NKG2D和分泌型M ICA在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

徐 弘，陳 炯，趙 躍，朱興興，方恒忠，趙金錢

NKG2D和分泌型M ICA在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

徐 弘，陳 炯，趙 躍，朱興興，方恒忠，趙金錢

目的 研究NK細胞活化性受體（NKG2D）及其分泌型主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)基因A（MICA）在胰腺癌和癌旁組織中的表達及其臨床意義。方法 通過免疫組織化學(xué)方法檢測70例胰腺癌組織和癌旁組織中NKG2D及分泌型MICA表達情況，并分析兩者之間的關(guān)系及與臨床病理因素之間的關(guān)系。結(jié)果 NKG2D和分泌型MICA在胰腺癌組織中的陽性表達率為32.9%（23/70）和67.1%（47/70）；而在癌旁組織中的陽性表達率為60.0%（42/70）和31.4% （22/70）；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NKG2D、分泌型MICA在胰腺癌組織中的表達與腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤病變部位及大小均無關(guān)。NKG2D的表達與分泌型MICA的表達呈負相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論 NKG2D的表達與分泌型MICA的表達呈顯著相關(guān)性，與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，分泌型MICA可能通過下調(diào)NKG2D在腫瘤中的表達，從而逃避機體對腫瘤的免疫應(yīng)答。

胰腺癌；NKG2D；MICA

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-8 8：29：02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.062.htm l

胰腺癌是消化系統(tǒng)中惡性程度高、早期診斷率低、治療極其困難且預(yù)后效果較差的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，5年生存率小于5%［1］。胰腺癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致其常規(guī)治療效果不佳，尋求更為有效的治療方法成為目前研究熱點。腫瘤過繼免疫治療是指在體外將抗腫瘤效應(yīng)細胞進行誘導(dǎo)、激活和擴增后再回輸給腫瘤患者，來提高患者抗腫瘤能力，達到治療和預(yù)防復(fù)發(fā)的目的。雙陰性T細胞（double negative T cell，DNT）是一種既具有免疫抑制調(diào)節(jié)功能又可以殺傷腫瘤細胞的T細胞亞群［2］，其抗腫瘤效應(yīng)逐漸被研究者關(guān)注。DNT細胞可以通過NK細胞活化性受體（NK cell activating receptor，NKG2D）途徑參與殺傷腫瘤細胞［3］。該研究通過免疫組織化學(xué)法聯(lián)合檢測 NKG2D和相關(guān)配體，即分泌型主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)基因A（major histocompatibility complex class I chain-related A，MICA）在胰腺癌和癌旁組織中的表達，研究兩者之間的關(guān)系及與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為胰腺癌免疫治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 病理標(biāo)本 胰腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織（距離癌組織＞1 cm）的石蠟標(biāo)本70例，取自2008 年7月～2013年7月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科收治經(jīng)手術(shù)治療后，經(jīng)病理證實為胰腺癌的標(biāo)本。其中男37例，女33例；年齡42～78（60.24 ±9.72）歲；＜60歲33例，≥60歲37例；胰頭癌39例，胰體尾癌31例；腫瘤?＜20 mm 25例，≥20 mm 45例；病理學(xué)組織學(xué)分型：高分化22例，中低分化48例；有淋巴轉(zhuǎn)移42例，無淋巴轉(zhuǎn)移28例；有神經(jīng)侵犯45例，無神經(jīng)侵犯25例?；颊咝g(shù)前均未行化療或放療。本實驗的70例標(biāo)本的病理參數(shù)均按照國際抗癌協(xié)會（UICC）2013年標(biāo)準(zhǔn)［4］進行分級。

1.2 主要試劑 羊抗人NKG2D多克隆抗體和鼠抗人 MICA單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；相應(yīng)二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 運用免疫組織化學(xué)法檢測相關(guān)蛋白的表達。5μm厚組織連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、枸櫞酸鹽微波抗原修復(fù)后3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，分別滴加一抗NKG2D（濃度1∶50）、一抗MICA（濃度1∶50），4℃過夜，復(fù)溫后滴加二抗，最后DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封片。由兩名未參與實驗、經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對切片進行分析。兩種蛋白的染色主要定位于細胞質(zhì)中，評估標(biāo)準(zhǔn)采用半定量評分法，即在高倍鏡下隨機選取5個區(qū)域，根據(jù)染色細胞的強度分別評分，取平均分?jǐn)?shù)，再根據(jù)染色細胞的百分比分別評分，取平均分?jǐn)?shù)。染色強度評分為：細胞質(zhì)未染色為0分，淡黃色（弱）為1分，黃色（中）為2分，棕黃色（強）為3分；染色細胞百分比評分為：視野中無染色細胞為0分，染色細胞占視野細胞的1%～10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。每個組織切片的最后得分為染色強度平均分?jǐn)?shù)和染色百分比平均分?jǐn)?shù)的乘積，得分≥4分者被定為高表達，得分＜4分者即定為低表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行分析。選用χ2檢驗或Fisher確切概率法。NKG2D與分泌型MICA的相關(guān)性分析采用χ2檢驗的基礎(chǔ)上計算Pearson列聯(lián)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織及癌旁組織中NKG2D、分泌型M ICA的表達 NKG2D和分泌型MICA主要定位于染色細胞的胞質(zhì)中。見圖1。NKG2D和分泌型MICA分別在70例胰腺癌組織中的陽性表達率為32.9%（23/70）和67.1%（47/70）；NKG2D和分泌型MICA分別在癌旁組織中的陽性表達率為60.0%（42/70）和31.4%（22/70），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.216，P=0.013；χ2=10.009，P=0.002）。胰腺癌組織中MICA和NKG2D均低表達5例，MICA和NKG2D均高表達5例，MICA高表達和NKG2D低表達42例，MICA低表達和NKG2D高表達18例。相關(guān)性分析顯示NKG2D的表達與分泌型MICA的表達存在負相關(guān)性（r=0.676，P＜0.001）。

