蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化活性研究

侯文成，韓丹丹，陳曼麗，駱焱平

（海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228）

?

蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化活性研究

侯文成，韓丹丹，陳曼麗，駱焱平*

（海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228）

以蜈蚣草為試材，甲醇為溶劑，采用滲漉法浸提蜈蚣草，結(jié)合GC-MS對蜈蚣草甲醇提取物成分進(jìn)行檢測，并對蜈蚣草提取物的抗氧化性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：蜈蚣草甲醇提取物中酯類成分最多，占54.22%；其次為醇類物質(zhì)，占24.03%；酮類、酸類和吲哚類物質(zhì)含量較少，依次為10.44%、6.73%和1.34%；總黃酮含量為4.81%；蜈蚣草提取物對DPPH自由基的清除率最強(qiáng)，半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）為0.15 mg/mL，脂質(zhì)過氧化抑制作用、超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫清除作用的EC50分別為6.55、0.09、4.11、0.45 mg/mL。

蜈蚣草；甲醇提取物；總黃酮；抗氧化活性

投稿網(wǎng)址：http：//xb.ijournal.cn

蜈蚣草（Pteris vittata L.）是鳳尾蕨科（Pteridaceae）的多年生草本植物，別名舒筋草、蜈蚣蕨、長葉甘草蕨、牛肋巴［1］，生長在山坡、路邊的鈣質(zhì)土或石灰?guī)r壁縫中，可作為鈣質(zhì)土和石灰?guī)r的指示植物［2］，廣泛分布于長江以南的廣大地區(qū)［3］。

蜈蚣草可入藥，有祛風(fēng)除濕、殺蟲、治疳瘡、止血、止瀉等功效［4］。周向軍等［5］通過加熱回流法提取蜈蚣草黃酮類化合物，分析了它對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性；孫俊等［6］利用纖維素酶-微波聯(lián)合提取蜈蚣草黃酮，并測試其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)該提取物有良好的抗氧化活性；丁利君等［7］利用微波輔助提取蜈蚣草總黃酮，研究其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)蜈蚣草總黃酮含量高，抗氧化活性好。筆者采用滲漉法［8］提取蜈蚣草粗提物，利用GC-MS技術(shù)分析了粗提物的化學(xué)成分，并測試了蜈蚣草甲醇提取物的還原能力、脂質(zhì)過氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、超氧陰離子清除作用、羥基自由基和過氧化氫清除作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

蜈蚣草（Pteris vittata L.），采自海南大學(xué)儋州校區(qū)附近的溝渠邊，經(jīng)本校植物學(xué)專家鑒定確認(rèn)。

蘆?。–27H30O16）、水溶性維生素E（Trolox）、亞油酸（C18H32O2）、吐溫-20（C58H114O26）、硫氰酸銨（NH4SCN）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、N-甲基吩嗪甲基硫酸鹽（PMS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、D-2-脫氧核糖（C4H9O3CHO）、過氧化氫酶（CAT）、硫代巴比妥酸（TBA）、辣根過氧化物酶（HRP）等均為市售，分析純或化學(xué)純。

1.2方法

1.2.1蜈蚣草甲醇提取物的制備

蜈蚣草全株30 g，洗凈，室溫晾干，粉碎，過0.380 mm孔徑的篩，置于500 mL玻璃瓶中，加入工業(yè)甲醇，使甲醇剛好沒過蜈蚣草粉末。采用滲漉法提取3次，每次3 d。過濾，合并濾液，40 ℃減壓濃縮，真空干燥至恒重，得蜈蚣草提取物，備用。

1.2.2蜈蚣草甲醇提取物的GC-MS分析

用安捷倫7890B-7000B GC-MS技術(shù)對蜈蚣草甲醇提取物進(jìn)行成分分析。氣相色譜條件：安捷倫HP-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱，程序升溫為60 ℃保留2 min，6 /min℃升至300 ℃，保留10 min；載氣為高純He；進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃。質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓70 eV；離子源溫度250 ℃；掃描質(zhì)量數(shù)范圍20～450 （m/z）；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.2.3蜈蚣草甲醇提取物總黃酮含量的測定

稱量蘆丁10 mg，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解，定容得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，不足8mL的用50%甲醇補(bǔ)足；加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液10 mL，最后加50%甲醇定容，搖勻，放置10 min。以50%甲醇代替樣品作為空白對照，在500 nm 波長處測定吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總黃酮含量測定：稱取樣品3.2 mg，溶于5 mL 50%甲醇中，得到供試樣品溶液；取供試樣品溶液2.5 mL，置于25 mL容量瓶中，隨后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法進(jìn)行配制，測定其吸光度［9］，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試樣品溶液中相對蘆丁的量，再計算得總黃酮的含量。

1.2.4蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化試驗

還原作用、脂質(zhì)過氧化抑制作用、DPPH清除作用、超氧陰離子（O2-·）清除作用、羥基自由基（·OH）清除作用、過氧化氫（H2O2）清除作用按照文獻(xiàn)［10-13］的方法測定。

