一種檢測2′-甲基-6′-乙基-2-氯乙酰苯胺水解酶活性的方法

王　飛，李周坤，董維亮，崔中利①

(1. 江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/ 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌　330045；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點開放實驗室，江蘇 南京　210095)

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一種檢測2′-甲基-6′-乙基-2-氯乙酰苯胺水解酶活性的方法

王飛1，2，李周坤2，董維亮2，崔中利2①

(1. 江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/ 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌330045；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點開放實驗室，江蘇 南京210095)

摘要：建立了一種快速測定Delftia acidovorans T3-6菌株2′-甲基-6′-乙基-2-氯乙酰苯胺(CMEPA)水解酶活性的方法。在20 mmol·L-1Tris-HCl(pH 值為7.0)緩沖液中，10～50 μmol·L-1的CMEPA水解產(chǎn)物2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)在鐵氰化鉀催化下與4-氨基安替比林反應(yīng)生成紫紅色物質(zhì)，該物質(zhì)在535 nm處的吸光度(y)與MEA濃度(x)呈正相關(guān)(y=0.014 6x-0.005 4，R2=0.998 8)。底物CMEPA、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲醇等有機(jī)試劑以及1 mmol·L-1金屬離子對顯色反應(yīng)無顯著影響，溫度和pH值對顯色反應(yīng)影響顯著。4-氨基安替比林顯色法對菌株T3-6粗酶液酶活性的測定結(jié)果與二氯甲烷萃取-紫外分光光度法無顯著差異。該方法也適用于其他苯胺苯酚類衍生物的測定。

關(guān)鍵詞：2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)；4-氨基安替比林顯色法；分光光度法；Delftia acidovorans T3-6

2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)是苯胺的一種衍生化合物,也是氯乙酰胺類除草劑乙草胺生物降解的中間代謝產(chǎn)物之一[1]。同其他苯胺類化合物一樣,MEA是嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人體健康的有害物質(zhì)[2]。鑒于大部分苯胺類化合物都具有致突變和致癌作用,它們在環(huán)境中的殘留、檢測及微生物降解得到廣泛關(guān)注[3]。

目前對環(huán)境中苯胺的檢測方法主要有分光光度法和色譜法2種[4]。色譜法由于儀器等原因,不適于快速大量檢測,簡便的苯胺測定方法為紫外分光光度法和偶氮比色法。MEA在284 nm處有最大紫外吸收峰,因此可通過二氯甲烷萃取后測定284 nm波長下的吸光度來檢測MEA含量[5],但MEA易隨著二氯甲烷揮發(fā),不易準(zhǔn)確測定。偶氮比色法常用的顯色劑為萘乙二胺和安基比林、4-氨基安替比林和茜素紅S等[6]。4-氨基安替比林顯色法通常被用于苯酚的檢測,在堿性條件下,苯酚經(jīng)鐵氰化鉀催化與4-氨基安替比林反應(yīng)生成紫紅色物質(zhì),在515 nm波長下有最大吸收峰[7]。在用該顯色法測定苯酚時,苯胺及其衍生物對吸光度有較大的干擾,推測干擾物質(zhì)也具有類似的反應(yīng)[8]。DelftiaacidovoransT3-6是從生產(chǎn)乙草胺的農(nóng)藥廠活性污泥中分離獲得的一株能高效水解2′-甲基-6′-乙基-2-氯乙酰苯胺(CMEPA)的菌株,水解產(chǎn)物為MEA[9]。該研究利用MEA與4-氨基安替比林顯色的特點,建立了CMEPA水解酶活性的快速測定方法。

1材料與方法

1.1材料

CMEPA、MEA和2,6-二乙基苯胺由青島沃克生物技術(shù)有限公司合成,4-氨基安替比林、鐵氰化鉀、苯胺、2,3-二甲基苯胺、2,4-二甲基苯胺、2,5-二甲基苯胺、鄰甲基苯胺、4-氨基酚、苯酚、鄰硝基酚、間甲基酚、3,5-二甲基苯酚、2氨基4氯酚、2氨基5氯酚、對硝基苯基乙酰胺和鄰苯二酚均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

