皮卡佐劑狂犬病治療性疫苗對(duì)暴露后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體免疫記憶的效果

林海祥　徐葛林　吳杰　張守峰　扈榮良　李烈濤　劉芳　張師瑞　張譯

102600, 北京依生興業(yè)科技有限公司(林海祥、李烈濤、劉芳、張師瑞、張譯)；430207,武漢生物制品研究所(徐葛林、吳杰)；長春 130117，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所(張守峰、扈榮良)

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皮卡佐劑狂犬病治療性疫苗對(duì)暴露后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體免疫記憶的效果

林海祥徐葛林吳杰張守峰扈榮良李烈濤劉芳張師瑞張譯

102600, 北京依生興業(yè)科技有限公司(林海祥、李烈濤、劉芳、張師瑞、張譯)；430207,武漢生物制品研究所(徐葛林、吳杰)；長春 130117，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所(張守峰、扈榮良)

【摘要】目的檢測(cè)皮卡佐劑狂犬病疫苗對(duì)暴露后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫治療作用和對(duì)人的免疫記憶效果。方法模仿人體暴露后免疫，對(duì)小白鼠和Beagle犬進(jìn)行了先感染狂犬病毒野毒株病毒再用不同狂犬病滅活疫苗免疫，觀察保護(hù)效果；對(duì)犬咬傷志愿者用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫2.5年后分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾素免疫記憶細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果在法國巴斯德研究所、武漢生物制品研究所、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示在沒有聯(lián)合應(yīng)用抗狂犬病免疫球蛋白的情況下，國內(nèi)外市售人用狂犬病疫苗保護(hù)率為0%～30%，皮卡佐劑狂犬病疫苗保護(hù)率為70%～100%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有極其顯著的差異。暴露后志愿者用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫，2.5年后外周血單個(gè)核細(xì)胞仍能檢出顯著高的分泌IFN-γ細(xì)胞數(shù)量，顯示對(duì)人體免疫特別是細(xì)胞免疫記憶反應(yīng)良好。結(jié)論與市售狂犬病疫苗相比，皮卡佐劑狂犬病疫苗對(duì)暴露后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有顯著地 治療作用，在人體中用也具有良好的免疫記憶效果。

【主題詞】皮卡佐劑；狂犬病疫苗；免疫記憶；暴露后免疫

Fundprograms:MajorNewDrugDiscoveryProject(PICKCaRabiesVaccineforHumanUse: 2013ZⅩ09102034 )

皮卡佐劑是多種膜式識(shí)別受體(PRR)的配體，包括TLR3(Toll樣受體3)、NOD(細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡核苷酸域)蛋白家族、RIG-Ⅰ(RNA螺旋酶視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ)、MDA5(黑色瘤分化相關(guān)基因5)依賴dsRNA蛋白激酶等。皮卡佐劑疫苗與受體結(jié)合后活化非特異免疫，包括巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)干擾素、白細(xì)胞介素-2、-6、-12、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)產(chǎn)生共刺激因子CD40、CD80、CD86，促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞的提呈，活化T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖。皮卡佐劑不僅提高疫苗的免疫原性，更由于促進(jìn)干擾素、白細(xì)胞介素-2、-12的產(chǎn)生，使從主要產(chǎn)生體液免疫的預(yù)防性疫苗轉(zhuǎn)變成具有強(qiáng)烈細(xì)胞免疫的治療性疫苗[1-7]。本文是在上述研究基礎(chǔ)上模仿人體暴露后免疫對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物先外周皮下或肌肉感染狂犬病毒街毒，再用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫并與國內(nèi)外市售狂犬病疫苗從機(jī)體水平比較保護(hù)率。除此之外，我們還對(duì)狗咬傷志愿者接種皮卡佐劑狂犬病疫苗，2.5年后的外周血單個(gè)核細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量。這些試驗(yàn)都取得了明確的顯著的陽性結(jié)果。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：OF1小白鼠，4周齡。由法國巴斯德研究所提供。昆明種小白鼠：14～16g，清潔級(jí)，由武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Beagle犬：40只，購自北京瑪斯生物技術(shù)有限公司。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所按篩選無狂犬病免疫史，狂犬病中和抗體檢測(cè)陰性犬，試驗(yàn)前完成犬瘟熱和細(xì)小病毒疫苗免疫。

1.1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞：2002年本公司員工白XX、屈XX被犬咬傷后，主動(dòng)要求自愿用人用皮卡狂犬病純化疫苗(中檢所檢驗(yàn)合格后的人用皮卡狂犬病純化疫苗，由北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))全程五針免疫，2.5年后取外周血分離單個(gè)核細(xì)胞；另有健康者(2人)外周血分離單個(gè)核細(xì)胞比較，由中山醫(yī)科大學(xué)檢測(cè)。

