云南庫(kù)蠓中版納病毒的首次分離及鑒定

寇美玲　朱建波　楊恒　肖雷　王金萍　苗海生　王靜林　李華春

650224 昆明，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

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·論著·

云南庫(kù)蠓中版納病毒的首次分離及鑒定

寇美玲朱建波楊恒肖雷王金萍苗海生王靜林李華春

650224 昆明，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

【摘要】目的了解云南庫(kù)蠓攜帶病毒及感染情況。方法2011年9月-11月在云南曲靖市采集庫(kù)蠓、牛血清及豬血清標(biāo)本；庫(kù)蠓上清液接種于C6/36細(xì)胞進(jìn)行病毒分離；對(duì)可疑分離物進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；采用微量中和試驗(yàn)檢測(cè)牛、豬血清病毒抗體。結(jié)果捕獲到的18 160只庫(kù)蠓中，短跗庫(kù)蠓8 300只(45.7%)，琉球庫(kù)蠓7 100只(39.1%)。分離到2株陽(yáng)性分離物，命名為SC093和SC233。經(jīng)鑒定，其VP2、VP4、VP8序列與版納病毒中國(guó)株(AF134526)核苷酸序列同源性為99.0%，屬于版納病毒；1份牛血清與SC093和SC233病毒株中和抗體滴度分別為160和40,陽(yáng)性率為0.5%(1/200)；10份豬血清與SC093和SC233病毒中和滴度分別為80-320和20-80,陽(yáng)性率為1.7%(10/535)。結(jié)論所分離的SC093和SC233病毒株經(jīng)鑒定為版納病毒，并能引起豬和牛的感染，這是首次從庫(kù)蠓中分離到版納病毒。

【主題詞】庫(kù)蠓；版納病毒；分離；鑒定

Fund programs: Important cattle and sheep arbovirus disease prevention and control key technology research and application(201303035); Applied basic research projects of the youth science fund in Yunnan province(2015FD064)

云南省曲靖市師宗縣氣候溫和，立體氣候明顯，年平均相對(duì)濕度在80%左右，適合各類(lèi)吸血節(jié)肢動(dòng)物生存繁殖，利于蠓媒病毒的存在和傳播。1979年，我國(guó)首次在云南省師宗縣分離到藍(lán)舌病病毒[1]。近年來(lái)，一些蠓媒病毒在世界各地動(dòng)物中引起嚴(yán)重的傳染病，甚至導(dǎo)致大量動(dòng)物的死亡以及巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為日益嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題。為了進(jìn)一步了解師宗縣庫(kù)蠓種類(lèi)、攜帶病毒和當(dāng)?shù)貏?dòng)物感染情況，我們于2011年9月-11月在師宗縣監(jiān)控牛場(chǎng)采集庫(kù)蠓標(biāo)本、牛血清標(biāo)本,以及在麒麟?yún)^(qū)及陸良縣采集豬血清標(biāo)本，進(jìn)行蠓傳蟲(chóng)媒病毒分類(lèi)鑒定及其動(dòng)物感染調(diào)查，結(jié)果如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1雞胚、細(xì)胞及培養(yǎng)基:10日齡雞胚購(gòu)至小哨雞場(chǎng)；金黃地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、白紋伊蚊卵細(xì)胞(C6/36)為本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞用培養(yǎng)基M199、MEM 為云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行配制。1.1.2試劑及儀器:混合酶-DNase購(gòu)自Ambion公司，Benzonase購(gòu)自Novagen公司，RNase購(gòu)自美國(guó)Promega公司；核酸提取試劑盒Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0及Klenow Fragment試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；cDNA合成試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自日本TaKaRa公司；SuperScript II購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；pGem T-easyX載體購(gòu)自Invitrogen公司；引物K-8N(GACCATCTAGCGACCTCCACNNNNN)及引物K(GACCATCTAGCGACCTCCAC)由上海生物工程公司合成；PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；310DNA測(cè)序儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.2標(biāo)本采集

