一個水稻根長QTLqRL4的分離鑒定

徐曉明　張迎信　王會民 　任翠 　王汝慈 　沈希宏　 占小登吳瑋勛 　程式華,*　曹立勇,*

(1中國水稻研究所 國家水稻改良中心， 杭州 310006；2杭州師范大學(xué)， 杭州 310036； 3浙江省超級稻研究重點實驗室 杭州 310006；

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一個水稻根長QTLqRL4的分離鑒定

徐曉明1,2,3,#張迎信1,3,#王會民1,4任翠5王汝慈1,3沈希宏1,3占小登1,3吳瑋勛1,3程式華1,3,*曹立勇1,3,*

(1中國水稻研究所 國家水稻改良中心， 杭州 310006；2杭州師范大學(xué)， 杭州 310036；3浙江省超級稻研究重點實驗室 杭州 310006；

4江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 南昌 330200；5河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 鄭州 450002；*通訊聯(lián)系人，E-mail：shcheng@mail.hz.zj.cn，caolycgf@mail.hz.zj.cn)

XUXiaoming，ZHANGYingxin，WANGHuimin，etal.IdentificationofqRL4,amajorquantitativetraitlocusassociatedwithricerootlength.ChinJRiceSci, 2016, 30(4): 363-370.

徐曉明, 張迎信, 王會民, 等. 一個水稻根長QTLqRL4的分離鑒定. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(4)： 363-370.

摘要:為了分離鑒定 qRL4，以超級稻協(xié)優(yōu) 9308 衍生重組自交系與輪回親本中恢9308(R9308)回交多代的高代回交群體為材料，利用瓊脂無土栽培技術(shù),開展水稻根長QTL qRL4的分離鑒定研究，最后將 qRL4定位在第4染色體分子標(biāo)記RM5687與InDel49間624.6 kb范圍內(nèi)。此基因的定位與分離鑒定將有助于水稻根長相關(guān)遺傳機理的研究，為探究在基因水平上的水稻根系形態(tài)建成奠定了堅實基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:水稻； 根長； 數(shù)量性狀基因座

植物生長過程中，根系發(fā)揮著不可或缺的作用，包括固定，水分和養(yǎng)分的吸收等[1-2]，如具有扎根深、健壯且分支多的根系的植物在逆境中(如缺水以及養(yǎng)分匱乏)具有更強的生命力。由于根系研究技術(shù)的局限性和起步較晚，人們對根系的認識深度遠遠不及地上部，如產(chǎn)量、品質(zhì)、株型、葉型、抗病蟲和抗非生物脅迫等性狀[3]。但是研究者們已經(jīng)認識到開展水稻根系及遺傳育種研究的必要性。近年來，圍繞水稻根系遺傳研究的報道也有很多，在水稻根系QTL作圖與基因克隆研究方面取得了重大突破[4]。其中，對于控制根系生長的各性狀研究主要通過QTL分析，這些性狀涉及根系生物量、根長和根數(shù)(以及在特殊環(huán)境下的表型)等[5-12]。由于根系生長環(huán)境復(fù)雜，而且很難獲得完整的根系，導(dǎo)致表型鑒定準(zhǔn)確性很低，因而精細定位根系相關(guān)性狀QTLs難度較大。這可能是水稻根系相關(guān)QTLs很少被克隆的原因。

迄今為止，已克隆的根系相關(guān)基因大多是利用水稻突變體材料獲得。其中，包括根冠形成相關(guān)基因[13-15]、不定根系形成相關(guān)基因[16-18]、根長基因[19-23]、水稻硝態(tài)氮吸收基因 NIA[24]、水稻穗部長出不定根突變體基因[25]、水稻根系中特異表達銨同化基因GS8[26]、水稻磷高效吸收利用的轉(zhuǎn)錄因子 OsPTF1[27]、硅吸收轉(zhuǎn)運基因LsiL[28-29]以及二價鐵轉(zhuǎn)運基因OsIRT1[30]。這些根系相關(guān)基因的定位、分離、克隆研究，對人們揭示根系形態(tài)建成的遺傳機理奠定了堅實基礎(chǔ)，為開展水稻根系育種提供了有價值的參考信息。

