HGF對(duì)AngII介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

王紅月，劉　麗，張　洋，顧春梅

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，吉林 長春130021)

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HGF對(duì)AngII介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

王紅月，劉麗，張洋，顧春梅*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，吉林 長春130021)

摘要：目的探討肝細(xì)胞生長因子(HGF)對(duì)血管緊張素II(AngII)介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(TEMT)的影響以及是否與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄激活子(STAT3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。方法體外培養(yǎng)人近曲小管上皮細(xì)胞并分為4組，即對(duì)照組，AngII(AngII:10-6mol/L)組，HGF(HGF:8 μg)組，AngII(AngII:10-6mol/L)+HGF(HGF:8 μg)組，用RT-PCR的方法檢測4組中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及β-actin的mRNA表達(dá),用Western方法檢測4組中P-STAT3及β-actin的蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，HGF組α-SMA mRNA表達(dá)減少,P-STAT3 蛋白表達(dá)下降，AngII組與之相反；與AngII 組比較，AngII+HGF組α-SMA mRNA表達(dá)減少，P-STAT3蛋白表達(dá)下降。結(jié)論HGF可抑制AngII介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，且此作用可能通過對(duì)STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制而達(dá)到的。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞生長因子；腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；血管緊張素II；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；STAT3信號(hào)通路

(ChinJLabDiagn,2016,20:1058)

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF),是一種重要的抗腎間質(zhì)纖維化因子，新近發(fā)現(xiàn)，HGF可通過腎小管上皮-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation,TEMT)而防止腎臟纖維化[1]。TEMT致其增殖能力加強(qiáng)，并產(chǎn)生大量間質(zhì)成分，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是判定是否存在TEMT的重要物質(zhì)。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)被認(rèn)為是重要的促進(jìn)TEMT因子，在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，血管緊張素II(AngII)也是很強(qiáng)的致TEMT因子[2]，且HGF抗TEMT作用可能與AngII相關(guān)[3]，Janus酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT3)信號(hào)途徑可發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白的雙重作用，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程并活化相應(yīng)靶基因，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。我們實(shí)驗(yàn)的目的是探討HGF是否抑制AngII介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，以及此作用是否與STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

1材料與方法

1．1腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)人近曲小管上皮細(xì)胞 (HK-2,Human kidney proximaltubular cells-2)購自中國生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫。HK-2細(xì)胞用含有10% RPMI-1640胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2分組以每孔1×103細(xì)胞接種于96孔板中，腎小管上皮細(xì)胞分4組：對(duì)照組，AngII 組，HGF組，AngII+HGF組。對(duì)照組只加腎小管上皮細(xì)胞，HGF及AngII組在細(xì)胞的基礎(chǔ)上分別加入HGF(8 μg)及AngII(AngII:10-6mol/L)，AngII+HGF組在細(xì)胞基礎(chǔ)上同時(shí)加HGF(8 μg)及AngII(AngII:10-6mol/L)。24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3α-SMA mRNA的表達(dá)采用RT-PCR法檢測,首先用Trizol法提取總RNA,鑒定，合成cDNA,計(jì)算RNA的濃度。PCR擴(kuò)增α-SMA基因，β-actin為內(nèi)參。α-SMA正義鏈 5′-ACTGGGACGACTAGGAAAAAG-3′，反義鏈 5′-CATCTCCAGAGTCCAGCACA -3′，退火溫度42°C，30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物240bp；β-actin正義鏈 5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC -3′，反義鏈 5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG -3′，退火溫度56℃，30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物552 bp。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用Phoretix ID凝膠圖像分析軟件測定電泳條帶的吸收度，用內(nèi)參校準(zhǔn)。

1.4用Western印記法檢測將細(xì)胞加入細(xì)胞裂解緩沖液，離心，提取總蛋白，測定蛋白含量電泳、移膜，封閉。 加入一抗、二抗室溫孵育1 h。晾干拍照。應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X線膠片上曝光、顯影和定影。測定α-SMA及P-STAT3蛋白表達(dá)條帶的灰度值，用β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算比值。

2結(jié)果

4組α-SMA的m-RNA表達(dá)圖譜見圖1A)，4組α-SMA的基因表達(dá)的光密度值標(biāo)準(zhǔn)化半定量分析見圖1B)?？梢钥闯?，與對(duì)照組相比，HGF組α-SMA表達(dá)下降(P<0.05)，AngII組α-SMA表達(dá)上調(diào)(P<0.01);與AngII組比較，AngII+HGF組α-SMA表達(dá)減少(P<0.05)。

注：A) 4組α-SMA的m-RNA表達(dá),B) 4組α-SMA的m-RNA表達(dá)光密度值標(biāo)準(zhǔn)化分析。*與對(duì)照組相比，P<0.05，**P<0.01；#與AngII組相比P<0.05。

圖14組α-SMA的m-RNA表達(dá)及光密度值標(biāo)準(zhǔn)化分析

4組P-STAT3的蛋白表達(dá)圖譜見圖2 A)，4組P-STAT3的蛋白表達(dá)的光密度值標(biāo)準(zhǔn)化半定量分析見圖2 B)?？梢钥闯觯c對(duì)照組相比，HGF組P-STAT3表達(dá)下降(P<0.01)，AngII組P-STAT3表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與AngII 組比較，AngII+HGF組P-STAT3表達(dá)減少(P<0.01)。

注：A) 4組P-STAT3蛋白表達(dá),B) 4組P-STAT3蛋白表達(dá)光密度值標(biāo)準(zhǔn)化分析。*與對(duì)照組相比，P<0.05；**P<0.01；##與AngII組相比P<0.01。

