北京地區(qū)市售牡蠣輪狀病毒污染調(diào)查

高志勇　嚴寒秋　劉白薇　霍達　李丹地　錢海坤　陳麗娟　王全意

100013 北京市疾病預(yù)防控制中心食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室(高志勇、嚴寒秋、劉白薇、霍達、錢海坤、陳麗娟、王全意); 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(李丹地)

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北京地區(qū)市售牡蠣輪狀病毒污染調(diào)查

高志勇嚴寒秋劉白薇霍達李丹地錢海坤陳麗娟王全意

100013 北京市疾病預(yù)防控制中心食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室(高志勇、嚴寒秋、劉白薇、霍達、錢海坤、陳麗娟、王全意); 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(李丹地)

【摘要】目的調(diào)查北京地區(qū)市售牡蠣輪狀病毒的污染狀況。 方法2014年2月至2015年3月，在北京市某大型水產(chǎn)品批發(fā)市場采集，每攤位采5只為一組，共56組280只牡蠣。用3種方法對樣品前處理：直接處理法、PEG 8 000沉淀法和蛋白酶K消化-PEG 8 000沉淀法。然后利用熒光RT-PCR檢測樣品的A組輪狀病毒核酸，采用半巢式反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法對A組輪狀病毒核酸陽性進行G、P基因分型。對陽性毒株的VP7和VP4基因進行擴增和測序, 采用Mega 6.06軟件構(gòu)建進化樹，建樹方法為最大似然法。結(jié)果直接處理法、PEG 8 000沉淀法和蛋白酶K消化-PEG 8 000沉淀法3種前處理方法A組輪狀病毒檢出率分別為3.57%(2/56)、7.14%(4/56)和5.38% (3/56)。56組樣品中8組A組輪狀病毒核酸檢測陽性，檢出率為14.29%，均在秋冬季檢出。輪狀病毒基因型組合型為G9/P[8](2株)和G9/P[N](6株)。3株輪狀病毒VP7基因和1株輪狀病毒VP4基因成功測序，進化分析顯示與近年來我國流行的G9/P[8]型毒株同源性最高。結(jié)論北京地區(qū)秋冬季市售部分牡蠣存在輪狀病毒污染，有引起食源性疾病的風(fēng)險。

【主題詞】牡蠣；A組輪狀病毒；半巢式RT-PCR；基因型

Fundprograms:BeijingMunicipalNaturalScienceFoundation(7132045)

A組輪狀病毒(GroupArotavirus,RVA)是引起全球5歲以下兒童重癥腹瀉的最主要病原體，2008年全球估計有45.3萬5歲以下兒童死于輪狀病毒腹瀉[1]。

輪狀病毒和諾如病毒是病毒性腹瀉的主要病原體，攝入污染的食物或水為主要傳播方式之一。已有多個國家和地區(qū)報告在牡蠣中檢出了諾如病毒，這證實了牡蠣是諾如病毒感染傳播的重要載體[2]。牡蠣屬于雙殼濾食性動物，一般在近海灘涂進行養(yǎng)殖，其在濾食過程需要過濾大量的海水，生產(chǎn)生活污水中含有的諾如病毒可被牡蠣特異性富集。牡蠣富集諾如病毒的機制可能為：其胃腸組織存在類似人類組織血型抗原(Histo-bloodgroupantigen，HBGA)的受體，可以與諾如病毒特異性結(jié)合[2]。最近研究認為HBGA亦是輪狀病毒的結(jié)合受體[3]。泰國、墨西哥等國已有在牡蠣中檢出輪狀病毒的報告[4-5]。目前我國有3篇文獻報告在牡蠣中檢出了輪狀病毒[6-8]，但并未對檢出的輪狀病毒進行型別鑒定和進化分析。

2014年2月至2015年3月，我們在北京市某大型水產(chǎn)品批發(fā)市場采集了市售鮮活帶殼牡蠣，調(diào)查A組輪狀病毒污染狀況，并分析其基因特征，為食用牡蠣的安全風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1．1樣品來源于2014年2月至2015年3月，每月不定期在北京市某大型水產(chǎn)品批發(fā)市場的4個攤位采集樣品，每個攤位采5只鮮活牡蠣為一組樣品，共56組280只，樣品采集后立即送檢。

1.2實驗室檢測

1.2.1樣品預(yù)處理:用無菌蒸餾水將牡蠣外表污泥清凈，打開牡蠣外殼后用無菌剪子和鑷子取消化腺組織(以腸腺組織和腸內(nèi)容物為主)，在無菌平皿中將每組樣品剪碎并混勻。每組樣品按參考文獻[9]采用3種方法進行前處理，方法1(M1)：直接處理法，方法2(M2)：PEG8 000沉淀法，方法3(M3)：蛋白酶K消化-PEG8 000沉淀法。