菌株:DelftiaacidovoransT3-6,由筆者所在實驗室分離并鑒定,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號:CCTCC NO:M 2012526)。

LB培養(yǎng)基: 酵母粉 5.0 g·L-1,胰蛋白胨 10.0 g·L-1,NaCl 10.0 g·L-1,pH值為7.0～7.2。

1.2儀器

SHIMADZU UV-2401紫外可見分光光度計,KUBOTA 201M超聲波破碎儀,Beckman Allegra X-22R臺式高速冷凍離心機(jī)。

1.3顯色反應(yīng)測定波長的確定[8]

取0.1 mmol·L-1MEA溶液0.5 mL,加入0.1 mol·L-14-氨基安替比林溶液50 μL、0.2 mol·L-1鐵氰化鉀溶液50 μL,加去離子水補(bǔ)足體系至5 mL,以不含MEA的溶液體系作為參比溶液,稀釋10倍后在分光光度計400～700 nm波長下掃描。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在反應(yīng)體系中加入不同量的MEA標(biāo)準(zhǔn)液,使終濃度為0.05、0.1、0.5、1、5、15、20、25、30、35、40、50 μmol·L-1,加入4-氨基安替比林和鐵氰化鉀溶液,使終濃度分別為1和2 mmol·L-1,稀釋10倍后在535 nm波長條件下測定吸光度(D535),以MEA濃度為橫坐標(biāo)、D535為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)線性回歸方程計算最低檢測限。

1.5溫度對顯色反應(yīng)的影響試驗

在反應(yīng)體系中加入不同量的MEA溶液,使終濃度為10、20、30、40、50 μmol·L-1,加入4-氨基安替比林和鐵氰化鉀溶液,使終濃度分別為1和2 mmol·L-1,分別于30、40、50、60、70 ℃條件下水浴20 min,稀釋10倍后測定D535值,試驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.6pH對顯色反應(yīng)的影響試驗

配制pH值為5、6、7、8、9 的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(PBS,20 mmol·L-1),各吸取2 mL,分別加入0.1 mol·L-1的MEA溶液150 μL,加入0.1 mol·L-14-氨基安替比林溶液和0.2 mol·L-1鐵氰化鉀溶液各30 μL,以磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足體系至3 mL,使MEA終濃度為50 μmol·L-1,稀釋10倍后測定D535值,重復(fù)3次,計算標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7化學(xué)試劑對顯色反應(yīng)的影響試驗

以20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值為7.0)建立反應(yīng)體系,加入各種金屬離子,使終濃度為1 mmol·L-1,以不添加任何金屬離子組作為對照,重復(fù)3次,測定含不同金屬離子條件下MEA終濃度為50 μmol·L-1反應(yīng)體系的D535值。

在MEA終濃度為50 μmol·L-1的20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值為7.0)反應(yīng)體系中分別加入φ=10%的甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙腈,φ=5%的二甲基亞砜(DMSO),φ=5%的苯甲基磺酰氟(PMSF),2 mg·mL-1十二烷基硫酸鈉(SDS),20 mg·mL-1聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),20 mg·mL-1聚山梨酯-80,1 mmol·L-1CMEPA,1 mmol·L-12，6-二乙基苯胺(CDEPA),以不添加上述試劑的測定體系為對照,重復(fù)3次,稀釋10倍后測定D535值。

1.84-氨基安替比林顯色法檢測苯胺、苯酚及其衍生物

在反應(yīng)體系中加入不同量的苯胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)液,使終濃度為0.05、0.1、0.5、1、5、15、20、25、30、35、40、50 μmol·L-1,加入4-氨基安替比林和鐵氰化鉀溶液,使終濃度分別為1和2 mmol·L-1,重復(fù)3次,測定D535值，并獲取線性方程。

