諾如病毒河北盧龍株NHBGR59全基因組序列分析

敖元云　虞結(jié)梅　李莉莉　靳淼　段招軍

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·論著·

諾如病毒河北盧龍株NHBGR59全基因組序列分析

敖元云虞結(jié)梅李莉莉靳淼段招軍

100052 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腹瀉室

【摘要】目的分析河北盧龍縣腹瀉兒童糞便標(biāo)本中存在的諾如病毒株NHBGR59的全基因組序列，了解其基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和進(jìn)化特征。方法根據(jù)454高通量測(cè)序獲得的兩個(gè)重疊群(contig)和諾如病毒參考株序列(GenBank登錄號(hào)KM198534)設(shè)計(jì)NHBGR59特異性引物，用重疊反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription PCR，RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增的技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)的方法擴(kuò)增其全長(zhǎng)基因，經(jīng)過(guò)分子克隆、測(cè)序獲得全基因組序列，然后進(jìn)行三個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frames，ORFs)序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析。結(jié)果諾如病毒河北盧龍珠HBGR59病毒全基因組全長(zhǎng)為7 563 bp(除了PolyA尾)，病毒基因組分為三個(gè)ORFs：ORF1(5～5 098 nt)、ORF2(5 079～6 731 nt)和ORF3(6 731～7 510 nt)，其中ORF1和ORF2之間有20 bp重疊，ORF2和ORF3之間有1 bp重疊。經(jīng)過(guò)全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)其和基因組II基因型6(genogroup II GenotypeVI, GII.6)諾如病毒株30443同源性最高(同源性為98.0%)。ORF2以及ORF3核苷酸和氨基酸序列與株30443同源性最高(分別為97.0%，98.0%；99.0%，98.0%)。ORF1的基因和氨基酸序列與臺(tái)灣暴發(fā)的急性胃腸炎GII.6株11-FJ-5(GenBank號(hào)KM461694)同源性最高(99.0%，99.3%)，只在高突變P2區(qū)發(fā)生一個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)：aa308D→N；其中衣殼區(qū)的氨基酸序列與其他GII.6型諾如病毒相似度為73.0%～99.3%。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)河北盧龍株HBGR59與GII.6型株30443和11-FJ-5親緣關(guān)系最近。結(jié)論河北盧龍株HBGR59為諾如病毒GII.6型，進(jìn)化關(guān)系上與已報(bào)道的GII.6型株30443和11-FJ-5最近。

【主題詞】諾如病毒；GII.6型；進(jìn)化樹(shù)；基因組

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81290345)

諾如病毒(Norovirus，NoVs)是一種單股、無(wú)包膜的RNA病毒，屬于杯狀病毒屬，是引起兒童和成人非細(xì)菌性胃腸炎的最主要病原體[1-2]。諾如病毒基因組包括三個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open readding frames，ORFs)。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF2和ORF3分別編碼主要(VP1)和次要(VP2)衣殼蛋白。根據(jù)諾如病毒RNA多聚酶區(qū)和衣殼區(qū)的核苷酸序列，將諾如病毒分為5個(gè)基因組(genogroup，G)，GI～GV，其中G1、GII和GIV主要感染人類(lèi)，而GIII和GV分別感染牛和鼠[3-4]。根據(jù)ORF2全基因序列，分別進(jìn)一步分為GI型8個(gè)和GII型23個(gè)，其中GII.4基因型一直是全球胃腸炎暴發(fā)的優(yōu)勢(shì)流行株，由GII.6型引起的暴發(fā)很少有報(bào)道[5-7]。但是，最近發(fā)現(xiàn)了兩起由GII.6型諾如病毒引起的兒童急性胃腸炎暴發(fā)，其中一起來(lái)自上海的一所小學(xué)[8]，另一起來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣(未發(fā)表)，而且前期來(lái)自日本的研究發(fā)現(xiàn)GII.6型諾如病毒已成為第二大優(yōu)勢(shì)株，僅次于GII.4型[9]。因此，對(duì)于我國(guó)GII.6型諾如病毒的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和進(jìn)化特征的研究是非常重要。本研究對(duì)河北盧龍檢測(cè)到的諾如病毒GII.6型毒株進(jìn)行全基因組的測(cè)序和序列分析，以了解其遺傳特征。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源和處理本實(shí)驗(yàn)中NHBGR59陽(yáng)性毒株來(lái)源于2013年河北省盧龍縣10個(gè)月男性腹瀉患兒(急性胃腸炎)糞便標(biāo)本，是通過(guò)454高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的。取豌豆大小(約1 g)的糞便樣品加入1 ml處理液PBS，制成10%便懸液，8000 rmp/min離心5 min，取上清液，保存于-20 ℃。

