慢性胃液吸入對(duì)大鼠移植肺損傷及機(jī)制的研究

林風(fēng)武，張　川，梁飛海,程坤鵬，張　強(qiáng)，趙　巖

(1.吉林大學(xué)第三醫(yī)院 胸外科，長(zhǎng)春130031； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 小兒外科，長(zhǎng)春130000;3.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 胸外科，長(zhǎng)春130000；4.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，長(zhǎng)春130000)

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慢性胃液吸入對(duì)大鼠移植肺損傷及機(jī)制的研究

林風(fēng)武1，張川2，梁飛海1,程坤鵬3，張強(qiáng)3，趙巖4*

(1.吉林大學(xué)第三醫(yī)院 胸外科，長(zhǎng)春130031； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 小兒外科，長(zhǎng)春130000;3.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 胸外科，長(zhǎng)春130000；4.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 內(nèi)分泌科，長(zhǎng)春130000)

肺移植是治療終末期肺病的最有效手段。但肺移植術(shù)后1、3、5年生存率分別為72%、56%及43%，落后于其它實(shí)體器官移植成活率[1]。食管胃返流疾病(Gastroesophageal Diseas,GERD)是影響肺移植術(shù)后生存率的一個(gè)因素。研究表明，移植肺與胃液的接觸與間質(zhì)性肺炎、慢性支氣管炎及哮喘等呼吸道疾病有關(guān)[2-4]。肺移植術(shù)后存在食管胃返流的病人發(fā)生肺功能障礙及急性排斥反應(yīng)的幾率增加，在抗返流手術(shù)后以上情況得到改善[5-8]。

目前胃液影響移植肺功能的具體機(jī)制仍不明確。比如胃液中起作用的是胃酸還是胃蛋白酶，胃液接觸是否和免疫排斥有協(xié)同作用等等。因此，本研究通過建立動(dòng)物肺移植模型，模擬食管胃返流疾病小劑量反復(fù)胃液灌注，來進(jìn)一步研究胃液對(duì)移植肺臟的損傷及其機(jī)理。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2012年1月至2013年12月期間共納入大鼠30只，隨機(jī)分配為兩組進(jìn)行大鼠的左肺移植模型，A組為同系異體移植，B組為異系異體移植。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械持針器×1把、線剪×1把、組織剪×1把、紋氏鉗×4把、血管鉗×2把、顯微器械×1套(直頭顯微鉗、直頭顯微持針器、顯微彎剪、顯微直剪、眼科鑷子、無創(chuàng)血管夾)。

1.2.2主要試劑材料水合氯醛、阿托品注射液、肝素鈉注射液、青霉素、慶大霉素、生理鹽水、碘伏、酒精、靜脈留置針、2號(hào)慕絲線、5-0 poly可吸收線、8-0雙針醫(yī)用錦綸單絲線、注射器、無菌過濾器、醫(yī)用紗布、醫(yī)用脫脂棉球、無菌手套、無菌口罩、標(biāo)準(zhǔn)刻度尺等。

1.2.3主要儀器動(dòng)物呼吸機(jī)、雙極電凝高頻電刀、手術(shù)放大鏡、冷光照明燈、制冰機(jī)、冰箱、超凈工作臺(tái)、恒溫循環(huán)水浴箱、倒置相差顯微鏡等。

1.2.4套管的制作套管由兩部分組成，包括套管體和套管柄，套管體1.5 mm-2.0 mm，套管柄1.0 mm。套管體的外表面通過微血管鉗鉗夾數(shù)次或剪出一個(gè)小裂痕以防止結(jié)扎后脫落，套管體下端可剪成鋸齒狀以防止脫落。肺動(dòng)脈套管、肺靜脈套管和支氣管套管分別用18G、16G、14G靜脈留置針制作[9]。

1.3大鼠左肺肺移植模型建立

1.3.1麻醉術(shù)前禁食12 h，禁水6 h。2%異氟醚吸入麻醉后腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(50 mg/kg ),約3-5 min大鼠意識(shí)喪失，呼吸平穩(wěn)，全身肌肉松弛。麻醉成功后固定四肢、頭部于操作臺(tái)面，胸腹部備皮。提起鼠舌，蚊式鉗伸入口腔內(nèi)上抬鼠舌根，暴露聲門，14G套管針改制的氣管插管插入大鼠氣管內(nèi)，接呼吸機(jī)。觀察大鼠是否呼吸平穩(wěn)、胸廓起伏有致，以確保氣管插管位置正確。容量模式控制呼吸，頻率80-100次/分，潮氣量10 ml/kg，氧濃度20%

