檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥微生物菌群結(jié)構(gòu)解析

曾濤濤，廖　偉，謝水波,3，榮麗杉，李仕友，蔣小梅，馬華龍

(1.南華大學(xué) 礦業(yè)工程博士后流動(dòng)站，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南華大學(xué))，湖南 衡陽(yáng) 421001；3.鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室(南華大學(xué))，湖南 衡陽(yáng) 421001)

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檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥微生物菌群結(jié)構(gòu)解析

曾濤濤1,2，廖偉2，謝水波2,3，榮麗杉2，李仕友2，蔣小梅2，馬華龍2

(1.南華大學(xué) 礦業(yè)工程博士后流動(dòng)站，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南華大學(xué))，湖南 衡陽(yáng) 421001；3.鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室(南華大學(xué))，湖南 衡陽(yáng) 421001)

摘要:為揭示檸檬酸廢水生物處理過(guò)程中功能菌群作用機(jī)制，以檸檬酸工業(yè)廢水內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)塔(IC)中厭氧顆粒污泥為研究對(duì)象，統(tǒng)計(jì)顆粒粒徑分布，通過(guò)環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)觀察顆粒微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析微生物多樣性及菌群特征.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粒徑在1.0～4.0 mm的顆粒所占比例最多，為74.4%.ESEM顯示微生物分布以球形細(xì)菌為主.高通量測(cè)序得到8 397條有效序列，可劃分操作分類單元(OTU)873個(gè)，Alpha多樣性指數(shù)顯示樣品文庫(kù)覆蓋率0.936，Shannon指數(shù)為4.376，而ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)分別為3 415.51與2 246.51，反映顆粒污泥中微生物種類與數(shù)量均較多.微生物菌群主要包括4大類，分別為可降解有機(jī)物的水解發(fā)酵菌群Paludibacter、Parabacteroides、Erysipelotrichaceae、Clostridium、Phascolarctobacterium、Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus(所占比例之和為24.93%)；產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群Petrimonas與Syntrophomonas(所占比例之和為34.89%)；產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta(3.44%)及可耐受工業(yè)廢水毒害的微生物菌群Levilinea、Longilinea與Thermovirga(所占比例之和為14.62%).

關(guān)鍵詞:厭氧顆粒污泥；微生物菌群；高通量測(cè)序；檸檬酸廢水

檸檬酸廣泛應(yīng)用于食品飲料、醫(yī)藥、化工清洗與環(huán)保等領(lǐng)域，在檸檬酸的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的高濃度有機(jī)廢水，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，檸檬酸廢水是否有效處理直接關(guān)系著檸檬酸行業(yè)的持續(xù)發(fā)展.檸檬酸工業(yè)廢水中BOD(生化需氧量)占COD(化學(xué)需氧量)的50%左右，具有良好的可生化性，因此，較多地采用生物處理方法，反應(yīng)器以內(nèi)循環(huán)(IC)厭氧反應(yīng)器形式為主[1].在IC反應(yīng)器中，微生物主要存在于厭氧顆粒污泥中，作為廢水生物處理的主體，研究顆粒污泥中的菌群結(jié)構(gòu)，有助于了解檸檬酸廢水處理過(guò)程中微生物的作用機(jī)制，提高檸檬酸廢水的處理效果.目前，裴振洪等[2]通過(guò)構(gòu)建16S rDNA文庫(kù)分析了檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬為棒桿菌屬(Corynebacterium)、梭菌屬(Clostridium)、消化球菌屬(Peptococcus)與疣微菌屬(Verrucomicrobia).但由于16S rDNA克隆文庫(kù)獲得的序列有限(100條左右)，僅能夠反映有限的優(yōu)勢(shì)微生物類群，很大程度上可能低估了厭氧顆粒污泥微生物的物種組成.近幾年發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)可獲得足夠數(shù)量的可用序列(1萬(wàn)條左右)，能夠較全面和準(zhǔn)確地反映微生物群落結(jié)構(gòu)，日趨成為解析復(fù)雜環(huán)境中微生物菌群組成和相對(duì)豐度的重要工具[3].

本文以湖南某檸檬酸廢水IC反應(yīng)塔中厭氧顆粒污泥為研究對(duì)象，分析顆粒粒徑分布，應(yīng)用環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)觀察厭氧顆粒污泥微觀形態(tài)，并利用高通量測(cè)序技術(shù)解析厭氧顆粒污泥微生物菌群結(jié)構(gòu)特征，以期為提高檸檬酸廢水處理效果提供微生物學(xué)理論基礎(chǔ).

1實(shí)驗(yàn)

1.1顆粒污泥形態(tài)結(jié)構(gòu)

厭氧顆粒污泥取自湖南某檸檬酸生產(chǎn)廠化工廢水處理的內(nèi)循環(huán)(IC)厭氧塔(1 400 m3)，用蒸餾水將顆粒污泥清洗3次，在坐標(biāo)紙上進(jìn)行粒徑分布檢測(cè)，通過(guò)數(shù)碼相機(jī)拍攝顆粒污泥外觀.