我們在前期研究中，于第4染色體定位到一個控制根長的主效QTLqRL4，相對根長表型貢獻率最高達到36.5%，成株期可以顯著縮短根長8.1cm[31]。為了分離鑒定 qRL4，本研究以超級稻協(xié)優(yōu)9308衍生的重組自交系(RIL)與輪回親本中恢9308(R9308)回交多代的高代回交群體為材料，利用瓊脂無土栽培技術(shù)，借助經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段開展水稻根長QTLqRL4的分離鑒定研究。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究小組前期利用協(xié)青早B(XB)與中恢9308(R9308)雜交構(gòu)建的RILs對相關(guān)農(nóng)藝性狀進行了QTL定位，于第4染色體長臂上分子標(biāo)記RM307與RM1205之間定位到一個QTL簇，包括不同時期的相對根長、相對根冠比、相對根干質(zhì)量和相對植株干質(zhì)量等性狀。 qRL4被定位于標(biāo)記RM3317-RM1205之間，表型貢獻率達36.5%，在抽穗期可以顯著縮短根長8.1cm，屬于主效QTL[31]。

基于本研究小組前期利用RIL定位的結(jié)果，采用攜帶qRL4的RIL家系與R9308進行回交的方法，每代結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇篩選目標(biāo)片段，用于在高世代回交材料中篩選含有目標(biāo)QTL、背景較純合的近等基因系材料。結(jié)果在BC4F2世代挑選得到2個目標(biāo)片段為雜合型的株系X15-1和X15-2，每個株系都含有目標(biāo)QTL代換區(qū)間，且代換區(qū)間為雜合狀態(tài)，遺傳背景盡量與輪回親本一致，自交獲得BC4F3群體。其中，在BC4F3群體中得到兩個目標(biāo)片段純合的家系qRL4-NIL1和qRL4-NIL2用來驗證之前定位的結(jié)果，而X15-1和X15-2自交后獲得的次級分離群體共2450個單株用來縮小目標(biāo)QTL的區(qū)間。為了確認分離鑒定的群體中含有目標(biāo)QTL，調(diào)查了BC4F3：4群體的根系等農(nóng)藝性狀。

1.2種植方法

所有試驗材料均采用瓊脂種植。具體步驟如下：1) 將種子用70%酒精消毒1min，然后用蒸餾水清洗干凈，再用5%次氯酸鈉溶液消毒30min，用蒸餾水清洗干凈，之后把種子均勻平鋪于滅菌培養(yǎng)皿上，放少許蒸餾水使種子保持濕潤，于35℃下催芽待用；2) 將催好芽的種子均勻播于灌好瓊脂的插槽內(nèi)，一個槽大約可以播16株；3) 將種植好的箱體置于培養(yǎng)箱內(nèi)(晝夜溫度分別為30℃±2℃和21℃±2℃，自然光，每天光照14h，相對濕度70%)，種植水稻的插槽里面要一直保持瓊脂濕潤，以防瓊脂干枯裂口和長菌(圖1)。

瓊脂的配制方法：按照國際水稻所營養(yǎng)液配方[32]，根據(jù)需要稍作修改，用配好的營養(yǎng)液溶解瓊脂(瓊脂和營養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為1∶20)，并煮沸使瓊脂溶液呈無色透明狀，然后立即將無色透明的瓊脂溶液灌入插槽內(nèi)，待其冷凝后則完成培養(yǎng)基的配制。

1.3表型考查

苗期分別對7個農(nóng)藝性狀進行測定，具體方法如下：1)用直尺測量每株水稻的株高和根長，然后將水稻完整根系從植株上分離下來，按單根一條條分開，統(tǒng)計每株的根數(shù)；2) 將分離好的莖葉和根系分別裝在信封中，于烘箱中105℃下殺青1h，然后65℃下烘干至恒重，稱量莖葉干質(zhì)量和根系干質(zhì)量，計算獲得植株干質(zhì)量和根冠比等數(shù)據(jù)。

