柑橘砧木枳橙和香橙B O R 2基因的克隆與缺硼脅迫下的表達分析

顏廷帥，羅 慶，潘志勇，劉永忠，彭抒昂（.華中農(nóng)業(yè)大學 園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.金正大生態(tài)工程集團股份有限公司 國家緩控釋肥工程技術研究中心，山東 臨沭 276700）

柑橘砧木枳橙和香橙B O R 2基因的克隆與缺硼脅迫下的表達分析

顏廷帥1，2，羅 慶1，潘志勇1，劉永忠1，彭抒昂1
（1.華中農(nóng)業(yè)大學 園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.金正大生態(tài)工程集團股份有限公司 國家緩控釋肥工程技術研究中心，山東 臨沭 276700）

以耐缺硼脅迫的枳橙（（Citrus sinens（L.）Osb.×Poncirus trifoliata（L.）Raf.）和不耐缺硼脅迫的香橙（Citrus junos Sieb.ex Tanaka）為材料，克隆了擬南芥硼運輸基因AtBOR2的同源基因枳橙CPBOR2和香橙CjBOR2，進行相關生物信息學分析和缺硼脅迫下的表達分析。結果表明，CPBOR2和CjBOR2的ORF長度分別為2133bp和2073bp，CpBOR2和CjBOR2蛋白都具有7個跨膜區(qū)域，且具有細胞膜極性定位和內吞降解的保守氨基酸位點；缺硼脅迫下，CjBOR2表達量與對照相比無顯著變化，在前期降低，后期升高。

枳橙；香橙；BOR2；缺硼；克?。籷PCR

文獻著錄格式：顏廷帥，羅慶，潘志勇，等.柑橘砧木枳橙和香橙B O R 2基因的克隆與缺硼脅迫下的表達分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（1）：65-68.

我國柑橘主產(chǎn)區(qū)主要位于南方多雨的山地丘陵地區(qū)，土壤多為酸性的紅黃壤，土壤狀況較差，同時南方濕潤多雨，硼酸極易因淋溶作用而流失，因此土壤缺硼的現(xiàn)象較普遍［1-2］。土壤缺硼易造成柑橘老葉葉脈木栓化，樹勢早衰，果實產(chǎn)量和品質下降，使產(chǎn)區(qū)農(nóng)民遭受嚴重的經(jīng)濟損失［3］。

柑橘樹體主要通過砧木根系吸收和轉運硼，不同的砧木可以影響樹體的營養(yǎng)狀況［4］。目前柑橘砧木吸收和運輸硼的機制還不清楚，最近在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)AtBOR2在缺硼脅迫下硼的轉運過程中有重要作用：AtBOR2定位于根部，轉運共質體的硼到質外體，促進細胞壁硼糖復合物的形成，從而保證根部延長區(qū)細胞的正常伸長和硼向地上部的轉運，缺硼脅迫下AtBOR2表達量上升［5］。而柑橘砧木中AtBOR2的同源基因在缺硼脅迫下的作用目前還不清楚，為了確定缺硼脅迫下不同柑橘砧木中AtBOR2的同源基因表達量的變化，本試驗所用材料為耐缺硼脅迫的柑橘砧木枳橙和不耐缺硼脅迫的柑橘砧木香橙［6］，克隆枳橙 CPBOR2和香橙CjBOR2，并在缺硼脅迫下對水培條件下的枳橙和香橙進行缺硼脅迫處理，通過 qPCR技術，測定CPBOR2和CjBOR2表達量的變化，為進一步確定柑橘吸收和轉運硼的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為生長3個月的枳橙和香橙幼苗。

選取長勢一致的枳橙和香橙幼苗轉入1/2Hoag1and和Aron（全濃度）溶液培養(yǎng)，每2 h通氣15 min，在光周期為16 h/8 h（L/D）和晝夜溫差為28℃/22℃的條件下，每7 d更換一次營養(yǎng)液。待枳橙和香橙幼苗長出新根后分別隨機分為兩組，分別移入含有0mg·L-1（缺硼）和0.25mg·L-1（對照）的1/2Hoag1and和Aron（全濃度）溶液培養(yǎng)0h，4h，8h，1d，2d，3d后采樣，采樣部位分別為根、莖和葉，迅速置于液氮速凍，儲存于超低溫冰箱（-80℃）備用。

1.2 方法

1.2.1 CPBOR2和CjBOR2的克隆

總R N A的提取按照Trizo試劑盒（Ambion公司）說明書進行。第一鏈cDNA的合成按照PrimeScript RTreagent Ki（Perfect Rea1 Time）試劑盒（TaKaR公司）說明書進行。以 CsBOR2（orang1.1 t 01735.1）轉錄本序列為模板設計一對引物BOR2-F：CAGAACAATGGAAGAAA和BOR2-R：CTCCTGGAAAGTAGATAGAT，以 第一鏈cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物回收、純化，連接pMD 18-T載體（TaKaR公司），轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行測序。