厭氧顆粒污泥微觀結(jié)構(gòu)通過(guò)環(huán)境掃描電子顯微鏡(FEI QUANTA 200)觀察.樣品預(yù)處理步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[4]：厭氧顆粒污泥在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀，將沉淀放置-80 ℃超低溫冰箱(SANYO，MDF-U32V)冷凍24 h，取出后立即置于冷凍干燥機(jī)(Freeze Dryer，F(xiàn)D5-series)中真空干燥24 h，脫去水分.樣品噴金后進(jìn)行觀察，并利用X-射線能譜儀(EDAX Genesis 2000)分析顆粒污泥的元素組成.

1.2高通量測(cè)序

取0.5 g顆粒污泥，通過(guò)試劑盒(E.Z.N.A Soil DNA，OMEGA)提取微生物基因組DNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提基因組的完整性，利用Qubit2.0 DNA試劑盒檢測(cè)基因組DNA濃度.

PCR擴(kuò)增所用引物為341F/805R，即CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNCCTACGGGNGGCWGCAG與GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTA

CHVGGGTATCTAATCC[5].PCR反應(yīng)體系包括：DNA 模板(10 ng)，5 μL 10×Buffer，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，341F/805R引物各0.5 μL(50 μmol/L)，0.5 μL DNA聚合酶(5 U/μL，Plantium Taq，Thermo)，添加超純水至50 μL.

同一樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；25個(gè)循環(huán)包含3個(gè)階段，即95，55和72 ℃下各保持30 s；72 ℃終延伸5 min.PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，通過(guò)DNA膠回收試劑盒(SanPrep，上海生工)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收.

回收的PCR產(chǎn)物通過(guò)Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒精確定量，并添加測(cè)序標(biāo)簽，通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)完成對(duì)樣品高通量測(cè)序.

1.3微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

對(duì)高通量測(cè)序所得序列進(jìn)行質(zhì)控(QC)，以去除不符合要求的引物序列、短片段及低質(zhì)量序列.將所得序列進(jìn)行相似性分析，并劃分操作分類單元(OUT，相似性大于0.97).OTU聚類采用軟件uclust(http://www.drive5.com/uclust/downloads1_1_579.html).

計(jì)算微生物Alpha多樣性指數(shù)，包括覆蓋率、豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)與Chao1指數(shù).樣品文庫(kù)覆蓋率(coverage)計(jì)算公式為：C=1-N1/N，其中，N1為只含有一條序列的 OTU 數(shù)目；N為總序列數(shù)目[6].豐富度指數(shù)通過(guò)操作分類單元的個(gè)數(shù)計(jì)算，以衡量單個(gè)樣本中物種種類個(gè)數(shù).香農(nóng)指數(shù)計(jì)算公式為H=-∑Pi×lnPi，其中Pi為各種群物種數(shù)與樣本總物種數(shù)比值，結(jié)果可衡量群落異質(zhì)性.ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均用來(lái)估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，其算法不同.Alpha多樣性分析采用軟件mothur(http://www.mothur.org/).

通過(guò)RDP classifier軟件將序列進(jìn)行物種分類，選取門(phylum)、屬(genus)為分類單位，統(tǒng)計(jì)各分類單位對(duì)應(yīng)序列數(shù)量，繪制物種豐度圖[7].

2結(jié)果與討論

2.1厭氧顆粒污泥形態(tài)結(jié)構(gòu)

對(duì)顆粒污泥進(jìn)行數(shù)碼照相，通過(guò)坐標(biāo)紙刻度對(duì)照，在放大鏡下統(tǒng)計(jì)了1 345個(gè)顆粒的粒徑大小(圖1(a))，并利用Origin Pro 9.0軟件繪制粒徑分布柱狀圖，結(jié)果如圖1(b)所示.厭氧顆粒污泥為深黑球狀，呈明顯的顆粒特征.粒徑在2.0～3.0 mm的顆粒所占比例最多，達(dá)37.9%；大部分粒徑在1.0～4.0 mm，所占比例為74.4%；4～5 mm的粒徑最少，比例為4.8%.

圖1　顆粒污泥外觀與粒徑分布

對(duì)真空干燥后的厭氧顆粒污泥進(jìn)行粘樣，噴金30 s.在20 kV加速電壓下，通過(guò)環(huán)境掃描電鏡(ESEM)放大5 000倍，觀察顆粒污泥微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2(a)所示.通過(guò)EDS分析顆粒污泥微生物的元素組成及比例，結(jié)果見(jiàn)圖2(b).

由圖2(a)可知，顆粒污泥中分布較多直徑接近1 μm的球形菌.另外發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面光滑、形態(tài)勻稱，表明在較高有機(jī)物濃度下，顆粒污泥內(nèi)的微生物生長(zhǎng)良好.與普通活性污泥相比，顆粒污泥對(duì)工業(yè)廢水中復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng).Tyupa等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與普通絮狀活性污泥相比，顆粒污泥抗重金屬毒害作用的能力提高50%.通過(guò)能譜分析檢測(cè)顆粒污泥中元素組成及比例，結(jié)果顯示C、O、Ca、P、N、Fe、S所占比例最高，這7種元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和達(dá)97.01%.此外，顆粒污泥中含有少量微量元素Mg和Co.