1.2.1庫(kù)蠓標(biāo)本采集:2011年9月—11月，夜間23：00-06：00，共采集庫(kù)蠓標(biāo)本12次。在云南省曲靖市師宗縣藍(lán)舌病監(jiān)控牛場(chǎng)用改裝的捕蚊器捕捉庫(kù)蠓，次日清晨把蚊籠放入-20℃冰箱20 min，根據(jù)庫(kù)蠓形態(tài)學(xué)特征[2]在顯微鏡下進(jìn)行分類(lèi)鑒定，40～50只/組放入凍存管中，編號(hào)登記，迅速凍存于液氮罐中。1.2.2動(dòng)物血清標(biāo)本采集:2011年8月—11月，在云南省曲靖市師宗縣藍(lán)舌病監(jiān)控牛場(chǎng)采集牛全血，在曲靖麒麟?yún)^(qū)及陸良縣豬場(chǎng)采集豬全血，取血后37℃讓血液凝固 1 到 2 h(不加抗凝劑)；4℃ 冰箱過(guò)夜；當(dāng)血清自然析出后，4℃離心3 000 r/min 10 min，將血清移至另一干凈試管，分裝成小份，編號(hào)儲(chǔ)藏在-80℃。

1.3蠓標(biāo)本處理、病毒分離和鑒定

1.3.1庫(kù)蠓標(biāo)本處理和病毒分離:從液氮罐中取出庫(kù)蠓凍存管，將庫(kù)蠓標(biāo)本對(duì)應(yīng)編號(hào)放入潔凈1.5 ml離心管中，用無(wú)血清液Eagle(含1%雙抗、1%谷氨酰胺) 清洗庫(kù)蠓標(biāo)本2次，1 500 r/min離心10 min，棄上清。置庫(kù)蠓于研缽，加入2 ml M199細(xì)胞維持液研磨成勻漿，4℃ 12 000 r/min離心20 min，取上清液100 μl接種至長(zhǎng)成70%～80%單層的C6/36細(xì)胞試管，25℃吸附1 h后棄去細(xì)胞管內(nèi)液體，加入2 ml含2%小牛血清的細(xì)胞維持液，設(shè)置2支正常細(xì)胞對(duì)照管，共同置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察CPE變化情況。舍棄連續(xù)盲傳三代后仍不出現(xiàn)CPE的細(xì)胞管，出現(xiàn)CPE的細(xì)胞管連續(xù)傳代使之出現(xiàn)規(guī)律病變，再傳一代擴(kuò)增病毒分裝-85℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病毒鑒定

1.3.2.1病毒液的處理及核酸的提取:向出現(xiàn)規(guī)律CPE后的1代細(xì)胞上清中加入混合酶，處理外源核酸[3]。按核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒總核酸。

1.3.2.2cDNA合成及RT-PCR 利用cDNA合成試劑盒，引物K-8N[4]等合成cDNA第一鏈。取5 μl模板，采用引物 K進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μl，依次加入下列試劑，使最終濃度達(dá)到5 mmol/L MgCl2、 0.2 mmol/L dNRPs、1×PCR Gold buffer、 0.8 mmol/L primer K、0.8 μmol/L引物 K及0.94U AmpliTaq Gold，充分混勻。95℃預(yù)變性5 min;95℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，33個(gè)循環(huán);72℃ 7 min。1%瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增條帶?；厥沾笥?00 bp片段PCR產(chǎn)物，克隆入載體,本實(shí)驗(yàn)室測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，將序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，MEGA 3.1 軟件采用Neighbour-joining (NJ) 方法的進(jìn)化樹(shù)繪制，Bootstrap值為1 000。