1.1.3狂犬病毒野毒株：WRVS9147(RD9147)株：法國巴斯德研究所提供。從瘋狐貍中分離，經(jīng)成神經(jīng)瘤細(xì)胞傳代，檢測(cè)其核蛋白基因的核苷酸順序與原分離時(shí)相同，表明WRVS株的性質(zhì)并沒有因在細(xì)胞中傳代而改變。攻毒劑量為腦內(nèi)5×106LD50/只小鼠。CQ92株(批號(hào)20050207)武漢生物制品研究所基因工程室提供。該毒株1992年分離于重慶犬，后經(jīng)該室在小鼠腦中傳代制備，作為攻擊用毒株。通過基因序列分析，表明該毒株為我國狂犬病毒流行株，且屬于血清Ⅰ型。本試驗(yàn)病毒腦內(nèi)滴定為12589/0.03mlLD50，腹股溝皮下毒力為3.3/o.1mlLD50。BD06株：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供。2006年分離自河北保定的犬源街毒，經(jīng)全基因組序列測(cè)定為我國狂犬病流行株，為基因Ⅰ型。經(jīng)小鼠腦內(nèi)傳代5代以內(nèi)用于攻毒試驗(yàn)，攻毒劑量為腦內(nèi)16萬LD50(小鼠腦內(nèi))。

1.1.4用于小白鼠試驗(yàn)的狂犬病疫苗：滅活純化狂犬病疫苗(InactivatedandPurifiedRabiesVirus：IPRV)，法國巴斯德研究所提供。用PV狂犬病毒株經(jīng)BHK-21細(xì)胞傳代，病毒收獲后經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活和純化后的實(shí)驗(yàn)用疫苗。皮卡IPRV：將皮卡佐劑與不同濃度的IPRV復(fù)合。市售法國維爾博狂犬病疫苗(批號(hào)X0081-1，生產(chǎn)日期20030123，有效期200512)。市售福爾博人用狂犬病純化疫苗福爾博(簡稱國產(chǎn)苗)(批號(hào)2004110810，生產(chǎn)日期20041202，效期200512)。人用皮卡狂犬病純化疫苗由北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供。

用于犬試驗(yàn)的人用皮卡狂犬病疫苗由遼寧依生生物制藥有限公司提供；市售諾華人用狂犬病疫苗由軍事醫(yī)學(xué)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所直接聯(lián)系長春市疾病預(yù)防控制中心購買。

用于人免疫記憶試驗(yàn)的狂犬病純化疫苗抗原由大連高新生物制藥有限公司提供；皮卡佐劑和皮卡狂犬病疫苗由北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司及遼寧依生生物制藥有限公司提供。

1.2方法

1.2.1第一項(xiàng)試驗(yàn)：在法國巴斯德研究所完成(1992年)。取OF1小鼠，每組小鼠先用野毒W(wǎng)RVS9147腹股溝皮下感染小白鼠，0.1ml/只，攻毒劑量為腦內(nèi)5×106LD50/只小鼠(確保80%以上小白鼠致死的攻擊病毒量)，于感染后0d、3d、7d、10d和14d在相同部位分別注射不同抗原量(140ng和 560ng)的疫苗(狂犬病純化疫苗、皮卡佐劑狂苗及鋁佐劑狂苗)0.1ml/只，同時(shí)設(shè)PBS、皮卡佐劑、鋁佐劑對(duì)照組。連續(xù)28d觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.2第二項(xiàng)試驗(yàn)：在武漢生物制品研究所完成(2005年)。取清潔級(jí)昆明小鼠80只，分為4組，每組20只。用街毒株CQ92(批號(hào)20050207)腹股溝皮下感染小白鼠，本試驗(yàn)病毒腦內(nèi)滴定為12589/0.03mlLD50，腹股溝皮下毒力為3.3/o.1mlLD50。感染后0d、3d、6d、9d，分別用皮卡狂苗、福爾博狂苗、維爾博狂苗同部位免疫0.06ml/只，病毒對(duì)照組注射PBS。連續(xù)21d觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3第三項(xiàng)試驗(yàn)：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所(2013年)?？袢≈泻涂贵w陰性的Beagle犬30只，均分為三組，每組10只。試驗(yàn)前右側(cè)腮部剃毛，以顯露皮膚及咬肌輪廓。16萬icLD50狂犬病病毒(1ml)注射于Beagle犬右側(cè)腮部肌肉；攻毒后2h、3d、7d、14d、21d后于注射部位分別注射PBS、人用諾華狂犬病疫苗、皮卡狂犬病疫苗。