2.2 NKG2D、分泌型M ICA的表達與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 NKG2D、分泌型MICA在胰腺癌組織中的表達均與腫瘤的分化程度、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.001），而與年齡、性別、腫瘤病變部位及大小均無關(guān)。見表1。

圖1 NKG2D、M ICA在胰腺癌和癌旁組織中的表達×400 A：MICA；B：NKG2D；1：胰腺癌組織；2：癌旁組織

3 討論

本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測70例胰腺癌組織和癌旁組織中NKG2D及分泌型MICA表達情況，結(jié)果表明NKG2D在胰腺癌組織中呈低表達，而分泌型MICA在胰腺癌組織中呈高表達，兩者在胰腺癌組織中的表達均與腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤病變部位及大小無關(guān)，提示兩者與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力存在一定的相關(guān)性，可能成為預(yù)測和評估胰腺癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)。

NKG2D通過識別靶細胞表面誘導(dǎo)產(chǎn)生的相關(guān)配體來傳遞活化信號并激活機體免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮對靶細胞的殺傷作用，其中MICA是NKG2D的最主要配體［5-6］。MICA隨著腫瘤不斷進展可分為膜型MICA和分泌型MICA兩類，兩者在腫瘤免疫中起到的作用卻截然相反［7］。在腫瘤的早期階段MICA高表達于細胞表面，即膜型MICA，隨著腫瘤的進展，膜型MICA從細胞膜表面脫離以分泌型形式進入細胞質(zhì)［8］。膜型 MICA蛋白通過與NKG2D結(jié)合可以為效應(yīng)細胞的活化提供共刺激信號，介導(dǎo)γδT細胞等活化促進細胞殺傷效應(yīng)［9］。而分泌性MICA卻下調(diào)NKG2D的表達，嚴(yán)重損害了免疫細胞的抗腫瘤效應(yīng)從而使NKG2D-MICA系統(tǒng)的作用銳減［10］。本實驗顯示MICA染色主要定位于胰腺癌細胞質(zhì)中，即胞質(zhì)中分泌型MICA呈高表達，而細胞膜染色情況（膜型 MICA）并未觀察到，可能的原因是本實驗中的病例大多屬于進展期胰腺癌且早期胰腺癌不一定百分之百表達膜型MICA。NKG2D和分泌型MICA的表達呈負相關(guān)性，說明分泌型MICA可能通過下調(diào) NKG2D的表達，影響NK細胞及γδT細胞的抗腫瘤效應(yīng)，從而使NKG2D-MICA系統(tǒng)的作用銳減，導(dǎo)致促進腫瘤的免疫逃避和妥協(xié)宿主對感染的抵抗力［9-10］。

胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，由于患者早期癥狀隱匿，大部分患者在首次診斷時已發(fā)生嚴(yán)重的局部侵犯和遠處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致手術(shù)治療效果不佳，DNT細胞免疫治療逐漸走入人們的視野，Li et al［11］認(rèn)為DNT細胞可通過抑制B淋巴細胞的增殖和免疫球蛋白的生成來調(diào)節(jié)腫瘤免疫，并認(rèn)為體外擴增的DNT細胞在早期分化階段能夠有效抑制多種腫瘤細胞的生長。DNT細胞可以通過分泌可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（soluble tumor necrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand，sTRAIL）參與殺傷腫瘤細胞的過程并受到NKG2D分子調(diào)節(jié)，當(dāng)中和TRAIL時會顯著降低對腫瘤的殺傷效果［3］。在前期的實驗中同樣證明了DNT細胞可以通過分泌sTRAIL與胰腺癌細胞所表達的TRAIL受體結(jié)合從而誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡［12］，結(jié)合當(dāng)前的研究結(jié)果表明MICA-NKG2D途徑可能是通過介導(dǎo)TRAIL的表達來降低DNT細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。

綜上所述，本研究表明NKG2D在胰腺癌組織中呈低表達，而分泌型MICA在胰腺癌組織中呈高表達，兩者在胰腺癌組織中的表達呈負相關(guān)性，均與腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。這揭露了MICA-NKG2D途徑可能是DNT細胞抑制胰腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的機制之一。然而，NKG2D和分泌型MICA在胰腺癌進展中的具體機制目前尚不清楚，未來仍需繼續(xù)深入探索NKG2D-MICA途徑，詳細解析其發(fā)揮作用及具體的相關(guān)分子機制。

表1 M ICA和　NKG2D表達與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性（n）

［1］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012［J］.CA Cancer JClin，2012，62（1）：10-29.