1.3定性和定量分析

用質(zhì)量頻譜值與NIST98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對，鑒定出蜈蚣草甲醇提取物中的化學(xué)成分；按峰面積歸一化法計算各化合物在提取物中的相對百分含量。

2　結(jié)果與分析

2.1蜈蚣草甲醇提取物的GC–MS分析結(jié)果

用GC-MS技術(shù)對蜈蚣草甲醇提取物進(jìn)行成分分析，得到總離子流圖（圖1）。對圖1中各峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描，結(jié)果見表1。根據(jù)NIST98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫鑒定出24個化合物，其中，葉綠醇、油酸乙酯、棕櫚酸甲酯的含量均較高，分別為17.78%、16.84% 和15.95%；其他組分的含量較低。這些組分中，酯類最多，占總量的54.22%；其后依次為醇類、黃酮類、酸類和吲哚類，分別占總量的24.03%、10.44%、6.73%和1.34%。

圖1　蜈蚣草甲醇提取物的總離子流圖Fig. 1 Total ion flow chart of methanol extract of Pteris vittata

表1　蜈蚣草甲醇提取物的化學(xué)成分分析Table 1 Chemical composition analysis of methanol extract of Pteris vittata

2.2蜈蚣草甲醇提取物中的總黃酮含量

采用紫外-可見分光光度法對蜈蚣草甲醇提取物中的總黃酮含量進(jìn)行測定，以蘆丁為陽性對照，硝酸鋁為顯色劑，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

y = 0.063 1x - 0.016，R2= 0.928 9。由方程計算得到蜈蚣草甲醇提取物中的總黃酮含量為4.81%。

2.3蜈蚣草甲醇提取物的還原能力

由試驗結(jié)果可知，在一定濃度范圍內(nèi)，蜈蚣草甲醇提取物和Trolox陽性對照的還原能力與蜈蚣草提取物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，濃度越高，還原力越強(qiáng)。在測試濃度范圍內(nèi)，Trolox的還原能力均高于蜈蚣草提取物。蜈蚣草提取物還原能力的回歸方程y= 1.514 5x + 6.326 3（R2= 0.970 7）；Trolox還原能力的回歸方程y = 1.689 9x + 6.796 9（R2=0.955 3）。由方程計算可得蜈蚣草提取物與Trolox總還原力的EC50值分別為0.31、0.35 mg/mL。

2.4蜈蚣草甲醇提取物的脂質(zhì)過氧化抑制率

蜈蚣草甲醇提取物的脂質(zhì)過氧化抑制作用與濃度表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，濃度越高，脂質(zhì)過氧化的抑制率越強(qiáng)，則抗氧化能力越強(qiáng)。在測試濃度范圍內(nèi)，蜈蚣草甲醇提取物的脂質(zhì)過氧化抑制率平穩(wěn)增加；當(dāng)蜈蚣草提取物的質(zhì)量濃度為 1.28 mg/mL時，Trolox對脂質(zhì)過氧化的抑制率（34.7%）高于蜈蚣草提取物的抑制率。蜈蚣草提取物對脂質(zhì)過氧化抑制率的回歸方程y =0.783 7x+4.360 4 （R2=0.852 5）；Trolox脂質(zhì)過氧化抑制率的回歸方程 y =0.524 3x+4.458 1 （R2=0.966 8）。計算得蜈蚣草甲醇提取物和Trolox對脂質(zhì)過氧化的EC50值分別為6.55、10.80 mg/mL。

2.5蜈蚣草甲醇提取物對DPPH自由基的清除率在測試濃度范圍內(nèi)，除0.63 mg/mL時，蜈蚣草提取物對DPPH自由基清除率高于Trolox對照的清除率；當(dāng)蜈蚣草提取物質(zhì)量濃度為 5.00 mg/mL時，蜈蚣草甲醇提取物的清除率最高，達(dá)到87.4%。蜈蚣草提取物對 DPPH自由基清除率的回歸方程y=0.551 9x+5.461 3，Trolox對DPPH自由基清除率的回歸方程y=0.794 2x+5.087 8。由回歸方程計算出蜈蚣草甲醇提取物和 Trolox 對 DPPH自由基的EC50分別為0.15、0.78 mg/mL。

2.6蜈蚣草甲醇提取物對超氧陰離子的清除率

試驗結(jié)果表明，蜈蚣草提取物質(zhì)量濃度為2.56 mg/mL時，蜈蚣草甲醇提取物對超氧陰離子的清除率達(dá)到70.40%，對照Trolox的清除率為66.30%。蜈蚣草提取物對超氧陰離子的清除率的回歸方程y =0.416x+5.462 7（R2=0.965 3）；Trolox對超氧陰離子的清除率的回歸方程y=0.411x+5.234 1（R2=0.991 7）。計算得出蜈蚣草提取物對超氧陰離子的EC50分別為0.09、0.58 mg/mL。

2.7蜈蚣草甲醇提取物對羥基自由基的清除率

試驗結(jié)果表明，在測試濃度范圍內(nèi)，蜈蚣草提取物對羥基自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加，對羥基自由基的清除率增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL和0.32 mg/mL時，蜈蚣草提取物對羥基自由基的清除率低于對照Trolox；其他濃度時，均高于對照。由計算可得蜈蚣草甲醇提取物對羥基自由基的EC50為4.11 mg/mL，Trolox對羥基自由基的EC50為3.69 mg/mL。