1.4InDel引物開發(fā)及qRL4定位

在SSR標(biāo)記RM3317與RM1205之間首先采用實驗室已有的公共引物以及Gramene(http：//www.gramene.org)上公布的84對公共引物和63對InDel引物，對 qRL4進行定位。利用實驗室已測序的親本協(xié)青早B和中恢9308的測序信息(北京華大基因研究中心)，分別截取第4染色體RM3317和RM1205標(biāo)記在兩親本上的DNA序列，利用LaserGene軟件MegAlign和Editseq工具對親本上截取的兩段DNA堿基序列進行比對分析，找出兩段序列之間插入缺失(Insertion/Deletion,InDel)序列位點，選取插入缺失的堿基長度為5～10bp作為設(shè)計引物序列模體，截取插入缺失位點前后各300bp序列進行序列標(biāo)記開發(fā)。利用PrimerPremier5.0軟件開發(fā)設(shè)計新InDel引物，引物設(shè)計的標(biāo)準(zhǔn)如下：1)長度18～24bp；2)GC含量40%～60%；3)Tm值50℃～65℃；4)沒有二級結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、3個連續(xù)相同堿基；5)引物3′末端堿基最好為C或者G；6)設(shè)計好的引物采用RAPDB(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)軟件進行染色體物理位置確定和標(biāo)記特異性檢測，特異性好的標(biāo)記序列由英濰捷基生物有限公司合成(表1)。

A-催芽；B-播種；C-播種后4d;D-播種后20d。

A,Acceleratinggermination；B,Seeding；C,Fourdaysafterseeding；D,Twentydaysafterseeding.

圖1瓊脂種植水稻技術(shù)

Fig. 1.Technologyofricecultivationbyagargel.

2結(jié)果與分析

2.1農(nóng)藝性狀的遺傳表現(xiàn)

CSSL群體與兩個親本的7個農(nóng)藝性狀值(表2)。株高為20.02cm，根長為5.25cm，根數(shù)均值為6.9，莖葉干質(zhì)量為81.5mg，根干質(zhì)量為33.8mg，植株干質(zhì)量均值為0.1153g，根冠比均值為0.44，7個性狀的最大值都超過了高值親本，最小值也都小于低值親本。親本協(xié)青早B與中恢9308的根長、根數(shù)、莖葉干質(zhì)量、根干質(zhì)量、植株干質(zhì)量及根冠比等6個性狀均差異明顯，高值親本比低值親本至少高10%。由表3可知，7個性狀兩兩之間的相關(guān)性均達極顯著水平。其中莖葉干質(zhì)量與植株干質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)達0.98，在所有性狀間表現(xiàn)為最大。其余各性狀間相關(guān)系數(shù)均達0.1以上，大部分集中于0.2到0.6之間，只有根長與根冠比為0.75，根數(shù)與根冠比為0.78，莖葉干質(zhì)量與根冠比為-0.63，根干質(zhì)量與植株干質(zhì)量為0.74，絕對值均大于0.6。

表1用于qRL4基因精細定位的標(biāo)記

Table1.MarkersusedinfinemappingofqRL4.

標(biāo)記Marker正向引物Forwardprimer(5'-3')反向引物Reverseprimer(5'-3')退火溫度Annealingtemperature/℃RM3317AGCAACCTGACAGAAGAATGTCTCGTTGAGTTGGAAGAAG55RM7279TGAAGGAGATACACCGAAACGGCTTGAGAGCGTTTGTAG55InDel9TGGATTTGTAGACATGTTTTTGGATAGTTTGGTTTTTGAT50RM5687AGAGAAGAAGGGAAGGAGGAAGGAGTGACTTGTGGGTGACTTGTGG55InDel49TGGTATCTCACTGCTGAAGAAACAGGGAGTACAGAAGGAT50InDel52TACGAGCGAAGGGGAGACGTGAAAACCGTTGGAGTG50RM16752TGTGAGGAGTGCCACATAGATACGGCTTAGATAGGGAACTTGTGGTTTGC55