1.4雞胚感染實(shí)驗(yàn)取0.1 ml出現(xiàn)規(guī)律CPE后1代細(xì)胞上清，靜脈接種雞胚，逐日觀察，48 h內(nèi)死亡的雞胚為非特異性死亡，48 h后死亡雞胚按第1天算起，登記死亡天數(shù)，并將死胚放于4℃冰箱內(nèi)保存，待收胚全部完畢，剪破殼膜、尿囊膜、羊膜，取出胚體觀察記錄。

A：C6/36細(xì)胞對(duì)照(C6/36 Cell Control)B：接種SC093的C6/36細(xì)胞(SC093 4d Post-Infection)C：SC233感染后的C6/36細(xì)胞(SC233 4d Post-Infection)圖1　云南省師宗縣庫(kù)蠓分離物SC093和SC233對(duì)C6/36 細(xì)胞的致病變作用Fig.1　CPE caused by Culicoides isolates from Shizong County of Yunnan province on C6/36 cells

1.5微量中和試驗(yàn)血清中抽出535份豬血清、200份牛血清，按Karber方法計(jì)算出TCID50/50 μl[5], 參照國(guó)標(biāo)《藍(lán)舌病微量血清中和試驗(yàn)及病毒分離和鑒定方法》(GB/T180089-2000)方法進(jìn)行[6]。

2結(jié)果

2.1標(biāo)本采集2011年9月-11月云南省曲靖市師宗縣藍(lán)舌病監(jiān)控牛場(chǎng)共采集到庫(kù)蠓18 160只，經(jīng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)鑒定，短跗庫(kù)蠓有8 300只，琉球庫(kù)蠓有7 100只，分別占采集庫(kù)蠓標(biāo)本總數(shù)的45.7%和39.1%，提示這兩種庫(kù)蠓為該地優(yōu)勢(shì)蠓種，還有少數(shù)東方庫(kù)蠓、連斑庫(kù)蠓、荒川庫(kù)蠓等。

2.2病毒分離采集到的所有蠓標(biāo)本分454批處理，離心上清接種C6/36細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，獲得2株可疑分離物SC093和SC233，這兩株可疑分離物在C6/36細(xì)胞上產(chǎn)生規(guī)律細(xì)胞病變，病變時(shí)間分別是4～5 d、2～3 d，細(xì)胞病變特點(diǎn)主要表現(xiàn)為聚集、破碎、脫落(圖1)；在BHK-21細(xì)胞上不產(chǎn)生細(xì)胞病變。

2.3病毒分子生物學(xué)鑒定采用隨機(jī)RT-PCR對(duì)兩株可疑分離物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)彌散條帶。切膠純化大于500 bp片段的PCR產(chǎn)物，克隆入pGem T-easyX載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后隨機(jī)選取SC093、SC233各6個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)獲得序列進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SC233株病毒6個(gè)克隆中有5個(gè)[VP2基因3個(gè)(719 nt，754 nt,693 nt)、VP8(457 nt)和VP4(625 nt)基因各1個(gè)]，SC093株病毒有1個(gè)[VP2基因(745 nt)]克隆序列與版納病毒核苷酸序列的同源性在81%(EU265684)-99%(AF134528)之間。進(jìn)一步對(duì)SC093和SC233兩株新病毒VP2基因部分序列(2301-2900)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩株新分離病毒核苷酸同源性為100%；新分離的2 株病毒與東南亞雙鏈RNA病毒屬病毒繪制基因遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示：2 株新分離病毒與8株版納病毒處于同一個(gè)進(jìn)化分支，提示云南師宗縣2株可疑分離物SC093和SC233為版納病毒(見(jiàn)圖2)。

圖2　云南省師宗縣新分離病毒株SC093和SC233 VP2基因(2 301-2 900)600 nt核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree based on 600 nt of the VP2 (2 301-2 900) of SC093 and SC233 viruses isolated from Shizong County of Yunnan Province, China Abbreviations are as follows: BAV: Banna virus；KDV: Kappdio virus; LNV: Liaoning virus.