1.9顯色法與紫外分光光度法測定菌株T3-6粗酶液酶活性

挑取經(jīng)劃線活化的菌株DelftiaacidovoransT3-6單菌落接種于3 mL 液體LB試管培養(yǎng)基中,30 ℃條件下180 r·min-1培養(yǎng)菌液至對數(shù)生長期,按1%接種量接種至100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫條件下以180 r·min-1培養(yǎng)至穩(wěn)定期,4 ℃條件下以5 000 r·min-1(離心半徑10 cm)離心10 min,收集菌體,棄上清液;用適量預(yù)冷的20 mmol·L-1PBS (pH值為7.0)重懸菌體,4 ℃條件下以12 000 r·min-1(離心半徑8 cm)離心10 min,棄上清液;以5 mL PBS重懸菌體。菌懸液以180 Hz超聲波破碎10 min,整個過程在冰浴下進(jìn)行,破碎液在4 ℃條件下以13 000 r·min-1(離心半徑8 cm)離心20 min,上清液即為粗酶液[2]。

取適量T3-6粗酶液加至3 mL含2 mmol·L-1CMEPA的20 mmol·L-1Tris-HCl (pH值為7.0)中,于30 ℃條件下反應(yīng)10 min后,加入0.1 mol·L-14-氨基安替比林和0.2 mol·L-1鐵氰化鉀各30 μL,重復(fù)3次,稀釋10倍后測定D535值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算MEA含量。

另取等量T3-6粗酶液加至3 mL含2 mmol·L-1CMEPA的20 mmol·L-1Tris-HCl(pH值為7.0)中,于30 ℃條件下反應(yīng)10 min后,加入等體積二氯甲烷萃取,萃取液在284 nm波長處測定吸光度,重復(fù)3次。根據(jù)MEA在284 nm波長測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶反應(yīng)體系所產(chǎn)生的MEA含量,對2種方法測得的MEA含量進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2.1MEA與4-氨基安替比林顯色反應(yīng)可見光波段掃描圖譜

MEA與4-氨基安替比林在鐵氰化鉀催化下所形成的紫紅色物質(zhì)在535 nm波長處有一最大吸收峰(圖1),此時吸光度為0.99,因此選取535 nm為測定吸光度時的波長。

圖1　顯色反應(yīng)體系可見光波段掃描圖譜

2.2MEA最低檢測限及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2表明,在該反應(yīng)體系中,D535值(y)與MEA濃度(x)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.014 6x-0.005 4,R2=0.998 8。根據(jù)上述公式,當(dāng)D535值為0時,MEA濃度為3.7 μmol·L-1。因此,采用該方法測定MEA含量的最低檢測限為4 μmol·L-1。

圖2　MEA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3溫度對顯色反應(yīng)的影響

圖3表明,溫度條件對顯色反應(yīng)有較大影響,D535值隨著溫度的升高而降低,且靈敏度也降低。在30、40、50、60和70 ℃條件下,D535值(y)與MEA濃度(x)之間的線性回歸方程分別為:y=0.014 6x-0.005 4,y=0.010 1x+0.007 7,y=0.007 2x+0.012 6,y=0.005 3x-0.009 6,y=0.002 3x-0.027 6。

圖3　溫度條件對MEA標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響

2.4pH對顯色反應(yīng)的影響

圖4表明,以4-氨基安替比林顯色法對MEA進(jìn)行定量分析時,pH值對顯色反應(yīng)有較大影響,pH值為6～7時,所測D535值較高,堿性條件對顯色反應(yīng)的影響更顯著。因此,在以該方法測定MEA時,應(yīng)盡量在中性緩沖液條件下進(jìn)行。

2.5化學(xué)試劑對顯色反應(yīng)的影響

圖5表明,顯色體系里含有1 mmol·L-1Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Cr3+時,反應(yīng)體系的D535值有輕微減弱,但影響并未達(dá)到顯著水平,其余各離子對顯色反應(yīng)基本無影響。

采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗,直方柱上方英文小寫字母不同表示各處理間D535差異顯著(P<0.05)。

采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗,直方柱上方英文小寫字母相同表示各處理間D535差異不顯著(P>0.05)。