2.2包含qRL4近等基因系的構(gòu)建

為了驗證前面定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，從BC4F3群體中挑選了兩個包含 qRL4代換區(qū)段的株系進行近等基因系的構(gòu)建(圖2)。圖中黑色部分代表供體親本協(xié)青早B的基因型片段，白色部分代表輪回親本中恢9308的基因型片段。由圖3可知， qRL4-NIL1和 qRL4-NIL2根長介于兩個親本之間， qRL4-NIL1為5.12cm，偏向于低值親本協(xié)青早B，而 qRL4-NIL2為6.33cm，偏向于高值親本中恢9308，兩者間差異達到1.21cm。從基因型上分析， qRL4-NIL1和 qRL4-NIL2只在第4染色體有一個區(qū)段的差異，雖然第5染色體也各有一個代換片段，但是因為兩者的代換區(qū)段完全一致，所以引起表型差異的遺傳區(qū)段不在這兩個雜合片段內(nèi)，只可能存在于第4染色體的代換區(qū)段內(nèi)。結(jié)合分子標(biāo)記信息，第4染色體上的代換區(qū)段為RM3317-RM1205，正好包含了之前定位到的 qRL4，證明兩者之間的表型差異是由 qRL4引起的，也更進一步表明 qRL4位于標(biāo)記RM3317和RM1205間。

2.3根長qRL4的精細定位

結(jié)合根長表型，X15-1和X15-2兩個群體共篩選到289個隱性單株，利用具有多態(tài)性的9個分子標(biāo)記進行分離鑒定(表4)。由表3可知，區(qū)間越大，交換單株越多，隨著標(biāo)記間距離的縮小，交換單株數(shù)量越來越少，最后在標(biāo)記RM5687與InDel49之間沒有找到交換單株，最后將 qRL4定位在標(biāo)記RM5687與InDel49之間、物理距離為624.6kb范圍內(nèi)(圖4)。

表2水稻染色體片段代換系群體7個農(nóng)藝性狀的表型特征

Table2.CharacterofsevenphenotypictraitsinCSSLpopulationofrice.

性狀Traits親本Parent協(xié)青早BXieqingzaoB中恢9308R9308CSSL群體CSSLpopulation平均值±標(biāo)準(zhǔn)差Mean±SD變幅Range峰度Kurtosis偏度Skewness株高PH/cm19.34±0.4620.33±0.3520.02±2.7611.4～27.01.64-0.83根長RT/cm4.67±0.256.47±1.07**5.25±1.61.3～9.7-0.21-0.04根數(shù)RN8.4±0.57.0±1.1**6.9±1.63.0～12.00.230.68莖葉干質(zhì)量DWS/mg84.33±13.679.00±8.03**81.5±7.231.0～177.00.250.78根干質(zhì)量DWR/mg39.00±7.6033.00±7.04**33.8±8.313.0～75.01.190.65植株干質(zhì)量TDW/mg123.33±7.40111.00±4.06**115.3±3.853.0～230.00.440.85根冠比RS0.46±0.080.42±0.06**0.44±0.130.15～1.781.771.29

PH，Plantheight;RL，Rootlength；RN，Rootnumber；DWS，Dryweightofshoots；DWR，Dryweightofroots；TDW，Totaldryweight；RS，Root/Shoot；SD，Standarddeviation.*and**，Significantat0.05and0.01levels,respectively.Thesameasbelow.

表3水稻染色體片段代換系群體7個性狀的相關(guān)性分析

Table3.CorrelationcoefficientsofseventraitsinCSSLpopulationofrice.

