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    香石竹RNAi載體的轉(zhuǎn)化體系對(duì)轉(zhuǎn)基因抗性芽分化的影響

    2016-08-10 02:19:36徐笑寒李枝林蔣亞蓮盧珍紅余蓉培周旭紅
    關(guān)鍵詞:基因工程正交試驗(yàn)

    徐笑寒,李枝林,蔣亞蓮,盧珍紅,余蓉培,周旭紅*

    (1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所,云南 昆明 650205;3.國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心,云南 昆明 650601)

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    香石竹RNAi載體的轉(zhuǎn)化體系對(duì)轉(zhuǎn)基因抗性芽分化的影響

    徐笑寒1,李枝林1,蔣亞蓮2,3,盧珍紅2,3,余蓉培2,3,周旭紅2,3*

    (1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所,云南 昆明 650205;3.國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心,云南 昆明 650601)

    摘要:將已構(gòu)建的與減數(shù)分裂相關(guān)的OSD1基因的RNAi載體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香石竹品種‘Nogalte’,通過(guò)正交試驗(yàn),篩選得出如下最佳轉(zhuǎn)化條件:預(yù)培養(yǎng)4 d、黑暗下共培養(yǎng)5 d、農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.5、共培養(yǎng)基中AS濃度30 mg/L、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間30 min。

    關(guān)鍵詞:基因工程;農(nóng)桿菌介導(dǎo);正交試驗(yàn);香石竹

    香石竹(Dianthuscaryophyllus),又名麝香石竹和康乃馨,為石竹科多年生草本植物,是世界四大切花之一,被譽(yù)為“母親節(jié)”之花,在花卉市場(chǎng)中占有重要的地位[1]。隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展,人們對(duì)花卉的需求量日益增大,對(duì)花卉的色、香、形等奇異的新品種的需求也日益強(qiáng)烈。在農(nóng)作物新品種育種中,轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有高效、快捷、目標(biāo)明確、性狀穩(wěn)定、育種年限短等特點(diǎn),相比于傳統(tǒng)的育種手段有著較大的優(yōu)勢(shì)。植物基因工程,又稱(chēng)植物遺傳工程(plant genetic engineering)、植物遺傳轉(zhuǎn)化(plant genetic transformation)等,是指利用DNA重組(DNA recombination)、細(xì)胞組織培養(yǎng)等技術(shù),將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織,進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因植株的技術(shù)方法[3]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法是目前最常用的工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法[2]。我們?cè)谘芯肯闶褶D(zhuǎn)基因體系的建立中,通過(guò)正交試驗(yàn)的方法提高了試驗(yàn)效率,得到了令人滿意的結(jié)論。

    已知的研究在單細(xì)胞真菌、非洲爪蟾和老鼠的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn), APC/C(后期促進(jìn)復(fù)合物)是關(guān)鍵的細(xì)胞周期修飾物,它同時(shí)作用于有絲分裂和減數(shù)分裂[4]。OSD1基因家族是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的,擬南芥OSD1(At3g57860)基因是有絲分裂APC/C的抑制劑[5],OSD1突變能導(dǎo)致2n配子的形成。2n配子在花卉多倍體育種中起重要作用[6]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),可沉默與2n配子形成相關(guān)的OSD1基因,培育高頻2n配子的種質(zhì),為香石竹多倍體育種打下基礎(chǔ)。

    本研究利用已構(gòu)建的香石竹OSD1基因RNAi載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)乙酰丁香酮濃度、預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)香石竹抗性芽分化的影響進(jìn)行了優(yōu)化,建立了最佳轉(zhuǎn)基因再生體系,為香石竹的遺傳育種打下了基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    選定影響轉(zhuǎn)基因抗性再生植株頻率的5個(gè)因素:預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、AS終濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間,選用L18(37)正交表,繪制了因素水平表(見(jiàn)表1)。

    表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L18(37)

    1.2試驗(yàn)材料和試驗(yàn)儀器

    試驗(yàn)材料:香石竹品種‘Nogalte’為云南省農(nóng)科院花卉研究所基地種植培養(yǎng)。試驗(yàn)儀器:超凈工作臺(tái)、搖床、紫外分光光度計(jì)、接種器、鑷子、手術(shù)刀等。試驗(yàn)試劑: AS(乙酰丁香酮)、TDZ(植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)、NAA(萘乙酸)、MS培養(yǎng)基、km(卡那霉素)、YEB培養(yǎng)基。