2.8蜈蚣草甲醇提取物對過氧化氫的清除率

在測試的濃度范圍內(nèi)，樣品和對照對過氧化氫的清除作用隨濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng)測試質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時，蜈蚣草甲醇提取物對過氧化氫的清除率達(dá)到62.0%，高于對照Trolox的清除率（56.0%）。蜈蚣草提取物對過氧化氫清除率的回歸方程y =0.763 9x+5.261 7（R2=0.971 3）；Trolox對過氧化氫清除率的回歸方程y=0.976 7x+5.121 7（R2=0.951 5）。計算得出蜈蚣草甲醇提取物和Trolox對過氧化氫的EC50分別為0.45、0.75 mg/mL。

3　結(jié)論與討論

本試驗采用甲醇滲漉法浸提蜈蚣草，并結(jié)合GC-MS對蜈蚣草提取物進(jìn)行成分分析，鑒定出24種化合物，包含酯類、醇類、黃酮類、酸類和吲哚類物質(zhì)，其中以酯類為主，占54.22%，提取物中總黃酮含量4.81%。以水溶性維生素E（Trolox）作陽性對照，研究蜈蚣草甲醇提取物的抗氧化活性，結(jié)果表明，蜈蚣草甲醇提取物具有較好的抗氧化作用，在測試濃度范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)，蜈蚣草提取物的還原作用、脂質(zhì)過氧化抑制作用、對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基和過氧化氫的EC50分別為0.31、6.55、0.15、0.09、4.11、0.45 mg/mL。

［1］ 尹懷約．蜈蚣草的組織培養(yǎng)［J］．四川師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），1991，12（1）：20-22．

［2］ 中國科學(xué)植物研究所．中國境內(nèi)酸性土鈣質(zhì)土和鹽堿土的指示植物［M］．北京：中國科學(xué)院出版社，1954．

［3］ 陳同斌，張斌才，黃澤春，等．超富集植物蜈蚣草在中國的地理分布及其生境特征［J］．地理研究，2005，24（6）：825-833．

［4］ 石曉云．蜈蚣草資源的利用［J］．特種經(jīng)濟(jì)動植物，2010，13（2）：28．

［5］ 周向軍，高義霞，楊宗琪，等．蜈蚣草總黃酮體外抗氧化作用的研究［J］．資源開發(fā)與市場，2010，26（4）：294-296．

［6］ 孫俊，丁利君，李梅艷．纖維素酶-微波聯(lián)合提取蜈蚣草黃酮及其抗氧化研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2011，22（4）：854-856．

［7］ 丁利君，蘇桂良．微波輔助提取蜈蚣草黃酮及其抗氧化［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報，2009，28（5）：623-626．

［8］ 袁瑜，張良，李玉鋒，等．滲漉法提取白芷總香豆素的工藝研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2008，19（2）：302-303．

［9］ 劉碩，蔣道松，李孌．斑地錦與地錦總黃酮含量及抗氧化活性比較［J］．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，33（3）：287-288．

［10］ 王靜，劉大川．紫（白）蘇葉黃酮類化合物抗氧化性能的研究［J］．中國油脂，2004，29（3）：33-36．

［11］ 郭長江，楊繼軍，韋京豫，等．兩種方法測定堅果類食物抗氧化活性的比較［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2004，16（2）：135-136．

［12］ 鄭義，邵穎，陳安徽，等．益智仁總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性［J］．食品科學(xué)，2014，35（6）：44-60．

［13］ Zhu C H，Lei Z L，Luo Y P．Studies on antioxidative activities of methanol extract from Murraya paniculata［J］. Food Science and Human Wellness，2015，4（3）：108-114．

責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁 和

Antioxidant activities of methanol extract of Pteris vittata

Hou Wencheng， Han Dandan， Chen Manli， Luo Yanping*
（College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou 570228， China）

Pteris vittata was extracted with percolation method by methanol， composition of the extract was identified by GC-MS， antioxidant activities of the methanol extract were evaluated by six common tests and Trolox was used as positive control. The results showed that： the highest content of methanol extract was esters， account for 54.22%， alcohol was the second， account for 24.03%， and ketones， acids and indoles matter were 10.44%， 6.73% and 1.34% respectively. The flavonoids content of extract was 4.81%. DPPH scavenging activity was stronger at the six tests compare with Trolox，and the EC50value was 0.15 mg/mL， the EC50of lipid oxidation inhibition， superoxide， hydroxyl radicals and hydrogen peroxide scavenging activity were 6.55， 0.09， 4.11， 0.45 mg/mL respectively.

Pteris vittata； methanol extract； flavonoids； antioxidant activity

侯文成（1991—），男，陜西旬邑縣人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究，86473999@qq.com； *通信作者，駱焱平，教授，主要從事天然產(chǎn)物研究，Yanpluo@126.com

TS201.4

A

1007-1032（2016）04-0441-04

2016-03-22 修回日期：2016-06-13

2014年度海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項（ZDXM2014115）