圖24組P-STAT3蛋白表達(dá)及光密度值標(biāo)準(zhǔn)化分析

3討論

近期的研究提示，腎間質(zhì)纖維化很大程度上是由于TEMT而引起的[4]，HGF有逆轉(zhuǎn)TEMT的作用[1]，但關(guān)于其機(jī)制目前尚不明確，可能與對(duì)TGF-β1的抑制有關(guān)，還有一些線索提示與AngII有關(guān)[3]。

JAK/STAT信號(hào)途徑介導(dǎo)多種細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等過程，P-STAT是STAT磷酸化形式，是有活性形式。其在糖尿病腎病、梗阻性腎病中起重要作用[5]。有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，AngII可以通過激活JAK2/STAT3通路進(jìn)一步上調(diào)TGF-β1、CTGF等細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)成分FN的表達(dá)，提示AngII可能通過激活JAK2/STAT3通路參與腎纖維化的發(fā)病過程[6]，我們?cè)谂囵B(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，就TEMT、AngII及HGF的關(guān)系進(jìn)一步研究，并探討STAT3信號(hào)通路是否參與HGF抗TEMT的過程。

我們的研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HGF組α-SMA的mRNA表達(dá)減少，AngII組α-SMA的mRNA表達(dá)增多，說明HGF可從基因水平上抑制腎小管上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，即可抑制TEMT，與既往研究結(jié)果一致。而AngII可促進(jìn)α-SMA的mRNA表達(dá)，促進(jìn)TEMT，兩者作用相反。與單獨(dú)應(yīng)用AngII對(duì)比，同時(shí)加入HGF和AngII時(shí)，α-SMA的mRNA表達(dá)減少，由此可推斷HGF抑制α-SMA的mRNA表達(dá)可能與對(duì)AngII的抑制有關(guān)。

在P-STAT的蛋白表達(dá)分析中，我們看四組中，與對(duì)照組相比，HGF組P-STAT的蛋白表達(dá)減少，AngII組P-STAT的蛋白表達(dá)增多，說明HGF可從蛋白水平上抑制P-STAT通路，且與AngII作用相反，與單獨(dú)應(yīng)用AngII對(duì)比，HGF和AngII組P-STAT蛋白表達(dá)減少，提示我們HGF抑制AngII介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，這種作用可能通過對(duì)P-STAT信號(hào)通路的抑制而達(dá)到的。下一步需要探索HGF與JNK-2等信號(hào)通路的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hong-yue Wang,Li-zhi Yang,Ming-ji Cui,et al.Hepatocyte growth factor-induced amelioration in chronic renal failure is associated with reduced expression of α-smooth muscle actin[J].Renal Failure,2012,34(7):862.

[2]Chen J,Chen JK,Harris RC.Angiotensin II induces epithelial -to to mesenchymal in renal epithelial cells through reactive oxygen species/Src/caveolin-mediated activation of an epidermal growth factor receptor-tracellular signal- regulated kinase signaling pathway[J].Mol Cell Biol,2012,32(5)981.

[3]Hong-yue Wang,Yan-jun Wang,Ming-ji Cui,et al.Hepatocyte growth factor-induced amelioration in renal interstitial fibrosis is associated with reduced expression of α-smooth muscle actin and transforming growth factor-β1[J].Indian Journal of Biochemistry & Biophysics,2011,48:308.

[4]Liu Y.New insight into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21:212.

[5]Pang M,Ma L,Gong R,et al.A novel STAT3 inhibitor,S3I-201,attenuates renal interstitial fibroblast activation and interstitial fibrosis in obstructive nephropathy[J].Kidney Int,2010,78(3):257.

[6]LI Yan-nong，F(xiàn)AN Qiu-ling，WANG Li-ning.Significance of JAK2/STAT3 in angiotensin II up-regulation of TGF-β1、CTGF and FN mRNA expression On mesangial cells under hyperglucose[J].J Nephrol Dialy Transplant,2009,18(1):44.

基金項(xiàng)目:吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部科研基金 (B007)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)07-1058-03

中圖分類號(hào)：Q816

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

(收稿日期：2015-03-20)

The Effects of Hepatocyte Growth Factor on Tubular Epithelial-myofibroblast Transdifferentiation That Angiotensin II Took Part In and The Associated Study About Signaling Pathway

WANGHong-yue，LIULi，ZHANGYang，etal.

(DepartmentofNephrology,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo inquire the effects of hepatocyte growth factor (HGF) on tubulapithelial-myofibroblast transdifferentiation (TEMT) that Angiotensin II (Ang II) took part in,and the associated study about STAT3 signaling pathway.MethodsHK-2 cells were cultured in RPMI-1640 medium containin,and the cells were divided into four groups:control，AngII(AngII:10-6mol/L) group，HGF(HGF:8 μg)group，AngII(AngII:10-6mol/L)+HGF(HGF:8 μg)group.α-smooth muscle actin (α-SMA)，and β-actin mRNA expressions were detected by RT-PCR,P-STAT3 and β-actin protein expressions were detected by Western.Resultsα-SMA mRNA expression was reduced and STAT3 protein expression were reduced in HGF group compared to control.But α-SMA mRNA expression,STAT3 protein expression were elevated in AngII group.α-SMA mRNA,STAT3 protein expression were all released in AngII+HGF group compared to AngII group.ConclusionHGF can restrain TEMT that Ang II took part in,and this effect maybe realized by inhibiting STAT3 signaling pathway.

Key words:Hepatocyte growth factor;Tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation;Angiotensin II;α- smooth muscle actin;STAT3 signaling pathway