性狀Trait株高PH根長RT根數(shù)RN莖葉干質(zhì)量DWS根干質(zhì)量DWR植株干質(zhì)量TDW株高PH根長RT0.44**根數(shù)RN0.33**0.24**莖葉干質(zhì)量DWS0.49**0.28**0.49**根干質(zhì)量DWR0.22**0.12**0.34**0.59**植株干質(zhì)量TDW0.46**0.26**0.49**0.98**0.74**根冠比RS-0.45**0.75**0.78**-0.63**0.18**-0.47**

白色和黑色分別代表純合的中恢9308和協(xié)青早B的基因型。

WhiteandblackboxesrepresenthomozygousallelesfromZhonghui9308andXieqingzaoB,respectively.

圖2兩個攜帶qRL4近等基因系的基因型

Fig. 2.GenotypesoftwoneartsogeniclinesharboringqRL4.

圖3qRL4-NIL1和qRL4-NIL2 苗期根長比較

Fig. 3.RootlengthofqRL4-NIL1andqRL4-NIL2atseedlingstage.

3討論

3.1瓊脂種植水稻技術(shù)的優(yōu)缺點

水稻根系的研究方法很多，主要有土鉆法、土柱法、容器法、三維坐標(biāo)容器法和虛擬根系模型等。這些方法獲取的根系都會受到不同程度損傷，難以獲得完整的根系。瓊脂種植水稻技術(shù)是一項新技術(shù)，是本研究小組經(jīng)過上百次反復(fù)試驗探索出來的一項固體基質(zhì)無土栽培技術(shù)。該技術(shù)采用瓊脂和營養(yǎng)液配置培養(yǎng)基，把配制好的瓊脂培養(yǎng)基灌入特制的箱體槽中，冷凝之后把水稻催芽種子種于瓊脂上即可。使用此技術(shù)種植水稻可以更好地模擬水稻植株在土壤環(huán)境中生長，使根系的生長具有一定的阻力，可以更接近于土壤環(huán)境中的生長狀況，比水培種植水稻技術(shù)具有明顯的優(yōu)點。此外，該技術(shù)還便于檢測水稻苗期生長過程中各種性狀，例如生理生化、脅迫、蛋白提取、根系掃描測定等，且不受時間、空間和環(huán)境影響，取材方便，管理方便。此法的缺點是操作繁瑣，種子和瓊脂要消毒滅菌，不消毒滅菌瓊脂就容易發(fā)霉腐爛，影響水稻生長。另一缺點是瓊脂表面極易干裂，要定期澆水以保證瓊脂表面濕潤。該技術(shù)已經(jīng)申請了國家專利。

3.2控制根長的一個主效QTL

根深才能葉茂,要獲得繁茂的地上部植株，地下部根系也必須生長良好。關(guān)于水稻根系特征的研究已經(jīng)有很多相關(guān)報道，例如，Uga等[38]定位的一個與地表根生長有關(guān)的主效QTLqSOR1，位于第7染色體上標(biāo)記RM21941與RM21976間，物理距離為812kb；Kamoshita等[39]研究了在淹水條件下一個水稻群體根系相關(guān)農(nóng)藝性狀的QTL。Mitsuhiro等[40]采用水培方法，在不同NH4+濃度條件下，將一個水稻苗期根長主效QTLqRL6.1，定位于C11635-P3A2標(biāo)記間337kb的范圍內(nèi)，可解釋的表型變異為13.5%～21.1%，并且可以增加產(chǎn)量。一些在陸稻中可以增加產(chǎn)量的根系性狀相關(guān)QTL已有相關(guān)研究[41]。然而，有關(guān)水稻根系性狀克隆的基因極少，這可能是因為大田環(huán)境下水稻根系很難獲取，且性狀很難考查，而普通營養(yǎng)液水培法又工作量太大、可操作性不高的緣故。利用構(gòu)建染色體片段代換系的高代回交群體BC4F4為材料對其進行精細定位，最后將 qRL4定位在第4染色體靠近著絲粒的一個624.6kb的區(qū)域內(nèi)(圖4)。依據(jù)水稻注解工程數(shù)據(jù)庫(RiceAnnotationProject,RAP3,http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)，在此區(qū)間 qRL4有89個候選基因，由于候選基因較多，尚不能預(yù)測 qRL4精確的候選基因。今后的工作主要是縮小 qRL4所在區(qū)間的范圍，爭取預(yù)測并克隆該基因，進而對其進行功能互補和分子機理探索。