1.2所用試劑核酸提取試劑盒Viral Nucleic Acid Extraction Kit II購(gòu)自Geneaid公司；Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，dNTP購(gòu)于Invitrogen；Ex-TaqDNA和LA-TaqDNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；3′RACE/5′RACE試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；隨機(jī)引物和PGEM T-easy連接載體購(gòu)于Promega公司；快速T4DNA連接酶購(gòu)于北京擎科有限公司；DH5a感受態(tài)購(gòu)自北京博邁德公司；引物合成和DNA測(cè)序來(lái)自北京天一輝遠(yuǎn)公司。

1.3所用軟件Primer Premier 5用于引物設(shè)計(jì)、Clustalx用于多序列比對(duì)、DNAMAN6.0用于序列相似度分析、DNAStar software package用于序列拼接和MEGA 5.0用于序列進(jìn)化樹(shù)分析。

1.4病毒cDNA的合成取上述從糞便標(biāo)本懸液離心上清中提取的RNA作為模板，用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到病毒的cDNA。反應(yīng)體系為15 μl，組成為：5×First Buffer 2.05 μl，Random Primers 0.5 μl，dNTP(10Mm)0.5 μl，DTT 0.5 μl，Superscript II反轉(zhuǎn)錄 0.5 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，H2O 2.2 μl，RNA 7.5 μl。反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min延伸，99 ℃ 5 min滅活。

1.5病毒全基因組擴(kuò)增由高通量測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的53條序列(reads)，利用DNAStar軟件進(jìn)行重疊區(qū)(overlap)的拼接，拼接后獲得的兩段重疊群(Contig)，長(zhǎng)度分別為2 350個(gè)核苷酸(Nucleotide, nt)和1 173 nt，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物進(jìn)行確認(rèn)，然后根據(jù)確證后的Contig和參考諾如病毒株30443(GenBank登錄號(hào)KM198498)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，兩末端序列采用3′RACE/5′RACE試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物切膠純化，連接至PGEM T-easy載體，挑選陽(yáng)性克隆送北京天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序。所使用的引物見(jiàn)表1。

2結(jié)果

2.1病毒全基因組擴(kuò)增和拼接本次重疊PCR擴(kuò)增共產(chǎn)生5個(gè)特異性片段，長(zhǎng)度分別為1 590 nt, 2 296 nt, 1 960 nt, 1 069 nt和1 579 nt，經(jīng)DNAstar軟件包中SeqMan軟件拼接后得到接近全長(zhǎng)序列(7 495 nt)。兩末端序列經(jīng)過(guò)3′RACE/5′RACE方法擴(kuò)增，分別得到274 nt和271 nt(表1)，再次拼接和確證后得到河北盧龍株NHBGR59病毒全長(zhǎng)序列為7 563 nt(除了PolyA尾)，經(jīng)過(guò)與其他NoVs GII參考序列比對(duì)，NHBGR59分為三個(gè)ORFs和5′/3′UTR區(qū)：ORF1(5～5 098 nt)，ORF2(5 079～6 731 nt)，ORF3(6 731～7 510 nt)以及3′UTR(7 511～7 563 nt)，其中ORF1和ORF2之間有20 bp重疊，ORF2和ORF3之間有1 bp重疊。此序列已收錄于GenBank (序列號(hào)為AU870455)。