1.3.2供體肺的切取消毒后采用胸腹正中入路，肋緣下切斷腹部入腹腔，提起劍突，沿胸壁內(nèi)側(cè)剪開膈肌進(jìn)入胸腔。氣管插管的正確位置保證了機(jī)械通氣的有效性和入胸后大鼠的生命體征平穩(wěn)。暴露下腔靜脈并夾閉，剪開左心耳，18G套管針刺入下腔靜脈，緩慢注入肝素鹽水，直到肺臟變?yōu)樯n白顏色。游離結(jié)扎氣管，保持肺臟在半膨脹狀態(tài)，剪斷氣管，提起氣管，游離氣管食管間組織，然后離斷下肺韌帶、胸主動(dòng)脈及下腔靜脈等結(jié)構(gòu)，取出心肺聯(lián)合體。

心肺聯(lián)合體放置于盛有少量冰鹽水的培養(yǎng)皿中，游離左側(cè)肺門，由肺靜脈開始，繼而肺動(dòng)脈、支氣管。于左肺靜脈根部聯(lián)通少部分心房一起剪下，在支氣管上方游離左肺動(dòng)脈并于左肺動(dòng)脈剪斷；游離出左主支氣管，于其根部夾閉后離斷。采用外翻式套管技術(shù)完成肺動(dòng)、靜脈及支氣管的套管操作：18G套管針改制的套管用于肺動(dòng)脈，16G套管、14G套管分別用于肺靜脈和支氣管的套管操作。將相應(yīng)結(jié)構(gòu)穿過相應(yīng)套管并外翻，5-0絲線結(jié)扎穩(wěn)妥固定。

1.3.3受體肺臟切除及左肺移植受體麻醉、插管和機(jī)械通氣均同供體手術(shù)。剃毛消毒，左第4肋間入胸，以棉簽小心細(xì)致地將左肺撥至術(shù)野操作區(qū)，小文件夾子夾住左肺外緣將左肺拉出，寬膠布固定。肺門區(qū)暴露清楚，充分暴露游離支氣管、肺動(dòng)脈、肺靜脈。盡量游離血管至最大長(zhǎng)度，這樣就方便了接下來移植肺血管支氣管的套管插入。取出供體肺，緊鄰受體左肺置于受體胸腔上方。近心端橫行剪開左肺靜脈前壁，達(dá)管周1/3，生理鹽水沖洗管腔，顯微鑷子提起剪開處血管緣，顯微鑷子夾持供體左肺靜脈外翻包繞的套管，將其置入受體左肺靜脈內(nèi)。將之前已預(yù)留在受體左肺靜脈上得5-0絲線結(jié)成的外科結(jié)收緊，妥善將供體套管固定在受體左肺靜脈中，從而完成左肺靜脈的套管式吻合。應(yīng)用同樣操作完成左支氣管及左肺動(dòng)脈的套管吻合。剪除受體左肺，按肺靜脈、肺動(dòng)脈、支氣管的順序開放血管夾，恢復(fù)潮氣量，左肺還納入胸腔內(nèi)，留置引流，麻醉蘇醒后，帶自主呼吸頻率達(dá)到90次/分后拔除氣管插管。

1.3.4術(shù)后護(hù)理單籠喂養(yǎng)，自主飲水進(jìn)食，觀察大鼠活動(dòng)狀態(tài)，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

1.4試驗(yàn)的分組

按以上方法陸續(xù)制作移植模型并按如下條件分組，然后小劑量胃液及中性胃液分別按實(shí)驗(yàn)要求灌注：

A1組(4例)：同系異體移植鼠鹽水組( F344或WKY同系異體左肺移植)

A2組(5例)：同系異體移植鼠胃液灌流組( F344或WKY同系異體左肺移植)，

A3組(6例)：同系異體移植鼠中性胃液灌流組( F344或WKY同系異體左肺移植)，

B1組(4例)：異系異體移植鼠鹽水組(WKY移植至F344)

