內，菌株YX-1、MC-8和HA-7的菌絲干重隨pH的升高而逐漸增加，在pH6.0時菌絲干重達到最高；在pH在6.0～11.0范圍內，菌絲干重隨著pH的升高而逐漸減少。

在不同pH條件下，菌株YX-1、MC-8和HA-7的孢子萌發(fā)率有顯著變化（圖4）。結果表明，在pH3.0～11.0范圍內孢子均可萌發(fā)，在pH為5.0～7.0范圍的范圍孢子均萌發(fā)率較高，其中pH6.0時孢子均萌發(fā)率最高，YX-1孢子萌發(fā)率為95.6%，MA-8孢子萌發(fā)率為94%，HA-7孢子萌發(fā)率為92%。

2.3 光照對病原菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的影響

供試菌株YX-1、MC-8和HA-7在連續(xù)光照、12h光暗交替、連續(xù)黑暗三種條件下培養(yǎng)5d后的菌落直徑（圖5），三種不同的光照處理之間存在一定差異性。結果表明，連續(xù)光照條件有利于菌絲生長；而連續(xù)黑暗培養(yǎng)條件不利于菌絲生長。

供試菌株YX-1、MC-8和HA-7的分生孢子在連續(xù)黑暗、光暗交替和連續(xù)光照三個條件下，30℃恒溫培養(yǎng)6h后均能萌發(fā)，但是萌發(fā)率卻存在顯著差異（圖6）。結果表明：光暗交替條件下3個菌株的分生孢子的萌發(fā)率最高，利于分生孢子萌發(fā)；連續(xù)黑暗條件下的分生孢子萌發(fā)率最低，不利于分生孢子。

2.4 碳源對病原菌菌絲生長及產孢量的影響

供試菌株YX-1、MC-8和HA-7在7種不同碳源的培養(yǎng)液中均能生長，但是菌絲干重卻存顯著差異（圖7）。結果表明：供試菌株對可溶性淀粉的利用效果最好；其次，依次為蔗糖、葡萄糖、甘露醇、半乳糖；而對麥芽糖和乳糖的利用效果較差。

供試菌株YX-1、MC-8和HA-7在7種不同碳源的培養(yǎng)液中均能產孢，但產孢量存在顯著差異（圖8）。結果表明，供試菌株在7種含有不同碳源的培養(yǎng)液中，甘露醇有利于病原菌產孢；而半乳糖不利于病原菌產孢。

2.5 氮源對病原菌菌絲生長及產孢量的影響

供試菌株YX-1、MC-8和HA-7在8種不同氮源的培養(yǎng)液中均能生長，但菌絲干重存在顯著差異（圖9）。結果表明，供試菌株在8種含有不同氮源的培養(yǎng)液中，且對尿素的利用效果最好；而對谷氨酸的利用效果最差。

供試菌株YX-1、MC-8和HA-7在8種不同氮源的培養(yǎng)液中均能產孢，但產孢量存在顯著差異（圖10）。結果表明，供試菌株在8種含有不同氮源的培養(yǎng)液中，甘氨酸有利于病原菌產孢；而硝酸鉀不利于病原菌產孢。

2.6 菌絲與孢子的致死溫度測定

結果表明，菌株YX-1、MC-8和HA-7的菌絲塊在40～50℃水浴處理10min在PDA平板培養(yǎng)基上仍可繼續(xù)生長，在55℃水浴處理10min后不能繼續(xù)生長，說明菌絲的致死溫度為55℃，10min。孢子在40～50℃水浴處理10min后分生孢子仍能萌發(fā)；在55℃水浴處理10min后分生孢子不能萌發(fā)，說明孢子的致死溫度為55℃，10min。

3 討論

在10～35℃的溫度范圍內，油茶炭疽病菌菌絲能夠生長以及分生孢子能夠萌發(fā)，其中30℃最適宜菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，而在5℃以下及40℃以上菌絲不能生長、分生孢子不能萌發(fā)。油茶炭疽病菌的溫度特性可能與病害流行（發(fā)病高峰期7～9月）密切相關。該菌對pH值要求不嚴格，在pH3.0～11.0范圍內菌絲能夠生長和分生孢子可萌發(fā)，pH6.0最利于菌絲生長，pH5.0～7.0最適宜分生孢子萌發(fā)。這說明偏酸性環(huán)境有利于菌絲生長和分生孢子萌發(fā)。連續(xù)光照有利于菌絲的生長，光暗交替有利于分生孢子的萌發(fā)。該病原菌菌絲和分生孢子的最低致死溫度均為55℃，10min?？扇苄缘矸酆湍蛩乩诰z生長；乳糖和麥芽糖與谷氨酸的不利于菌絲生長。甘露醇有利于病原菌分生孢子的產生，半乳糖不利于病原菌產孢；甘氨酸利于病原菌產孢，硝酸鉀不利于病原菌產孢。因此，合理施肥，尤其是尿素的合理使用，可以控制該病害發(fā)生。

（責任編輯：鄭京津）