上述各組動(dòng)物觀察45d，3d內(nèi)死亡為非特異性死亡，第4天以后逐天記錄各組狗發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)，發(fā)病和死亡時(shí)間，第45天記錄各組狗總死亡數(shù)和存活數(shù)。試驗(yàn)前后測(cè)量狗的體重。對(duì)死亡和存活動(dòng)物進(jìn)行腦組織狂犬病免疫熒光檢測(cè)，確定是否感染狂犬病毒。

1.2.4第四項(xiàng)試驗(yàn)：在北京泛華協(xié)和醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司，志愿者用皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫，取用皮卡狂犬病純化疫苗免疫2.5年后志愿者和未經(jīng)皮卡狂犬病疫苗健康者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。分別用1.45和14.5μɡ狂犬病純化疫苗抗原刺激24h，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量.。

2結(jié)果

2.1第一項(xiàng)試驗(yàn)如表1所示，在病毒對(duì)照小白鼠95%死亡下，單純IPRV保護(hù)率很差，死亡率達(dá)70%～95%；單純皮卡佐劑就使死亡率降至30%，隨著IPRV與皮卡復(fù)合的IPRV量的增加死亡率可降至0；IPRV加鋁佐劑沒有任何效果。

2.2第二項(xiàng)試驗(yàn)兩次皮卡狂犬病疫苗和不同市售狂犬病疫苗對(duì)暴露后小白鼠的保護(hù)率的比較結(jié)果見表2。統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)定表明皮卡狂犬病疫苗和不同市售狂犬病疫苗比較具有極其顯著的治療效果(P<0.01-0.001)。

2.3第三項(xiàng)試驗(yàn)在病毒對(duì)照組犬100%死亡情況下，皮卡狂犬病滅活疫苗產(chǎn)生70%保護(hù)作用，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)定，與病毒對(duì)照組比較具有極其顯著差異，而諾華制藥的狂犬病疫苗僅提供30%的保護(hù)作用，與病毒對(duì)照組比較差異不顯著(表3)。

表1　皮卡和鋁佐劑對(duì)感染狂犬病毒野毒株WRVS 9147小白鼠的治療效果

* 死亡小鼠數(shù)/注射小鼠數(shù)

Numbersdiedmice/Numbersinjectedmice

表2　不同疫苗對(duì)暴露狂犬病街毒后小白鼠的保護(hù)試驗(yàn)

x2皮卡苗與PBS對(duì)照=14.44P<0.001 x2皮卡苗與法國維爾博苗=16.9P<0.001 x2皮卡苗與國產(chǎn)狂犬病鋁苗=10.23P<0.01

Note:Numbersdiedmice/Numbersinjectedmiceandthenumbersweremeansofmicein2experiments,PICKCavaccinevscontrolFrendvaccine,ChineseFurbovaccine

2.4第四項(xiàng)試驗(yàn)皮卡狂犬病疫苗免疫志愿者2.5年后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量。與未注射狂犬病疫苗正常人比較經(jīng)相應(yīng)抗原刺激后分泌IFN-γ細(xì)胞數(shù)顯著增加。表明皮卡狂犬病疫苗對(duì)人體也有很好的免疫反應(yīng)(圖1)。

3討論

3.1關(guān)于NIH狂犬病疫苗效力測(cè)定方法當(dāng)前通用的狂犬病疫苗效力測(cè)定方法是1953年由美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)建立的，該方法以不同稀釋度疫苗0、7d腹腔免疫小白鼠兩次，第14天用5～50腦內(nèi)LD50CVS病毒腦內(nèi)攻擊，再觀察14d，以死亡率與疫苗參考品比較，≥2.5IU/每劑為合格。該方法存在明顯不合理處：(1)攻擊病毒CVS是腦內(nèi)固定毒，不是流行區(qū)的野毒或街毒。(2)腦內(nèi)攻擊途徑非自然感染途徑(3)更重要的是NIH狂犬病疫苗效力測(cè)定方法是暴露前免疫，而人是暴露后免疫，這是兩種性質(zhì)完全不同的免疫，這是預(yù)防性疫苗檢測(cè)方法，不適合用于暴露后免疫。當(dāng)前批簽發(fā)檢定合格的疫苗不是一定有效的疫苗[8]。