B2組(5例)：異系異體移植鼠胃液灌流組(WKY移植至F344)

B3組(6例)：異系異體移植鼠中性胃液灌流組(WKY移植至F344)

胃液及滴定至中性胃液對(duì)大鼠左肺移植模型灌注：吸入麻醉后氣管插管(16號(hào)軟套管)，左側(cè)臥位，由氣管插管內(nèi)深入一細(xì)膠管，由此管緩慢注入胃液等相應(yīng)液體。灌注開始時(shí)間為移植1周后，每周1次，每次劑量0.3 ml/kg體重，共12次，最后一次灌流后1周處死動(dòng)物，進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)。

1.5行移植肺大體觀測(cè)、肺功能及組織學(xué)檢查、免疫細(xì)胞檢測(cè)。

1．5．1標(biāo)本采集：大鼠麻醉機(jī)械通氣后，按供體肺切除方法操作，肋弓下剪開膈肌，暴露胸腔內(nèi)結(jié)構(gòu)，阻斷左、右上腔靜脈及下腔靜脈，由下腔靜脈緩慢低壓灌注生理鹽水，剪取心肺組織聯(lián)合體。

1.5.2觀察移植肺顏色、大小，并于切取后立即氣管插管于20 mmH2O壓力下通氣，測(cè)試肺臟膨脹百分度。觀察移植肺的大小、色澤、柔軟度及肺膨脹程度。剪取組織塊進(jìn)行移植肺的HE染色及Masson染色觀察單核細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡組織受損情況。

1.5.3觀察標(biāo)本的纖維化程度，鏡下肺纖維化程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參見相關(guān)文獻(xiàn)[10]。

1.5.4免疫組化檢測(cè)免疫細(xì)胞CD68及CD8。了解移植物局部免疫反應(yīng)情況。通過抗大鼠 CD68 和CD8單克隆抗體進(jìn)行免疫組化分析?？勾笫驝D 68 識(shí)別長(zhǎng)度為100 kd的單鏈糖蛋白，該單鏈糖蛋白主要表達(dá)在骨髓細(xì)胞的溶酶體膜上?？勾笫?CD8 識(shí)別大鼠的CD8 細(xì)胞表面抗原，在T淋巴細(xì)胞、大多數(shù)胸腺細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析通過SPSS version 20.0軟件完成。

2結(jié)果

2.1移植肺的外觀和 HE染色、Masson染色

A1組大鼠移植肺外觀色澤紅潤(rùn)，肺組織彈性良好，肺組織切片鏡下見輕微單核細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯炎細(xì)胞；A2組大鼠移植肺外觀色澤較灰暗，肺組織膨脹較差，切片鏡下見大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，彌漫散在炎細(xì)胞；A3組大鼠移植肺外觀色澤較紅潤(rùn)，肺組織彈性較好肺組織切片鏡下見中度單核細(xì)胞浸潤(rùn)，可見散在炎細(xì)胞。B1組大鼠移植肺外觀色澤紅潤(rùn)，肺組織彈性良好，肺組織切片鏡下見輕微單核細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯炎細(xì)胞；B2組大鼠移植肺外觀色澤較灰暗，肺組織膨脹較差，切片鏡下見大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，彌漫散在炎細(xì)胞；B3組大鼠移植肺外觀色澤較紅潤(rùn)，肺組織彈性較好，肺組織切片鏡下見中度單核細(xì)胞浸潤(rùn)，可見散在炎細(xì)胞。

2.2肺纖維化程度評(píng)分

兩組大鼠中的亞組分析中，胃液組及中和胃液組大鼠的肺纖維程度評(píng)分均較鹽水組評(píng)分高(P<0.05)。胃液組大鼠纖維程度評(píng)分高于中和胃液組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組各亞組大鼠纖維化評(píng)分均高于A組大鼠相應(yīng)各亞組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1　Comparison between Two groups and subgroups

*Asterisk indicates both gastric juice subgroup score and neutralized gastric juice subgroup score are respectively higher significantly than normal saline subgroup accordingly.

