GSNO對人鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響

湛　亞，王淑琪，何莎莎，王　穎，劉姬艷

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

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GSNO對人鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響

湛亞，王淑琪，何莎莎，王穎，劉姬艷

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

摘要：采取GSH和NaNO2(1∶1)在酸性避光條件下反應(yīng)的方法合成GSNO，用已構(gòu)建的人鼻咽癌細(xì)胞(CNE-2)為模型，研究GSNO對CNE-2細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果表明：NO能明顯抑制CNE-2細(xì)胞增殖，200 μmol/L GSNO作用CNE-2細(xì)胞，12 h抑制率為19.1%，24 h抑制率為30.4%.在一定濃度范圍內(nèi)，GSNO抑制CNE-2細(xì)胞的生長增殖效果與作用時(shí)間和濃度相關(guān).

關(guān)鍵詞：亞硝基谷胱甘肽；人鼻咽癌細(xì)胞株；MTT檢測法

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方常見的惡性腫瘤之一，為耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤，每年發(fā)病率高達(dá)25～30/10萬人[1].鼻咽癌的發(fā)病因素與多種致癌因素相關(guān)，如EB病毒感染、環(huán)境因素、遺傳因素、飲食習(xí)慣等[2].目前臨床使用的化學(xué)藥物雖然在腫瘤治療方面取得一定的療效，但遠(yuǎn)期效果不理想并存在有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)[3].

Hibbs發(fā)現(xiàn)由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮(NO)是殺傷腫瘤細(xì)胞的毒性效應(yīng)因子以來，已有大量資料證明，NO在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡中也起著重要作用[4-8].NO是一種小分子物質(zhì)，可溶于水，具有親脂性，可穿透生物膜.作為一種自由基性質(zhì)的氣體，NO可作用于細(xì)胞內(nèi)的靶分子而參與一系列生理和病理?xiàng)l件下的生物過程，調(diào)節(jié)免疫、神經(jīng)、循環(huán)等一系列生理活動，如宿主防御反應(yīng)、血管通透性、血管擴(kuò)張、神經(jīng)信號傳遞等[9-15].內(nèi)源性NO是一種極不穩(wěn)定的化合物，在實(shí)驗(yàn)條件下，其半衰期僅為3～5 s，對研究其功能帶來不便.亞硝基谷胱甘肽(nitrosoglutathione, GSNO)比NO穩(wěn)定，半衰期長，具脂溶性特征，可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞并釋放NO，進(jìn)而使NO發(fā)揮其生物學(xué)活性[16].本研究以NO供體GSNO作為工具藥，用已構(gòu)建的人鼻咽癌細(xì)胞(Human nasopharyngeal carcinoma cell, CNE-2)為模型，研究GSNO對CNE-2細(xì)胞增殖的影響.

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及儀器

CNE-2細(xì)胞株系(浙江醫(yī)院饋贈)，還原性谷胱甘肽(GSH)(上海晶純生化科技股份有限公司)，N-乙酰半胱氨酸(NAC)(上海晶純生化科技股份有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(凱基生物材料有限公司).

相差倒置顯微鏡(NikonT1-SM120)；752型紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Biorad)；熒光顯微鏡(LeicaZEISS HAL 100).

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2貼壁培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞貼壁生長到鋪滿培養(yǎng)容器底部90%以上，進(jìn)行細(xì)胞傳代.細(xì)胞傳代以PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，2～3 d傳代一次，細(xì)胞傳代7次內(nèi)取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3GSNO的合成與定量

GSNO不穩(wěn)定，一般采取現(xiàn)配現(xiàn)用的方式[17]，采用GSH和NaNO2在酸性避光條件下反應(yīng)合成.

合成：400 mmol/L GSH 0.4 mL，加入200 mmol/L HCL 0.2 mL，然后加入400 mmol/L NaNO20.2 mL，混合避光室溫反應(yīng)15 min，加入40%NaOH(約3～4 μL), 調(diào)整pH=7.2，避光保存于冰浴上.

定量：利用分光光度計(jì)定量.以蒸餾水調(diào)零，將合成的產(chǎn)物稀釋200倍后，測定在334 nm處的吸光度值.所得的吸光度值與摩爾吸光系數(shù)0.767相比，然后乘以稀釋倍數(shù)，即求得合成的GSNO的濃度.