    1.3試驗(yàn)過(guò)程

    1.3.1預(yù)培養(yǎng)配制含0.22 mg/L TDZ和0.50 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基,作為香石竹‘Nogalte’外植體的預(yù)培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)中,切下香石竹莖尖部分約1 cm的兩小段(去掉莖尖生長(zhǎng)點(diǎn))作為外植體,將其放入配制好的預(yù)培養(yǎng)基中,分別標(biāo)記好處理號(hào),每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)中放置10個(gè)外植體。依據(jù)不同的試驗(yàn)組合,放入組培室(23 ℃)中分別光照培養(yǎng)2~4 d。

    1.3.2菌液配制將OSD1基因的RNAi干擾載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株,吸取1 μL的菌液至50 μL的YEB液體培養(yǎng)基中,并加入km(終濃度為50 mg/L),分別放入搖床(28 ℃)中,以200 r/min培養(yǎng)約12、24、40 h,經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)試,分別得到OD600=0.3、0.5、0.8這3種新鮮菌液。

    1.3.3侵染在超凈工作臺(tái)上將預(yù)培養(yǎng)結(jié)束的外植體取出,放入10 mL的離心管中,分別加入上述OD600為0.3、0.5、0.8的3種菌液, 在搖床(28 ℃、80 r/min)中侵染10~30 min。

    1.3.4共培養(yǎng)在上述預(yù)培養(yǎng)基中加入終濃度為10~30 mg/L的AS,作為共培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)中將侵染完成的外植體從離心管中取出,在吸水紙上先將多余的農(nóng)桿菌菌液吸干,再根據(jù)試驗(yàn)組合放入含不同濃度AS的共培養(yǎng)基中。標(biāo)記好處理號(hào),依據(jù)不同試驗(yàn)組合在培養(yǎng)箱(23 ℃)中暗培養(yǎng)3~5 d。

    1.3.5篩選培養(yǎng)配制含0.22 mg/L TDZ、0.50 mg/L NAA和50 mg/L km的MS培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)中,將共培養(yǎng)完成的香石竹外植體接入篩選培養(yǎng)基中,放入組培室(23 ℃)繼續(xù)培養(yǎng)。

    2結(jié)果與分析

    采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)香石竹外植體分化形成的愈傷組織數(shù)、愈傷組織的狀態(tài)、愈傷組織分化形成的植株數(shù)和分化植株的狀態(tài),結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。由圖1可見(jiàn):將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的外植體放入篩選培養(yǎng)基上(圖1a),2~5 d后,外植體開(kāi)始膨大(圖1b),形成黃色或黃綠色的疏松愈傷組織(圖1c~圖1d);培養(yǎng)20 d左右時(shí),黃綠色的愈傷組織開(kāi)始分化成植株(圖1e),有些分化植株為正常的綠色植株(圖1f),有些植株出現(xiàn)玻璃化和白化現(xiàn)象(圖1g),少數(shù)植株葉片邊緣出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖1h),大多數(shù)植株都呈現(xiàn)玻璃化狀態(tài)(圖1i)。

    由表2可見(jiàn),香石竹莖尖愈傷形成率很高,最高可達(dá)100%,最低為22.22%,分化植株的愈傷比例從12.50%至73.33%,每個(gè)愈傷分化的植株數(shù)為1.67~55.00棵。其中,12號(hào)處理分化植株的愈傷比例最高,13號(hào)處理每個(gè)愈傷分化的植株數(shù)最多;剛分化出來(lái)的愈傷大多數(shù)為黃綠色疏松的胚性愈傷,由愈傷分化的植株大多數(shù)呈玻璃化狀態(tài)。

    從表3中可以看出:預(yù)培養(yǎng)4 d的愈傷形成率和愈傷組織分化植株的比率最高;分化植株數(shù)以預(yù)培養(yǎng)2 d最高,預(yù)培養(yǎng)2、3和4 d間無(wú)顯著差異。綜合考慮,選擇預(yù)培養(yǎng)4 d為最佳預(yù)培養(yǎng)天數(shù)。

    當(dāng)AS終濃度為10 mg/L時(shí)愈傷形成率和分化植株數(shù)最高;當(dāng)AS終濃度為30 mg/L時(shí)愈傷組織分化植株的比率最高。從愈傷組織分化植株比率的角度來(lái)看,共培養(yǎng)基中AS濃度以30 mg/L為宜。