2.3通過抗大鼠 CD68 和CD8單克隆抗體進(jìn)行免疫組化分析抗大鼠CD 68 識(shí)別長(zhǎng)度為100 kd的單鏈糖蛋白，該單鏈糖蛋白主要表達(dá)在骨髓細(xì)胞的溶酶體膜上?？勾笫?CD8 識(shí)別大鼠的CD8 細(xì)胞表面抗原，在T淋巴細(xì)胞、大多數(shù)胸腺細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表達(dá)。同系大鼠左肺移植在免疫組化分析中僅見到少量 CD68+或CD8+細(xì)胞，A1、A2和A3之間CD68+或CD8+細(xì)胞無明顯差別，提示與是否存在胃液返流無明顯關(guān)系。同時(shí)，免疫組化分析觀察到在異系大鼠左肺移植中存在顯著差別的CD8+和CD68+細(xì)胞表達(dá)，提示異系大鼠的免疫排斥反應(yīng)對(duì)移植肺的存活質(zhì)量存在顯著影響，并且胃液返流與大鼠免疫排斥之間存在協(xié)同作用。

3討論

肺移植是治療終末期肺病的最有效手段。但肺移植術(shù)后生存率落后于其它實(shí)體器官移植成活率。如何減少肺移植術(shù)后并發(fā)癥，提高肺移植預(yù)后一直是研究的重點(diǎn)，其中胃液返流在肺移植術(shù)后并發(fā)癥的作用方面引起了許多學(xué)者的注意[10，11]。

本實(shí)驗(yàn)所用的大鼠左肺移植的改良模型，可以增加實(shí)驗(yàn)效率及準(zhǔn)確率。對(duì)于有些以大型動(dòng)物為模型的實(shí)驗(yàn)單位，可以大大縮減成本，增加受試對(duì)象，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度及可信度。而且該動(dòng)物模型僅需一人就可以操作，減少了進(jìn)行大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的人員負(fù)擔(dān)。大鼠左肺移植模型為國(guó)外正在應(yīng)用的肺移植模型[7]，通過套管式顯微吻合技術(shù)，減少了傳統(tǒng)吻合操作扭轉(zhuǎn)、漏針滲血、血栓生成等可能，簡(jiǎn)化了操作，增加了模型成功率，同時(shí)也使增加受試對(duì)象及增加組別，使實(shí)驗(yàn)更趨慎密合理。同系異體移植模型及異系異體模型同期灌注，每天各做一個(gè)模型，同時(shí)手術(shù)，同時(shí)灌注，結(jié)束灌注后同時(shí)標(biāo)本檢測(cè)。容易掌握好實(shí)驗(yàn)條件的相同性，盡量避免了實(shí)驗(yàn)條件差別造成的影響，對(duì)于確認(rèn)或排除免疫因素的影響更為準(zhǔn)確。

本研究誘導(dǎo)出胃液對(duì)大鼠移植肺的損傷并且明確了胃液對(duì)大鼠移植肺損傷的機(jī)理。即胃液及中和胃液(胃蛋白酶)對(duì)移植肺組織存在明顯的損害，并且含胃酸及胃蛋白酶的胃液對(duì)移植肺組織的損傷更為嚴(yán)重。通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)異系大鼠的免疫排斥反應(yīng)對(duì)移植肺的存活質(zhì)量存在顯著影響，與國(guó)外的一些研究結(jié)果一致[7]。為肺移植術(shù)后食管胃返流治療進(jìn)一步提供依據(jù)，我國(guó)是人口大國(guó)，終末期肺病患者眾多，肺移植是唯一挽救他們的手段。隨著經(jīng)濟(jì)水平提升，接受肺移植的患者逐漸增多。肺移植術(shù)后肺功能的改善是肺移植發(fā)展的重要保障。對(duì)于有些剛剛接受肺移植這樣大手術(shù)創(chuàng)傷的病人，術(shù)后實(shí)行抗返流手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)很高，不能耐受抗返流手術(shù)的病人可嘗試抑酸和抑制胃蛋白的治療。同時(shí)也有可能減輕免疫反應(yīng)，有望減輕肺移植術(shù)后免疫抑制藥物應(yīng)用，從而減少經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)07-1061-03

作者簡(jiǎn)介：林風(fēng)武(1973-)，男，副教授，研究方向：胸部疾病微創(chuàng)治療及肺移植的臨床、基礎(chǔ)研究。

(收稿日期：2015-05-18)