1.2.2病毒核酸提取和熒光定量PCR檢測:預(yù)處理后的所有樣品，用德國Qiagen公司(QIAampViralRNAMiniKit)病毒核酸提取試劑盒，按說明書進行病毒RNA的提取。用碩世生物科技有限公司輪狀病毒(A組)檢測試劑盒(熒光探針PCR法)，按說明書進行輪狀病毒(A組)RNA的檢測，Ct值≤39 且有典型的“S”形曲線判為陽性，否則陰性。3種不同前處理方法的每組樣品中，有任意一種熒光PCR法檢測結(jié)果陽性即判定樣品被輪狀病毒(A組)污染，同時記錄Ct值。

1.2.3A組輪狀病毒分型:對A組輪狀病毒熒光PCR陽性的, 采用半巢式RT-PCR方法進行輪狀病毒G、P分型，引物見文獻[10-12]。

1.2.4VP7和VP4基因擴增:采用輪狀病毒分型的第一輪分型引物分別對G/P分型第一輪產(chǎn)物進行再次擴增，反應(yīng)條件同分型第二輪擴增反應(yīng)。

1.3基因進化分析采用BioEdit(版本7.0.9.0)對序列進行編輯、比對。在GenBank中選擇參考株，采用MEGA軟件(版本 6.06)構(gòu)建進化樹，建樹方法選擇最大似然法(maximumlikelihoodmethod)，bootstrap值設(shè)置為1 000次。VP7基因建樹時核酸替代模型選擇Tamura3-parameter(T92)+G，VP4基因建樹時選擇T92+I。

2結(jié)果

2.13種前處理方法輪狀病毒熒光PCR結(jié)果56組樣品中：方法1輪狀病毒核酸陽性2件，檢出率3.57%；方法2陽性4件，檢出率7.14%；方法3陽性3件，檢出率5.38%。陽性標本Ct值結(jié)果在33.50～38.72之間，詳見表1。

2.2牡蠣中A組輪狀病毒檢出及時間分布56組樣品中8組A組輪狀病毒核酸檢測陽性，檢出率為14.29%(8/56)；根據(jù)我國的陽歷，3-5月為春季，6-8月為夏季，9-11月為秋季，12-次年2月為冬季，A組輪狀病毒主要在秋季和冬季檢出，檢出率分別為33.33%(4/12)和20.00%(4/20)，春夏季未檢出。見圖1。

表1　輪狀病毒陽性樣本Ct值和基因分型

圖1　輪狀病毒檢測陽性牡蠣的時間分布Fig.1　The time distribution of rotavirus-positive oysters

2.3A組輪狀病毒分型結(jié)果對輪狀病毒核酸陽性的8組標本進行A組輪狀病毒G和P基因型分型。G基因型分型均為G9；P基因型分型有P8和PN(P未分型)；GP分型合并分析有2個型別，2株G9/P[8]和6株G9/P[N]，見表1。

圖2　A組輪狀病毒VP7基因進化分析(842 bp) Fig.2　Phylogenetic analyses based on VP7 genes of group A rotaviruses(842 bp)

2.4序列分析結(jié)果8件核酸陽性標本中，3件VP7基因擴增陽性，1件VP4基因擴增陽性。3個VP7基因序列相似性為98.4%～99.4%。對G9型VP7基因構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示G9型VP7基因主要來自人和豬，至少可有10個分支，本研究中所得VP7基因序列位于第Ⅰ分支，與我國2011-2012年流行的人源輪狀病毒親緣性最高，見圖2。對P[8]型VP4基因構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示P[8]型VP4基因全部來自人，有3個分支，本研究中所得VP4基因序列屬于P[8]b亞型，該亞型近年來在我國及世界其他地區(qū)廣泛流行，見圖3。

圖3　A組輪狀病毒VP4基因進化分析(625 bp)Fig.3　Phylogenetic analyses based on VP4 genes of group A rotaviruses(625 bp)

3討論

本研究采集的56組樣品中有8組樣本A組輪狀病毒核酸檢測陽性，檢出率14.29%，與明紅霞等[8]的研究結(jié)果相近(約17.50%)，表明牡蠣受輪狀病毒污染較為嚴重。僅在秋季和冬季在牡蠣中檢出輪狀病毒，而我國秋冬季為A組輪狀病毒腹瀉的發(fā)病高峰[13,14]，兩者時間分布一致。A組輪狀病毒，依據(jù)VP7和VP4抗原性不同，將A組輪狀病毒分G和P血清型；依據(jù)VP7和VP4基因序列的不同將A組輪狀病毒分G和P基因型。A組輪狀病毒有27個G基因型和35個P基因型，目前全球主要基因型組合型別為G1/P[8]、G2/P[4]、G3/P[8]、G4/P[8]、G9/P[8][15]。自2011年以來，我國輪狀病毒優(yōu)勢基因型已由G3P[8]轉(zhuǎn)為G9P[8](中國疾病預(yù)防控中心內(nèi)部監(jiān)測報告)。本研究8組樣本A組輪狀病毒核酸G/P分型2個為G9P[8]，6個為G9P[N]，本研究檢測結(jié)果與我國病毒性腹瀉監(jiān)測結(jié)果相似[13,14]。但有6個樣本P基因未能分型，可能牡蠣中輪狀病毒含量較低，影響擴增；也可能本研究所用的分型方法沒有包括相應(yīng)型別，本研究所用的P基因分型引物只能分出P[4]、P[6]和P[8]～[11]共6個基因型。G9型VP7基因進化分析顯示本研究中所得VP7基因序列與我國2011-2012年流行的人輪狀病毒親緣性最高，VP4基因進化分析顯示本研究中所得VP7基因序列屬于P[8]b亞型，也是近年來我國優(yōu)勢型別。因而可初步推斷牡蠣中檢出的輪狀病毒和人間流行毒株一致，可能為生產(chǎn)和生活廢水污染所致。