［2］ Kim E Y，Juvet SC，Zhang L.Regulatory CD4（-）CD8（-）double negative T cells［J］.MethodsMol Biol，2011，677：85-98.

［3］ Dokouhaki P，Han M，Joe B，et al.Adoptive immunotherapy of cancer using ex vivo expanded human gammadelta T cells：a new approach［J］.Cancer Lett，2010，297（1）：126-36.

［4］ Sobin L H，Compton C C.TNM seventh edition：what’s new，what’s changed：communication from the International Union A-gainst Cancer and the American Joint Committee on Cancer［J］. Cancer，2010，116（22）：5336-9.

［5］ Cai X，Dai Z，Reeves R S，et al.Autonomous stimulation of cancer cell plasticity by the Human NKG2D lymphocyte receptorcoexpressed with its ligands on cancer cells［J］.PLoSOne，2014，9 （10），e108942.

［6］ Chalupny N J，Sutherland C L，LawrenceW A，etal.ULBP4 is a novel ligand for human NKG2D［J］.Biochem Biophysical Res Commun，2003，305（1）：129-35.

［7］ Aguera-Gonzalez S，Gross CC，F(xiàn)ernandez-Messina L，et al.Palmitoylation of MICA，a ligand for NKG2D，mediates its recruitment to membranemicrodomains and promotes its shedding［J］.Eur J Immunol，2011，41（12）：3667-76.

［8］ Jia H Y，Liu JL，Zhou C J，et al.High expression ofMICA in human kidney cancer tissue and renal cell carcinoma lines［J］.Asian Pac JCancer Prev，2014，15（4）：1715-7.

［9］ Xuan X Y，Zhang JF，Hu G M，et al.Upregulated expression of NKG2D and its ligands give potential therapeutic targets for patients with thymoma［J］.Cancer Gene Ther，2015，22（7）：368-74.

［10］Chen D，Gyllensten U.MICA polymorphism：biology and importance in cancer［J］.Carcinogenesis，2014，35（12）：2633-42.

［11］LiW，Tian Y，Li Z，etal.Ex vivo converted double negative T cells suppress activated B cells［J］.Int Immunopharmacol，2014，20 （1）：164-9.

［12］趙 躍，陳 炯，楊仁保，等.STRAIL及受體TRAIL-R1在DNT細胞抑制胰腺癌細胞中作用及意義［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，49（11）：1613-7.

Expression and clinical significances of NKG2D and secreted M ICA in pancreatic carcinoma

Xu Hong，Chen Jiong，Zhao Yue，et al
（Dept of General Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To investigate the expression and clinical significances of NK cell activating receptor （NKG2D）and secreted MHC class Ichain-related A（MICA）in pancreatic cancer.Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of NKG2D and secreted MICA in tomor tissues and adjacent non-tomor tissues from a total of70 patientswith pancreatic carcinoma.The correlation of NKG2D and secreted MICA was analyzed.The relationships between NKG2D and secreted MICA expressionsand clinicopathologicalparameterswere evaluated.Results The positive expression rates of NKG2D and secreted MICA were 32.9% （23/70）and 67.1% （47/70）in pancreatic carcinoma tissues，and 60.0% （42/70）and 31.4% （22/70）in paracarcinoma tissues，respectively，both with statistical significance（P＜0.05）.The expressions of NKG2D and secreted MICA were significantly correlated with tumor differentiation，nerve invasion，lymph nodemetastasis and TNM staging in pancreatic carcinoma tissues（P＜0.05）.However，there was no obvious association between NKG2D or secreted MICA and age，gender，tumor location，or tumor size.NKG2D expression was negatively correlated with secreted MICA expression in pancreatic carcinoma tissues（P＜0.05）.Conclusion Down-regulated NKG2D and up-regulated secreted MICA are significantly correlated with the infiltrative capability in pancreatic carcinoma.NKG2D and secreted MICA have a negative correlation in pancreatic carcinoma tissues，which reveals that secreted MICA may inhibit the level of NKG2D expression during tumor progression，thereby reducing the immune responses against tumor cells in patientswith pancreatic carcinoma.

pancreatic carcinoma；NKG2D；MICA

R 735.9

A

1000-1492（2016）04-0591-04

2016-01-08接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81071985）；安徽省國際科技合作項目（編號：10080703038）；安徽省科技攻關(guān)課題（編號：11010402172）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普通外科，合肥 230001

徐 弘，男，碩士研究生；
陳 炯，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ch_jiong@126.com