表1　諾如病毒全基因組擴(kuò)增所用引物

注：A 確證NHBGR59兩個(gè)Contigo所用的引物；B 用重疊PCR擴(kuò)增NHBGR59未知片段所用的引物；C擴(kuò)增NHBGR59兩末端序列所用的引物

Note: A Primers used for confirmation of two contigs of NHBGR59；B Primers used for amplification of unknown sequence of NHBGR59；C Primers used for amplification of 3′/5′ end sequences of NHBGR59

2.2病毒序列同源性比較將NHBGR59全基因組核苷酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)其和GII.6型諾如病毒株30443(GenBank登錄號(hào)KM198534)同源性最高，為98%，將ORF1、ORF2、ORF3核苷酸和氨基酸分別進(jìn)行Blast分析發(fā)現(xiàn)ORF1的核苷酸和氨基酸序列與引起2014年中國(guó)臺(tái)灣暴發(fā)急性胃腸炎的GII.6株11-FJ-5(GenBank號(hào)KM461694)同源性最高(99.0%，99.3%)(文章未發(fā)表)，只在高突變P2區(qū)發(fā)生一個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)：aa308D→N(存在P2亞區(qū))；而ORF2以及ORF3核苷酸和氨基酸序列與 30443株同源性最高(分別為97.0%，98.0%；99.0%；98.0%)。將NHBGR59 VP1核苷酸和氨基酸和GenBank中所有的GII.6型諾如病毒VP1核苷酸和氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其相似度分別約為80.0%～99.0%，73.0%～99.3%。

2.3病毒進(jìn)化樹(shù)分析將NHBGR59分別與已報(bào)道的19條NoVs全基因組和15條NoVs VP1區(qū)氨基酸參考序列用MEGA 5.0軟件(Neighbor-joining的方法)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從全基因組進(jìn)化樹(shù)(圖1A)可以發(fā)現(xiàn)其和GII.6型諾如病毒株30443在一個(gè)亞枝上，親緣關(guān)系較近。衣殼區(qū)進(jìn)化樹(shù)(圖1B)顯示HBGR59與株11-FJ-5親緣關(guān)系最近，而且顯示GII.6型諾如病毒株可進(jìn)一步分為三個(gè)亞群(Ⅰ～Ⅲ)。其中NHBGR59 衣殼區(qū)的氨基酸和此三個(gè)亞群的病毒相似度分別約為73.0%，90.0%和99.0%左右，而且以NHBGR59為代表的Ⅲ群病毒的VP1比Ⅰ和Ⅱ群病毒長(zhǎng)三個(gè)氨基酸。

3討論

諾如病毒是人急性胃腸炎暴發(fā)流行的重要病原，可引起各年齡段人群急性胃腸炎。從20世紀(jì)90年代至今，GⅡ.4基因型一直是該病原的主要的流行株[5-7]。但最近我國(guó)發(fā)生的兩起GII.6型諾如病毒的暴發(fā)，提示此型諾如病毒在我國(guó)擴(kuò)散和再次暴發(fā)的可能性較大，應(yīng)該引起我國(guó)對(duì)GII.6型諾如病毒的高度重視。本研究利用測(cè)序的技術(shù)對(duì)一名由諾如病毒引起的急性胃腸炎的兒童的糞便標(biāo)本中該型病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、拼接和分析，為我國(guó)GII.6型諾如病研究提供了科學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

A　NHBGR59全基因組進(jìn)化樹(shù)； B　NHBGR59衣殼蛋白區(qū)進(jìn)化樹(shù)圖1　諾如病毒NHBGR59系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) A　Phylogenetic tree of complete genome; B　Phylogenetic tree of VP1 aa Fig.1　Phylogenetic tree of norovirus strain NHBGR59