研究還顯示3種不同的樣品前處理方法，檢出率不同，前處理方法2(PEG8 000沉淀法)和前處理方法3(蛋白酶K消化-PEG8 000沉淀法)檢出率較為接近，前處理方法1的檢出率較低。3種前處理方法共檢出8組A組輪狀病毒核酸陽性，其中有1組樣品為前處理方法2和方法3同時檢出，其型別均為G9/P[N]。所以為減輕工作量日常監(jiān)測可選用方法2或方法3。鑒于3種方法對于輪狀病毒的檢出有一定的互補性，建議在疫情暴發(fā)時，為提高疫情溯源的成功率，3種樣品前處理方法同時使用。本研究中用碩世生物科技有限公司輪狀病毒(A組)檢測試劑盒(熒光探針PCR法)，進行輪狀病毒(A組)RNA的檢測。說明書中結(jié)果判斷標準為Ct值≤38，線性呈標準的“S”形曲線判為陽性，否則為陰性。由于研究的標本為牡蠣海產(chǎn)品，標本中病毒載量低，因此本研究中將結(jié)果判斷標準定為Ct值≤39，且有典型的“S”形曲線判為陽性。對陽性核酸，采用半巢式RT-PCR，進行輪狀病毒基因分型，9件均為G9，這說明本研究使用的判定標準適用于牡蠣中輪狀病毒的檢測。

本研究顯示市售的牡蠣存在輪狀病毒污染，食用牡蠣時存在著輪狀病毒感染的風(fēng)險。應(yīng)加強相關(guān)健康宣教，食用牡蠣時應(yīng)徹底煮熟。

4參考文獻

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通信作者：嚴寒秋，Email：hqyan907@sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.011

基金項目：北京市自然科學(xué)基金項目(7132045)

(收稿日期：2015-12-10)

InvestigationofrotaviruscontaminationincommercialoystersinBeijing

Gao Zhiyong, Yan Hanqiu, Liu Baiwei, Huo Da, Li Dandi, Qian Haikun, Chen Lijuan, Wang Quanyi

Beijing Center for Disease Prevention and Control, Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing 100013, China(Gao ZY, Yan HQ,Liu BW,Huo D, Qian HK, ChenLJ,Wang QY);National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and prevention,Beijing 102206, China(Li DD) Corresponding author: Yan Hanqiu, Email: hqyan907@sina.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the rotavirus contamination in commercial oysters in Beijing. Methods Between February 2014 and March 2015, a total of 280 oysters were collected in a large aquatic market in Beijing, and 5 oysters per stall were collected and classified as one sample. The samples were processed using three kinds of methods: direct treatment, PEG (polyethylene glycol) 8 000 precipitation and proteinase K digestion-PEG 8 000 precipitation. Group A rotaviruses were detected by real time RT-PCR, and G/P genotyping was performed using the semi-nested RT-PCR. The VP7 and VP4 genes of positive samples were amplified, sequenced, and the phylogenetic tree was constructed using the maximum likelihood method with MEGA software (version 6.06). ResultsThe detection rates of group A rotaviruses of three methods (direct treatment, PEG 8 000 precipitation and proteinase K digestion-PEG 8 000 precipitation) were 3.57% (2/56), 7.14% (4/56) and 5.38% (3/56), respectively. Rotaviruses were detected in 8 oysters samples (14.29%), which were collected during autumn and winter. The G/P genotype combination included G9/P[8] (2 strains) and G9/P[N] (6 strains). The VP7 genes of 3 strains and the VP4 gene of one strain were sequenced successfully, and the phylogenetic analyses demonstrated that these strains had the highest similarity to those G9/P[8] strains prevailing in recent years in China. ConclusionGroup A rotaviruses were detected in some commercial oysters during autumn and winter in Beijing, indicating a risk of foodborne illness.

【Key words】Oyster; Group A rotavirus; Semi-nested RT-PCR; Genotype