在pH值為7、MEA終濃度為50 μmol·L-1的反應(yīng)體系中分別加入不同的有機(jī)試劑和CMEPA、CDEPA等底物,以不添加上述試劑的測定體系為對照,稀釋10倍后測定D535,結(jié)果見表1。

不同有機(jī)試劑對顯色反應(yīng)的影響并不顯著,在以4-氨基安替比林顯色法對菌株T3-6 CMEPA水解產(chǎn)物MEA進(jìn)行測定時,底物和有機(jī)試劑對水解產(chǎn)物MEA的測定無干擾作用。

2.6苯胺、苯酚及其衍生物的檢測

表2表明,4-氨基安替比林顯色法對苯胺、苯酚以及鄰位、間位具取代基衍生物的檢測都較靈敏,且具有良好的線性關(guān)系,該方法對對位具取代基的化合物不靈敏,硝基和鹵素取代基對顯色反應(yīng)具有較大影響,2個間位同時存在取代基時,檢測靈敏度也下降,而對硝基苯基乙酰胺和鄰苯二酚這2種化合物不能由該方法檢出。

表1不同有機(jī)試劑對顯色反應(yīng)的影響

Table 1Effects of chemical agents on chromogenic reaction

化學(xué)試劑 終濃度D535均值對照—0.701±0.006a甲醇100mL·L-10.684±0.010a乙醇100mL·L-10.683±0.015a丙酮100mL·L-10.681±0.017a異丙醇100mL·L-10.686±0.012a乙腈100mL·L-10.689±0.017a聚山梨酯-8020mg·mL-10.692±0.014aTritonX-10020mg·mL-10.676±0.008aSDS2mg·mL-10.681±0.006aPMSF50mL·L-10.678±0.027aDMSO50mL·L-10.683±0.016aDMF50mL·L-10.686±0.010aEDTA10mmol·L-10.680±0.024aCMEPA10mmol·L-10.697±0.010aCDEPA10mmol·L-10.696±0.008a

采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗,數(shù)據(jù)后英文小寫字母相同表示各處理間D535值差異不顯著(P>0.05)?！啊北硎緹o數(shù)據(jù)。

表2苯胺、苯酚及其衍生物濃度(x)與吸光度(y)的線性方程

Table 2Linear equation of absorbancy with aniline, phenol and their derivatives

化合物稀釋倍數(shù)線性方程R2苯胺10y=0.0113x+0.11360.94922,3-二甲基苯胺10y=0.0122x+0.0050.98622,4-二甲基苯胺未稀釋y=0.008x-0.05150.98012,5-二甲基苯胺10y=0.0128x-0.05610.99632,6-二甲基苯胺10y=0.0095x-0.02710.99542-甲基苯胺10y=0.012x+0.0690.97244-氨基苯酚未稀釋y=0.0237x-0.1730.9993苯酚10y=0.009x+0.03420.9669鄰硝基苯酚10y=0.0028x+0.03240.99263-甲基苯酚10y=0.0086x+0.0260.99613,5-二甲基苯酚未稀釋y=0.0187x+0.21650.96782-氨基-4-氯苯酚10y=0.0034x-0.00510.98752-氨基-5-氯苯酚10y=0.0034x+0.01570.9942

對硝基乙酰苯胺和鄰苯二酚未發(fā)生顯色反應(yīng)。

2.72種方法測定菌株T3-6粗酶液酶活性的比較

表3表明,在用4-氨基安替比林顯色法和二氯甲烷萃取-紫外分光光度法2種方法對菌株T3-6粗酶液酶活性進(jìn)行測定時,所得結(jié)果無顯著差異。

3結(jié)論與討論

酰胺鍵的水解是CMEPA微生物降解途徑中的關(guān)鍵反應(yīng),國內(nèi)外學(xué)者在進(jìn)行基因克隆時通常采用高效液相色譜(HPLC)方法檢測CMEPA水解酶基因[10],但該方法不適于快速大量檢測。根據(jù)MEA紫外掃描圖譜,以MEA在284 nm處的吸光度(y)與其濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為y=0.018 2x+0.047 4,且兩者具有良好的線性關(guān)系,但這種分光光度計方法要求供檢測的MEA需經(jīng)過二氯甲烷萃取等步驟,相對比較繁瑣。