    當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí),愈傷形成率最高;當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí),愈傷組織分化植株的比率最高;當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為4 d時(shí),愈傷組織分化植株數(shù)最多。從愈傷組織分化植株比率的角度來(lái)看,共培養(yǎng)時(shí)間以5 d為宜。

    當(dāng)菌液濃度OD600=0.8時(shí),愈傷形成率最高;當(dāng)菌液濃度OD600=0.5時(shí),愈傷組織分化植株的比率和愈傷組織分化的植株數(shù)最高。綜合考慮,菌液濃度OD600=0.5為最佳農(nóng)桿菌侵染的濃度。

    當(dāng)侵染時(shí)間為30 min時(shí),愈傷形成率和愈傷組織分化植株的比率最高;當(dāng)侵染時(shí)間為10 min時(shí),愈傷組織分化的植株數(shù)最多。綜合考慮,菌液侵染時(shí)間30 min為最佳侵染時(shí)間。

    a:剛開(kāi)始篩選的外植體; b:外植體開(kāi)始膨大; c:黃色的疏松愈傷組織; d:黃綠色的疏松愈傷組織; e:黃綠色愈傷組織開(kāi)始分化形成植株; f:綠色正常的分化植株; g:白化和綠色玻璃化的分化植株; h:綠色玻璃化且邊緣褐化的分化植株; i:綠色玻璃化的分化植株。圖中標(biāo)尺長(zhǎng)度為1 cm。

    圖1 轉(zhuǎn)基因香石竹抗性芽的再生

    3討論

    3.1香石竹轉(zhuǎn)化條件的篩選

    預(yù)培養(yǎng)在提高植物的遺傳轉(zhuǎn)化率中發(fā)揮重要作用,預(yù)培養(yǎng)有利于促進(jìn)植物創(chuàng)傷口處的細(xì)胞分裂,分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易整合外源DNA,從而提高外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化率。在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACC氧化酶基因轉(zhuǎn)化香石竹幼葉的研究中,最佳轉(zhuǎn)化條件是預(yù)培養(yǎng)2 d[7]。Kanwar J K等的試驗(yàn)表明4 d是外植體分化愈傷組織的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間[8]。在本試驗(yàn)中,最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間也為4 d。

    表3 各試驗(yàn)因素對(duì)香石竹愈傷組織形成及分化的影響

    3討論

    3.1香石竹轉(zhuǎn)化條件的篩選

    預(yù)培養(yǎng)在提高植物的遺傳轉(zhuǎn)化率中發(fā)揮重要作用,預(yù)培養(yǎng)有利于促進(jìn)植物創(chuàng)傷口處的細(xì)胞分裂,分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易整合外源DNA,從而提高外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化率。在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACC氧化酶基因轉(zhuǎn)化香石竹幼葉的研究中,最佳轉(zhuǎn)化條件是預(yù)培養(yǎng)2 d[7]。Kanwar J K等的試驗(yàn)表明4 d是外植體分化愈傷組織的最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間[8]。在本試驗(yàn)中,最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間也為4 d。

    農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)是整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中非常重要的環(huán)節(jié),它決定著植物細(xì)胞與農(nóng)桿菌是否相互作用。農(nóng)桿菌附著、T-DNA的轉(zhuǎn)移及外源基因的整合都在共培養(yǎng)時(shí)期進(jìn)行。前人的研究表明適宜的共培養(yǎng)時(shí)間為3~4 d[8]。本試驗(yàn)的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

    共培養(yǎng)是Ti質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)T-DNA轉(zhuǎn)化的途徑,而乙酞丁香酮(AS)對(duì)Vir區(qū)基因的活化具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)測(cè)定,得出在添加30 mg/L AS的培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng),能獲得較高的抗性植株百分率。

    農(nóng)桿菌的侵染時(shí)間及菌液濃度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化起著非常重要的作用。若外植體在菌液中浸泡時(shí)間太短,則農(nóng)桿菌尚未接種到傷口面,在培養(yǎng)時(shí)無(wú)農(nóng)桿菌生長(zhǎng),不能轉(zhuǎn)化;如果外植體在菌液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng),則容易出現(xiàn)污染。故要選擇合適的農(nóng)桿菌的濃度及侵染時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)得出菌液濃度OD600=0.5、侵染時(shí)間30 min為最佳條件。