2.4病毒對(duì)雞胚的感染性將SC093和SC233兩株病毒分別接種10日齡雞胚7枚，兩毒株分別在接種雞胚后計(jì)算天數(shù)的第4天、第6天收胚。收胚后觀察到：雞胚全身性出血(圖3)，提示兩株新分離版納病毒對(duì)雞胚有致病性。

A：SC233毒株接種雞胚4天后出血情況; B：SC093毒株接種雞胚6天后出血情況； C：對(duì)照組接種M199 9天后A: 4 days after inoculated with SC233 virus；B: 6 days after inoculated with SC093 virus；C: 6 days after inoculated with M199圖3　云南師宗縣兩株新分離版納病毒SC093和SC233感染雞胚結(jié)果Fig.3　Hemorrhages of chicken embryo inoculated with Banna virus

2.3動(dòng)物血清檢測(cè)結(jié)果在曲靖市麒麟?yún)^(qū)、陸良等牛場(chǎng)和豬場(chǎng)共采集到牛血清200份、豬血清535份，對(duì)這些血清樣本進(jìn)行微量中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新分離版納病毒中和抗體，結(jié)果顯示牛血清版納病毒抗體陽(yáng)性1份，陽(yáng)性率為0.5%；曲靖市麒麟?yún)^(qū)豬場(chǎng)采集豬血清版納病毒抗體陽(yáng)性8份，陸良縣豬場(chǎng)采集豬血清版納病毒抗體陽(yáng)性2份，兩地豬場(chǎng)豬血清陽(yáng)性率為1.7%；檢測(cè)陽(yáng)性牛血清標(biāo)本抗SC093和SC233病毒中和抗體滴度分別為160和40；豬血清標(biāo)本抗 SC093和SC233病毒中和抗體滴度為80-320、20-80。

3討論

1987 年，版納病毒首次從中國(guó)云南西雙版納的腦炎患者中分離到[6]。隨后在當(dāng)?shù)夭幻髟虬l(fā)熱患者和腦炎患者血清標(biāo)本、蚊蟲(chóng)、豬和牛標(biāo)本內(nèi)分離到數(shù)十株版納病毒[6,7]。近年來(lái)在我國(guó)多個(gè)省區(qū)以及在越南、印度尼西亞等東南亞國(guó)家蚊蟲(chóng)中也多次分離到該類(lèi)病毒[8,9]。本研究從師宗庫(kù)蠓中分離到2株僅在C6/36細(xì)胞上產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變的病毒，通過(guò)進(jìn)一步的分子生物鑒定，獲得3個(gè)基因片段6條序列，這些片段序列均與版納病毒中國(guó)分離株同源性最高達(dá)到99%，遺傳進(jìn)化結(jié)果也顯示本次新分離的2株病毒與版納病毒處于同一個(gè)進(jìn)化分支，表明它們親緣關(guān)系較為密切，提示云南師宗縣2株新分離病毒SC093和SC233為版納病毒，這是首次從云南省庫(kù)蠓中分離到版納病毒，庫(kù)蠓究竟是偶然感染版納病毒還是可作為版納病毒的傳播媒介，尚需進(jìn)一步研究。2株病毒是通過(guò)隨機(jī)引物擴(kuò)增克隆鑒定為版納病毒，對(duì)該病毒的進(jìn)一步研究需要設(shè)計(jì)其特異性引物，說(shuō)明分節(jié)段版納病毒的帶型,擴(kuò)增全基因序列等等。庫(kù)蠓樣品的鑒定過(guò)程主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行，對(duì)樣品的采集及保存就需要較高的要求，下一步需要尋求更有效可靠的方法進(jìn)行種屬鑒定。