1.4MTT法檢測GSNO對CNE-2細(xì)胞增殖的影響

收集對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含1.0×104個(gè)細(xì)胞.培養(yǎng)過夜后，分別用50、100、200、400、800 μmol/L GSNO處理12、24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃，5%CO2及飽和濕度的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入MTT裂解液 (10%SDS，5%異丁醇，0.012 mmol/L HCL)100 μL，37 ℃，5%CO2及飽和濕度的條件下放置過夜后，用Biorad酶標(biāo)儀在570 nm波長處測量各孔吸收值，調(diào)零孔則用RPMI-1640培養(yǎng)液代替細(xì)胞懸液和藥液.每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.細(xì)胞生長抑制率按下列公式計(jì)算：

進(jìn)行NO干預(yù)試劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)5 mmol/L(NAC用RPMI-1640溶液溶解稀釋)對GSNO作用的影響檢測時(shí)，傳代細(xì)胞貼壁生長到鋪滿培養(yǎng)容器底部80%左右，預(yù)先加入干擾試劑NAC，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下孵育30 min，再加入GSNO(200 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再用MTT法檢測對細(xì)胞增殖的影響.

1.5形態(tài)學(xué)觀察

將蓋玻片用75%乙醇浸泡后，PBS沖洗2遍，10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗一遍后，放置于6孔板中.收集對數(shù)生長期CNE-2細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔含4×105個(gè)細(xì)胞.培養(yǎng)過夜，待貼壁生長到鋪滿培養(yǎng)容器底部80%左右后，200 μmol/L GSNO 作用12 h，對照組加入同體積的RPMI-1640培養(yǎng)液.取出細(xì)胞爬片置于載玻片上，置倒置顯微鏡下觀察，照相并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

吸去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定，PBST(含0.1%Tween-20，0.5%Triton100的PBS)洗滌，再加入Hochest 33342室溫暗處理20 min，用PBST洗滌.封片再置于熒光顯微鏡下觀察.激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1MTT法檢測GSNO對CNE-2細(xì)胞增殖的影響

2.1.1不同濃度GSNO處理不同時(shí)間對CNE-2細(xì)胞增殖的影響

通過使用不同終濃度的GSNO作用于CNE-2細(xì)胞，分別處理12、24 h后，結(jié)果表明，GSNO可明顯抑制CNE-2細(xì)胞的生長增殖，其效果與作用時(shí)間和濃度相關(guān)(圖1).同一作用時(shí)間內(nèi)，GSNO處理24 h，對細(xì)胞生長的抑制率隨GSNO劑量的增加而上升(P<0.05)；200 μmol/L GSNO作用CNE-2細(xì)胞，12 h抑制率為19.1%，24 h抑制率為30.4%，呈時(shí)間梯度變化.

2.1.2NO清除劑對GSNO處理的CNE-2細(xì)胞增殖的影響

通過將CNE-2細(xì)胞分別用GSNO(200 μmol/L)，N-乙酰半胱氨酸(NO清除劑，5 mmol/L)及N-乙酰半胱氨酸5 mmol/L+GSNO 200 μmol/L 聯(lián)合處理24 h，檢測對CNE-2細(xì)胞增殖的影響.結(jié)果如圖2所示：單獨(dú)的N-乙酰半胱氨酸組對CNE-2細(xì)胞的生長抑制率明顯低于GSNO組(P<0.05)，與對照組相比沒有明顯的區(qū)別(P>0.05).N-乙酰半胱氨酸+GSNO組對CNE-2細(xì)胞的生長抑制率低于GSNO組(P<0.05)，表明NAC預(yù)處理減弱了GSNO對CNE-2細(xì)胞的生長抑制效應(yīng).

圖1　GSNO對CNE-2細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 1　Inhibitory effect of GSNO on the proliferation of CNE-2 cells

圖2　NO清除劑對GNSO處理的CNE-2細(xì)胞生長增殖的影響Fig. 2　Effect of NO scavenger on the proliferation of CNE-2 cells treated with GNSO

2.2GSNO作用于CNE-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1倒置顯微鏡觀察

在倒置顯微鏡下，對照組CNE-2細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形，細(xì)胞生長密集，相鄰細(xì)胞緊密連接成片；200 μmol/L GSNO作用12 h后的CNE-2細(xì)胞，各細(xì)胞間接觸性下降，細(xì)胞分布變得稀疏，細(xì)胞形態(tài)開始由多邊形變?yōu)閳A形，部分細(xì)胞外圍出現(xiàn)一層小泡，細(xì)胞核初步聚集，細(xì)胞胞漿逐漸濃縮(圖3).

圖3　倒置顯微鏡觀察GSNO處理的CNE-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變Fig. 3　Morphological changes of CNE-2 cells treated by GSNO were observed by electron microscope

2.2.2熒光顯微鏡觀察

Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜，嵌入細(xì)胞核雙鏈DNA的細(xì)胞核藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低.結(jié)果(圖4)顯示:對照組CNE-2細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色；200 μmol/L GSNO作用12 h后的CNE-2細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生固縮，細(xì)胞核致密開始出現(xiàn)濃縮，細(xì)胞核顏色開始由藍(lán)色變?yōu)榱了{(lán)色.