    3.2外植體材料的選擇

    香石竹再生體系多選用葉片為外植體[7,9-10]。而本實(shí)驗(yàn)以莖尖作為外植體也能獲得較高的再生率,而以葉片為外植體獲得再生植株的數(shù)量少(實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表)。這可能是因?yàn)轫斞恐饕煞稚M織構(gòu)成,而分生組織是由未分化狀態(tài)的細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞群體,所以頂芽具有分裂速度快的特點(diǎn),以莖尖作為外植體能夠直接通過(guò)器官發(fā)生途徑產(chǎn)生完整植株,避免經(jīng)過(guò)脫分化和再分化的復(fù)雜過(guò)程,這樣就避免了由于這些復(fù)雜過(guò)程而引發(fā)的突變以及不正常株形的產(chǎn)生。但是也存在著不利因素,由于將農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中,不能保證轉(zhuǎn)化全部細(xì)胞,所以所得到的轉(zhuǎn)基因植株有可能是完全轉(zhuǎn)化的植株,也有可能是部分被轉(zhuǎn)化的嵌合體植株,而嵌合體是不具有遺傳功能的,只能在后期再進(jìn)行篩選觀察。

    3.3再生植株玻璃化的防治

    香石竹再生植株絕大多數(shù)會(huì)出現(xiàn)玻璃化,可能是因?yàn)閺挠鷤T導(dǎo)植株時(shí)培養(yǎng)基中所含激素水平過(guò)高。因此可將再生植株接入激素水平較低的繁殖培養(yǎng)基中,經(jīng)過(guò)2~3輪的培養(yǎng),可將玻璃化苗培養(yǎng)成正常的綠色植株[11]。

    參考文獻(xiàn):

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    [2] 劉瑞江,張業(yè)旺,聞崇煒,等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析方法研究[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2010,27(9):52-55.

    [3] 傅榮昭,劉敏,梁紅健,等.通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得菊花轉(zhuǎn)基因植株[J].植物生理學(xué)報(bào),1998,24(1):72-76.

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    [7] 余義勛.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACC氧化酶基因轉(zhuǎn)化香石竹的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2004:48-51.

    [8] Kanwar J K, Kumar S. Recovery of transgenic plants byAgrobacterium-mediated genetic transformation inDianthuscaryophyllusL. (carnation)[J]. Pelagia Research Library, 2011, 2(2): 357-366.

    [9] 蘇曉瑜.香石竹再生體系的建立及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D].重慶:西南大學(xué),2007:33-36.

    [10] 劉彩霞.香石竹ACC氧化酶基因RNAi載體構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].北京:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院,2007:38-39.

    [11] 周旭紅,桂敏,莫錫君,等.一種香石竹組培快繁的方法:中國(guó),103461139A [P].2013-12-25.

    (責(zé)任編輯:黃榮華)

    收稿日期:2016-01-04

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460530、31260491);國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(2012FU125X10);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2014FA044);云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃(2015HB077)。

    作者簡(jiǎn)介:徐笑寒(1989─),男,浙江杭州人,碩士生,主要從事觀賞植物資源利用與創(chuàng)新研究。*通訊作者:周旭紅。

    中圖分類(lèi)號(hào):S681.5

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1001-8581(2016)07-0027-05

    Influence of RNAi Vector Transformation System on Differentiation of Transgenic Resistant Buds of Carnation

    XU Xiao-han1, LI Zhi-lin1, JIANG Ya-lian2,3, LU Zhen-hong2,3, YU Rong-pei2,3, ZHOU Xu-hong2,3*

    (1. College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Flower Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China; 3. National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture, Kunming 650601, China)

    Abstract:The RNAi vector of OSD1 gene which was connected with meiosis was constructed and integrated into carnation cultivar ‘Nogalte’ by Agrobacterium-mediated genetic transformation. Through orthogonal test, the optimal transformation conditions were screened out as follows: pre-culture for 4 days, co-cultivation in dark for 5 days, concentration (OD600) of Agrobacterium suspension solution being 0.5, concentration of AS (acetosyringone) in co-cultivation medium being 30 mg/L, and infection time of Agrobacterium being 30 min.

    Key words:Genetic engineering; Agrobacterium-mediated transformation; Orthogonal test; Carnation

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