版納病毒為東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬(Seadomavirus)的病毒，該屬病毒目前包括三種病毒，版納病毒(Banna virus，BAV)、Kadipiro病毒(KDV)和遼寧病毒(Liaoning virus，LNV)，其PAGE 電泳帶型為12 條帶，具有12 條帶的病毒還有在歐洲和美洲科羅拉多蜱媒熱病毒(Colorado Tick Fever Virus，CTFV)，該病毒能引起人類(lèi)嚴(yán)重腦炎[10]。版納病毒是該屬病毒中惟一一種從人的血清標(biāo)本中分離并與人的發(fā)熱和腦炎有關(guān)的病毒，感染BAV的患者顯示出流感樣癥狀，疲乏、關(guān)節(jié)痛、發(fā)熱，嚴(yán)重者可引起腦炎[11,12]。本次從云南省師宗縣庫(kù)蠓中分離到版納病毒，該病毒能引起雞胚全身性出血，提示兩株新分離版納病毒對(duì)雞胚有致病性。同時(shí)在當(dāng)?shù)夭杉Ｑ搴拓i血清中存在版納病毒中和抗體，抗體滴度高達(dá)1:320，提示在當(dāng)?shù)嘏：拓i等家畜動(dòng)物中存在著版納病毒感染的狀況，約454組庫(kù)蠓樣品中僅分離到2株版納病毒，分離率為0.44%，豬、牛血清版納病毒抗體陽(yáng)性率分別為1.7%、0.5%，提示二者之間存在感染相關(guān)性，而版納病毒是否是引起當(dāng)?shù)丶倚蟛幻髟騽?dòng)物疾病的病原體，還需要對(duì)其致病性、流行病學(xué)等方面進(jìn)行更深入的調(diào)查研究[13，14]。

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通信作者：李華春，Email: li_huachun@hotmail.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.02546450.2016.01.001

基金項(xiàng)目：重要牛羊蟲(chóng)媒病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用(201303035);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目青年基金(2015FD064)

(收稿日期：2015-06-02)

First isolation and identification of Banna virus fromCulicoidespools in Yunnan

KouMeiling，ZhuJianbo，YangHeng，XiaoLei，WangJinping，MiaoHaisheng，WangJinglin，LiHuachun

YunnanAnimalScienceandVeterinaryInstitute,YunnanTropicalandSubtropicalAnimalVirusDiseaseLaboratory,Kunming650224,ChinaCorrespondingauthor:LiHuachun,Email:li_huachun@hotmail.com

【Abstract】ObjectiveTo understand the virus-carrying status and infection condition of Culicoides in Yunnan province. MethodsCulicoides, cattle serum samples and pig serum samples were collected in Qujing City in Yunnan province from Sep. to Nov. in 2011; the supernatant of Culicoides was inoculated in C6/36 cells to isolate virus. Suspected isolates were identified by molecular biology techniques and titers of virus antibodies in pigs and cattles serum samples were tested by VN. Results8 300 short tarsal Culicoides(8 300/18 160) and 7 100 Ryukyu Culicoides (7 100/18 160) were identified among 18 160 Culicoides specimens. Two suspected virus strains were isolated and designated as SC093 and SC233. The nucleotide sequence homology of VP2, VP4 and VP8 sequences with Banna virus Chinese strain (Accession number: AF134526) is up to 99%. 1 out of 200(1/200) cattle serum samples was antibody positive against Banna virus with 0.5% positive rate. And the neutralizing antibody titers of SC093 and SC233 with above Banna virus antibody positive cattle serum were 160 and 40.10 out of 535(10/535) pig serum samples were antibody positive against Banna virus with 1.7% positive rate. And the neutralizing antibody titers of SC093 and SC233 with above Banna virus antibody positive pig serum samples were 80-320 and 20-80 respectively. ConclusionsThe SC093 and SC233 virus strains isolated from Shizong were identified to be Banna virus and it could cause infection in pigs and cattles. This is the first report that Banna virus was isolated from Culicoides.

【Key words】Culicoides; Banna virus; Isolation; Identification