A-第4染色體遺傳圖；B-qRL4區(qū)間確定。分子標(biāo)記對應(yīng)的數(shù)字為日本晴基因組第4染色體的物理距離(Mb)。

A,LinkagemapoftheRILsderivedfromXieqingzaoB×R9308.B，IdentificationofqRL4.ThenumbersinparenthesesbesidetheDNAmarkersindicatetheirphysicalmapposition(Mb)onchromosome4ofNipponbare.

圖4qRL4的精細定位

Fig. 4.LocationofqRL4onricechromosome4.

表4不同標(biāo)記間重組單株數(shù)

Table4.NumberofrecombinationplantsforInDelmarkers.

群體Population交換單株數(shù)NumberofrecombinationplantsRM3317RM7279InDel9RM5687InDel49InDel52RM16752RM16791RM1205X15-1151040023511X15-2211450012614

3.3qRL4 在水稻育種中的應(yīng)用前景

生產(chǎn)上水分虧缺是一個限制水稻產(chǎn)量的重要非生物因素[42]。全世界范圍內(nèi)栽培水稻的區(qū)域，將近有一半的地方存在水分虧缺問題[43]。因此，改良水稻根系的吸水能力是育種上急需解決的難題。Kamoshita等[44]考查了深根比率和深根量等根系性狀QTLs，將他們定位于第2、3、4、9和11染色體。然而，前人的研究都集中于水稻根系整體特征，沒有對根系各性狀進行細分研究，這造成了很多QTL定位結(jié)果很難繼續(xù)深入。 qRL4于苗期可以明顯縮短根長，在大田生產(chǎn)上屬于劣質(zhì)基因，高產(chǎn)水稻中最好沒有該基因或者該基因不表達。在生產(chǎn)實踐中，我們可以利用基因定點敲除技術(shù)，將該基因敲除或者沉默掉，以保證根系長度不受影響。確定候選基因并且克隆該基因，以及進行功能互補驗證等，將有助于探明根系功能強大型水稻品種對水分吸收利用率高的遺傳機理，為培育根系生理功能旺盛的高產(chǎn)品種打下堅實基礎(chǔ)。

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收稿日期:2015-04-20； 修改稿收到日期: 2015-07-30。

基金項目:國家科技支撐計劃資助項目(2011BAD35B02); 浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LQ14C130003)。

中圖分類號:Q343.1+5; S511.032

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)04-0363-08

IdentificationofqRL4,aMajorQuantitativeTraitLocusAssociatedwithRiceRootLength

XUXiao-ming1,2,3,#,ZHANGYing-xin1,3,#,WANGHui-min1,4,RENCui5,WANGRu-ci1,3,SHENXi-hong1,3,ZHANXiao-deng1,3,WUWei-xun1,3,CHENGShi-hua1,3,*,CAOLi-yong1,3,*

(1NationalRiceImprovementCenter，ChinaNationalRiceResearchInstitute,Hangzhou310006,China;2HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310036,China;3KeyLaboratoryforZhejiangSuperRiceResearch,Hangzhou310006,China;4JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200,China;5HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;*Correspondingauthors,E-mail：shcheng@mail.hz.zj.cn;caolycgf@mail.hz.zj.cn)

Abstract:To identify the qRL4, rice lines derived from the hybrid rice Xieyou 9308 with genetic backgroud of Zhonghui 9308 (R9308) and substituted segements from Xieqingzao B (XB) were agar-cultivated for phenotyping of rice seedling root length and molecular marker-based genotyping. The qRL4 was finally narrowed to a 624.6 kb interval (RM5687-InDel49) on chromosome 4. The identification of qRL4 will be helpful to clarify genetic factors controlling root architecture in rice.

Key words:rice； root length； QTL