1.2.2 生物信息學分析

生物信息學分析使用一系列在線服務工具和軟件，使用ORF Finde預測ORF區(qū)域（http：//www.ncbi.n1m.nih.gov/gorf/gorf.htm1），使用TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測蛋白質跨膜區(qū)域，使用C1usta12（http：//www.e bi.ac.uk/Too1s/msa/c1usta1w2/）進行蛋白質多序列比對和一致性分析，使用MEGA5.0軟件的Neighbor-Joining算法構建蛋白質系統(tǒng)進化樹［7-8］。

1.2.3 基因表達分析

以β-Actin為內參基因，定量引物為Actin-F：CCAAGCAGCATGAAGATCAA和Actin-R：ATCTGC TGGAAGGTGCTGAG［9］。以測序所得基因轉錄本保守序列為模板，設計一對引物qBOR2-F：ATTCT GCCCAAGTTTTTC和qBOR2-R：GCACCCATCTGTG TCTCT，以稀釋5倍的樣品cDNA為qPCR反應的底物，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（TaKaRa公司）說明書進行反應，每個樣品的cDNA擴增反應進行 4次獨立重復，利用SPSS16.0中Duncan’s多重比較對結果進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 CpBOR2和CjBOR2的克隆與測序

CPBOR2和CjBOR2的P C R擴增產(chǎn)物的電泳如圖1，片段大小2 000～3 000 bp。對 CPBOR2和CjBOR2測序結果進行ORF預測發(fā)現(xiàn)ORF長度分別為 2 133和 2 073 bp。與甜橙數(shù)據(jù)庫 CsBOR2（orange1.1t01735）的ORF序列進行相似性比對，相似性分別為99%和99%，從而確定所克隆序列為目的序列。

圖1 CPBOR2和CjBOR2的P C R擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2 CPB0R2和CjB0R2的生物信息學分析

CpBOR2，CjBOR2和CsBOR2的多序列氨基酸比對和跨膜區(qū)域預測表明（圖 2），CpBOR2和CjBOR2都具有7個跨膜區(qū)域，CpBOR2和CjBOR2都具有與AtBOR1相同的保守酪氨酸（Y）位點和賴氨酸（K）位點［10-11］，其中 CpBOR2在第41～60 bp處比CjBOR2多出20 bp。

構建 CpBOR2和 CjBOR2蛋白與其他植物BOR2蛋白的進化樹（圖 3）表明，CpBOR2和CjBOR2蛋白與甜橙CsBOR2蛋白的進化關系最近，其次與同為多年生雙子葉植物的葡萄VvBOR2進化距離較近，與水稻OsBOR2蛋白的進化距離最遠。

圖2 枳橙CpBOR2、香橙CjBOR2和甜橙CsBOR2蛋白氨基酸多序列比對和跨膜區(qū)域預測

圖3 CpBOR2和CjBOR2蛋白與其他植物BOR2蛋白的進化樹分析

2.3 CpBOR2和CjBOR2在缺硼脅迫下的表達模式

為了確定CPBOR2和CjBOR2的表達情況，本試驗用qPCR方法測定了2個基因在缺硼脅迫下各個時期的表達量（圖4）。缺硼脅迫下，CjBOR2相對于對照無顯著變化；CPBOR2在前期表達量顯著下降，8 h時最低，僅為對照的0.24倍，后期表達量上升，48 h時最高，為對照的5.76倍，且正常硼濃度下CPBOR2的表達量變化也較CjBOR2表達量變化劇烈。

3 討論

缺硼是我國南方柑橘產(chǎn)區(qū)常見的現(xiàn)象，嚴重影響南方柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。最近發(fā)現(xiàn)擬南芥AtBOR2可以應對一定程度的缺硼脅迫。柑橘為嫁接栽培，主要通過砧木根系吸收和轉運硼到地上部，本試驗以耐缺硼的砧木品種枳橙和不耐缺硼的砧木香橙為材料，克隆了AtBOR2的同源基因CPBOR2和CjBOR2，進行了相關生物信息學分析和缺硼脅迫下的表達分析。

CjBOR2較CpBOR2的氨基酸序列在N端缺失了20 bp，表明它們的蛋白質的功能可能出現(xiàn)了差別。缺硼脅迫下耐缺硼脅迫的枳橙CPBOR2表達量劇烈變化，響應缺硼脅迫，不耐缺硼的香橙CjBOR2的表達量與對照相比無顯著變化，不響應缺硼脅迫，表明CPBOR2在缺硼脅迫條件下可能參與體內硼酸的運輸從而調節(jié)體內硼濃度，而CjBOR2在香橙缺硼脅迫條件下的作用則不明顯，且正常情況下，CPBOR2表達量的變化較CjBOR2更加劇烈。缺硼脅迫下CjBOR2與CPBOR2對植物體內硼酸濃度調節(jié)能力的差異可能是造成2種砧木耐缺硼能力的差異的原因之一。

圖4 缺硼脅迫下根中CPBOR2和CjBOR2表達量的變化

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（責任編輯：張 韻）

S666

A

0528-9017（2016）01-0065-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20160125

2015-11-12

高等學校博士學科點專項科研基金（20130146110020）

顏廷帥（1989-），男，山東臨沂人，碩士，從事果樹方面的研究工作，E-mai1：y a nt i ng s hua i@ki ng e nt a.com。