圖4　熒光顯微鏡觀察GSNO處理的CNE-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變Fig. 4　Fluorescence microscopy was used to observe the morphological changes of CNE-2 cells treated with GSNO

3討論

目前臨床采用化學(xué)藥物治療鼻咽癌雖取得了一定的進(jìn)展，但在提高遠(yuǎn)期治療效果、降低毒副反應(yīng)和提高鼻咽癌患者生存質(zhì)量方面還需做很大努力，因此需要尋找更為精確有效的鼻咽癌治療藥物及治療靶點(diǎn)[18].

已有資料表明，NO可抑制包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞生長增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.張新宇等[19]通過將不同濃度的NO供體硝普鈉(Sodium Nitroprusside，SNP)作用于體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞株(HOS)，結(jié)果表明200 μmol/L SNP對HOS細(xì)胞生長有明顯抑制作用.蔣雪梅等[20]通過對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2的研究，發(fā)現(xiàn)NO可抑制人肝癌細(xì)胞生長增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及死亡.余紅民等[21]研究發(fā)現(xiàn)GSNO能促使人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制可能與巰基亞硝基化修飾作用有關(guān).

蛋白質(zhì)巰基亞硝基化修飾是指NO對蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基共價(jià)修飾，將蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基(-SH)轉(zhuǎn)化為巰亞硝基(-SNO)的過程，是一種依賴NO的巰基氧化修飾，包括NO對蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基的直接亞硝基化和利用中間產(chǎn)物進(jìn)行的轉(zhuǎn)亞硝基化兩種方式.在細(xì)胞中，轉(zhuǎn)亞硝基化的方式更為普遍[22].GSNO作為一種低分子量的巰基亞硝基化合物，它比NO穩(wěn)定也更加方便NO發(fā)揮其生物活性.在轉(zhuǎn)亞硝基化途徑中，GSNO可作為其中間產(chǎn)物將NO反式轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基(Cys-SH)上，發(fā)生轉(zhuǎn)亞硝基化作用，接著參與后續(xù)調(diào)控.研究表明，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化產(chǎn)物在多種疾病中表現(xiàn)出升高或降低異常，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化調(diào)控有可能成為腫瘤治療的一個(gè)新途徑[23].

本研究將不同濃度的GSNO作用于人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，結(jié)果表明：NO能明顯抑制CNE-2細(xì)胞增殖，200 μmol/L GSNO作用CNE-2細(xì)胞，12 h抑制率為19.1%，24 h抑制率為30.4%，呈時(shí)間梯度變化.在一定濃度范圍內(nèi)，GSNO抑制CNE-2細(xì)胞的生長增殖效果與作用時(shí)間和濃度相關(guān).CNE-2細(xì)胞經(jīng)200 μmol/L GSNO作用12 h后，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，細(xì)胞開始變圓，細(xì)胞分布變得松散，部分細(xì)胞周邊出現(xiàn)一層小泡.經(jīng)Hoechst 33342染色后，細(xì)胞核致密開始出現(xiàn)濃縮.

綜上所述，本文研究結(jié)果表明GSNO能明顯抑制人鼻咽癌細(xì)胞的增殖，在一定濃度范圍內(nèi)，作用效果與時(shí)間和濃度相關(guān).這一研究結(jié)果為臨床治療鼻咽癌提供了一個(gè)新的思路，而NO相關(guān)的作用機(jī)理還需進(jìn)一步的研究.

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收稿日期：2016-03-03

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ13H310005)；杭州師范大學(xué)本科生創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目(CX2014085).

通信作者：劉姬艷(1979—)，女，副教授，博士，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究.E-mail: liujiyan_grace@163.com

doi:10.3969/j.issn.1674-232X.2016.04.008

中圖分類號:R282.71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1674-232X(2016)04-0377-05

Effects of GSNO on the Proliferation of Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line

ZHAN Ya, WANG Shuqi, HE Shasha, WANG Ying, LIU Jiyan

(College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Abstract:GSNO was synthesized by the reaction of GSH and NaNO2 under the condition of acid shelter, the effects of GSNO on the proliferation of CNE-2 cells were studied with the constructed human nasopharyngeal carcinoma cell line as a model. The results showed that NO could obviously inhibit the proliferation of CNE-2 cells, 200 μmol/L GSNO CNE-2 cells, 12 h inhibition rate was 19.1 %, 24 h inhibition rate was 30.4 %. In a certain concentration range, the inhibition of GSNO on the growth of CNE-2 cell proliferation effect related to the reaction time and concentration.

Key words:GSNO； Human nasopharyngeal carcinoma cell line； MTT detection method