表3　皮卡苗和諾華狂犬病純化疫苗對(duì)暴露狂犬病街毒后的比格犬保護(hù)效果

圖1　皮卡佐劑狂犬病疫苗免疫志愿者2.5年查外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ SPF數(shù)量Fig.1　IFN-γSPF in PBMCs of volunteers immunized with rabies vaccine using PICKCa adjvant

3.2關(guān)于WHO和國家藥典對(duì)暴露后狂犬病防治方案正是由于當(dāng)前通用狂犬病疫苗效力測(cè)定方法不合理以及大量狂犬病疫苗免疫失敗病例，WHO和國家藥典[9]都明確規(guī)定對(duì)3度咬傷即被咬出血患者除清洗傷口外應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用抗狂犬病毒免疫球蛋白和疫苗，而不能僅注射疫苗。然而由于馬抗狂犬病免疫球蛋白過敏反應(yīng)嚴(yán)重，人抗狂犬病免疫球蛋白價(jià)格昂貴，供不應(yīng)求，只有7%～10%的患者使用抗狂犬病免疫球蛋白[10]，至今使我國每年仍有上千狂犬病死亡病例！

3.3關(guān)于皮卡狂犬病疫苗的意義我們經(jīng)過30年的研究積累了大量試驗(yàn)資料，明確了皮卡佐劑及其疫苗作用機(jī)理，皮卡狂犬病疫苗不僅促進(jìn)體液免疫也能誘發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫而具有治療作用。對(duì)小白鼠和狗先行皮下或肌肉感染狂犬病野毒株病毒，再用狂犬病疫苗免疫治療結(jié)果是法國維爾博狂犬病疫苗和國產(chǎn)鋁佐劑狂犬病純化疫苗對(duì)暴露后小白鼠的保護(hù)率為0，人用皮卡狂犬病純化疫苗的保護(hù)率為75%。表明皮卡狂犬病純化疫苗能顯著地降低感染狂犬病野毒株小白鼠死亡率，明顯地優(yōu)于法國維爾博狂犬病疫苗和國產(chǎn)鋁佐劑狂犬病純化疫苗(P<0.001)，特別應(yīng)引起注意的是在人體檢測(cè)中皮卡狂犬病純化疫苗也有良好的免疫記憶反應(yīng)，使分泌IFN-γ細(xì)胞數(shù)顯著增多。同時(shí)，皮卡狂犬病疫苗也是安全的[11]，用于暴露后3度咬傷患者較現(xiàn)行國內(nèi)外無佐劑狂犬病疫苗有著根本的優(yōu)越性。

4參考文獻(xiàn)

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通信作者：林海祥，Email: haixianglin510@sina.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.010

基金項(xiàng)目：重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(人用皮卡狂犬病疫苗：2013ZⅩ09102034)

(收稿日期：2016-01-08)

TheeffectstreatedwithPICKCarabiesvaccinetomiceandbeagledogsinfectedrabieswildvirusesandvolunteersimmunizedwithPICKCarabiesvaccine

Lin Haixiang，Xu Gelin，Wu Jie，Zhang Shoufeng，Hu Rongliang，Li Lietao，Liu Fang，Zhang Shirui，Zhang Yi

Beijing Yisheng Xingye Bio-tech Co.,Ltd, Beijing 102600,China(Lin HX, Li LT,Liu F,Zhang SR, Zhang Y); Wuhan Institute of biological products, Wuhan 430207China(Xu GL, Wu J); Institute of Military Veterinary, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130117, China(Zhang SF, Hu RL).Corresponding author:Lin Haixiang, Email:haixianglin510@sina.com

【Abstract】ObjectiveTo test the immune therapeutic effects of PICKCa adjuvant rabies vaccine for the post-exposure mice and beagle dogs and immune memory effect for human. MethodsFor the mice and beagle dogs first to infect with rabies wild virus and then immunize with PICKCa rabies vaccine.For volunteers, first to immunize with PICKCa rabies vaccine after 2.5 years to take peripheral blood mononuclear cell and then to check cells secreted interferon-? with flow cytometry. ResultsIn 3 independent assays of post-explosure immunization of mice and beagle dogs PICKCa rabies vaccine were much better then commercial adjuvant-free rabies vaccines, the protective rate from 20%-30% to 70%-100% Also, in the assay of cells secreted IFN-γ by peripheral blood mononuclear cells from volunteers immunized by PICKCa rabies vaccine the IFN-γ cell levels were much higher than control. ConclusionsCompared with commercial adjuvant-free rabies vaccines the PICKCa rabies vaccine had significant immune therapeutic effects in the mice and dogs. Also PICKCa rabies vaccine had good immune memory effect in human.

【Key words】PICKCa adjuvant; Rabies vaccines; Immune memory; Post exposure immunity