表32種方法測定菌株T3-6粗酶液酶活性的比較

Table 3Comparison between the two methods in determination of enzymatic activity of crude extract of strain T3-6

方法吸光度重復(fù)Ⅰ重復(fù)Ⅱ重復(fù)ⅢMEA濃度/(μmol·L-1)4-氨基安替比林顯色法0.4120.4010.40828.25a二氯甲烷萃取-紫外分光光度法0.5660.5870.53528.31a

采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗，數(shù)據(jù)后英文小寫字母相同表示2種方法間MEA濃度差異不顯著(P>0.05)。

4-氨基安替比林顯色法常用于苯酚的定量分析[11-13],而苯胺及其衍生物對該反應(yīng)有較大干擾,在樣品中無苯酚存在的條件下,也可用于苯胺的檢測[14]。在Cu2+的催化下,4-氨基安替比林與N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺鈉反應(yīng)生成藍(lán)綠色物質(zhì),可用于苯胺及相關(guān)衍生物的檢測,檢測限為2.1 mmol·L-1[15]。

該研究探索了4-氨基安替比林顯色法定量測定MEA的影響條件。試驗結(jié)果表明,在常溫、pH值為中性的緩沖體系中,4-氨基安替比林與MEA、DEA、苯胺、苯酚、2-氨基和4-氯苯酚等化合物能形成較穩(wěn)定的紫紅色物質(zhì),在535 nm處有最大吸收峰,D535值與待檢化合物濃度呈良好的線性關(guān)系。

在以4-氨基安替比林顯色法測定DelftiaacidovoransT3-6 CMEPA水解酶活性時,1 mmol·L-1金屬離子的存在對吸光度無顯著影響,不同濃度有機(jī)試劑均對顯色反應(yīng)無顯著影響。因此,在進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)特性試驗時,也可以采用該方法進(jìn)行測定。

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(責(zé)任編輯： 許素)

收稿日期：2015-08-30

基金項目：國家自然科學(xué)基金 (31560031,31570059)；江西省自然科學(xué)基金(20161BAB204178)

通信作者①E-mail: czl@njau.edu.cn

中圖分類號：X592

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-4831(2016)04-0682-05

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.04.026

作者簡介：王飛(1976—),男,湖北天門人,講師,博士,主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail: wangfei179@163.com

A New Method for Determining Activity of CMEPA Hydrolase.

WANG Fei1，2， LI Zhou-kun2， DONG Wei-liang2， CUI Zhong-li2

(1.Jiangxi Engineering Laboratory for the Development and Utilization of Agricultural Microbial Resources/ College of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2.Key Laboratory of Microbiological Engineering Agricultural Environment, Ministry of Agriculture/ College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:A new method for rapid determination of the activity of 2′-methyl-6′-ethyl-2-chloroacetanilide(CMEPA) hydrolase in Delftia acidovorans T3-6 was established. CMEPA hydrolase can hydrolyze CMEPA into 2-methyl-6-ethyl-aniline (MEA), which, in turn, reacts with 4-aminoantipyrene in 20 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.0) buffer to produce a compound, purple in color, with absorbancy at 535 nm(y) positively related to the concentration of MEA(x) in the range of 10-50 μmol·L-1. The linear equation goes as y=0.014 6x-0.005 4, R2=0.998 8. The compounds of CMEPA, SDS, organic reagent such as methanol and 1 mmol·L-1metal ions have no significant effect on chromogenic reaction, whereas temperature and pH does. Compared with the dichloromethane extraction-UV spectrophotometry method, the 4-aminoantipyrene colorimetric method does not vary much in determining enzymatic activity of T3-6 crude enzyme. This method is also applicable to the determination of other derivatives of aniline and phenol.

Key words:2-methyl-6-ethyl-aniline (MEA); 4-aminoantipyrinechromogenic method; spectrophotometry; Delftia acidovorans T3-6