諾如病毒尚不能在體外培養(yǎng)，而且也沒(méi)有合適的動(dòng)物模型，因此分析其全基因組序列是研究諾如病毒進(jìn)化和發(fā)現(xiàn)新變異株的有效方法。本研究對(duì)NHBGR59進(jìn)行全基因組序列和進(jìn)化樹(shù)的分析，表明NHBGR59株屬于諾如病毒GII.6型毒株, 同時(shí)提示諾如病毒GII.6型毒株具有較大的差異性。主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1中P2亞區(qū)為諾如病毒的高突變區(qū)，含有特異性的抗原位點(diǎn)，且為受體和潛在中和抗體的結(jié)合位點(diǎn)[10]，因此P2亞區(qū)氨基酸抗原位點(diǎn)的分析對(duì)預(yù)示新的病毒變異株出現(xiàn)具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)NHBGR59的VP1和P2區(qū)與2014年中國(guó)臺(tái)灣暴發(fā)的11-FJ-5毒株同源性最為相近(99.3%)，僅存在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異(存在于P2區(qū))，結(jié)合發(fā)生時(shí)間的先后順序，提示11-FJ-5可能是來(lái)自NHBGR59的變異株，但需要更多的證據(jù)。由于缺乏足夠有效長(zhǎng)度的序列以及其它按時(shí)間和地區(qū)分布的序列數(shù)據(jù)，使我們難以分析NHBGR59、上海和臺(tái)灣暴發(fā)的GII.6諾如病毒株彼此間的進(jìn)化和傳播關(guān)系。

近期中國(guó)發(fā)生兩起GII.6型諾如病毒暴發(fā)，其全基因組序列均未報(bào)道，因此河北盧龍株NHBGR59全基因序列可以作為我國(guó)乃至全球GII.6型NoVs比對(duì)的重要參考序列，對(duì)豐富我國(guó)NoVs毒株序列具有重要意義。同時(shí)，本研究也提示加強(qiáng)我國(guó)諾如病毒監(jiān)測(cè)的必要性和重要性，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)和預(yù)警新毒株可能引起的大流行。

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通信作者：段招軍，Email: zhaojund@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.003

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金( 81290345)

(收稿日期：2016-03-06)

Complete sequence analysis of norovirus strain NHBGR59 of Hebei Lulong

AoYuanyun,YuJiemei,LiLili,JinMiao,DuanZhaojun

DiarrheaDepartment,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCentreforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,ChinaCorrespondingauthor:DuanZhaojun,Email:zhaojund@126.com

【Abstract】ObjectiveTo study the gene and evolution of the complete sequence of NHBGR59 strain isolated from children with diarrhea in Hebei Lulong. MethodsThe full-length genome was amplified based on the two contigs and reference sequence of strain of 30443 (KM198534) by methods of reverse transcription PCR and rapid-amplification of cDNA ends. The PCR products was cloned and sequenced. HBGR59 was performed on sequence analysis and phylogenetic tree. ResultsThe complete sequence of NHBGR59 was 7 563 bp (excluding PolyA tail), including three open reading frames (ORFs): ORF1 (5-5 098 nt), ORF2 (5 079-6 731 nt) and ORF3(6 731-7 510 nt), with 20 nucleotide (nt) overlapping in ORF1 and ORF2, and 1 nt overlapping in ORF2 and ORF3. By sequence analysis, NHBGR59 showed the highest homology in complete sequence with norovirus strain 30443 (98% identity), and the ORF2 and ORF3 also showed the highest identity to strain 30443 (97.0% and 99.0% in nt; 98.0% and 98.0% in amino acid (aa)), while the ORF2 displayed the highest homology (99.0% in nt, 99.3% in aa) with the strain 11-FJ-5 (KM461694), which was related to GII.6 norovirus gastroenteritis outbreaks in Taiwan in 2014, and only one amino acid was different (aa308D→N in P2 region) between them. The phylogenetic analysis showed NHBGR59 clustered tightly with strains of 30443 and 11-FJ-5 in norovirus genogroup II genotype 6 (GII.6). ConclusionsNHBGR59 belongs to norovirus GII.6, which is the mostly close to the recently reported strain 30443 and 11-FJ-5.

【Key words】Norovirus; Genogroup II genotype 6; Phylogenetic tree; Genome