圖2　厭氧顆粒污泥微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.2微生物群落結(jié)構(gòu)解析

2.2.1樣本序列

測(cè)序獲得原始序列10 392條，去除barcode序列、兩端引物序列，并進(jìn)行質(zhì)控以去除部分低質(zhì)量序列、嵌合體及靶區(qū)域外序列，得到可用于分析的8 397條序列，這些序列平均長(zhǎng)度為414.3 bp(表1).表明顆粒污泥具備較大的樣本序列數(shù)量且平均長(zhǎng)度合適，可很好地滿足后續(xù)微生物多樣性分析要求.

表1　污泥測(cè)序序列分析結(jié)果

2.2.2微生物多樣性分析

微生物Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果如表2所示.隨機(jī)抽取樣本序列數(shù)作為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)目為縱坐標(biāo)，可繪制出如圖3(a)所示的豐富度稀疏曲線.同理，得到香農(nóng)指數(shù)曲線(圖3(b))、ACE指數(shù)曲線(圖3(c))與Chao1指數(shù)線(圖3(d)).

表2　顆粒污泥微生物Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)獲得的8 397條序列可分成873個(gè)OTU，而操作分類單元可能接近于屬，表明顆粒污泥中微生物種類很多.樣本覆蓋率達(dá)0.936，對(duì)應(yīng)圖3(a)豐富度稀疏曲線，說(shuō)明序列沒(méi)有被測(cè)出的概率非常小，該結(jié)果能很好地反映顆粒污泥中微生物實(shí)際存在情況.Shannon指數(shù)為4.376，對(duì)應(yīng)圖3(b)中的Shannon指數(shù)曲線最終趨向平坦，說(shuō)明取樣的數(shù)量合理，取樣深度足夠.另外，ACE指數(shù)達(dá)3 415.51，Chao1指數(shù)為2 246.51，這兩個(gè)指數(shù)常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù).對(duì)應(yīng)圖3(c)、(d)這2條曲線也能反映出序列數(shù)量達(dá)到或接近飽和，表面顆粒污泥中微生物多樣性極高.由此說(shuō)明，在檸檬酸化工廢水處理過(guò)程中，顆粒污泥保持較高的微生物豐度與菌屬多樣性.

圖3　物種多樣性分析

2.2.3微生物菌群結(jié)構(gòu)解析

通過(guò)RDP classifier軟件分析phylum(門)水平各微生物所占比例，小于0.3%的細(xì)菌統(tǒng)一用“Other”表示，結(jié)果如圖4所示.可以看出，微生物主要可分為7大類門，豐度最高的是擬桿菌門(Bacteroidetes)，比例達(dá)43.13%；其次為厚壁菌門(Firmicutes)，比例為24.83%.綠彎菌門(Chloroflexi)為顆粒污泥中第3大類微生物，比例為16.03%.接下來(lái)依次為廣古菌門(Euryarchaeota)、變形菌門(Proteobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)及嗜熱絲菌門(Caldiserica)，所占比例分別為3.73%、2.56%、2.2%及0.38%.另外，未分類到具體細(xì)菌門的序列(unclassified)所占比例為5.64%，還有其他一些數(shù)目非常低的細(xì)菌門(比例小于0.3%)，其比例之和為1.5%.

為了更清楚了解厭氧顆粒污泥的菌屬特征，分析了屬(genus)水平對(duì)應(yīng)的序列數(shù)量及其所占比例，并繪制菌屬豐度柱狀圖，結(jié)果如圖5所示.對(duì)于所占比例小于0.5%的物種統(tǒng)一用“Other”表示.

圖4　Phylum水平上微生物豐度圖

由圖5可知，Petrimonas(理研菌屬)所占比例為32.14%，包含序列2 699條，為顆粒污泥中含量最多的微生物菌屬.Petrimonas具有厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫能力，這與厭氧顆粒污泥性質(zhì)密切相關(guān)，是厭氧處理高濃度有機(jī)廢水的功能菌屬.Petrimonas曾在微生物燃料電池中出現(xiàn)[9]，與產(chǎn)甲烷菌分別參與產(chǎn)氫和產(chǎn)甲烷過(guò)程.Erysipelotrichaceae菌的豐度為7.68%，包含相應(yīng)序列645條.之前研究發(fā)現(xiàn)Erysipelotrichaceae參與乳酸代謝過(guò)程[10]，檸檬酸生產(chǎn)廢水中有機(jī)酸類主要為乳酸，因此，顆粒污泥中的該類微生物可有效地將乳酸進(jìn)行分解.

Paludibacter和Parabacteroides菌屬所占比例分別為7.17%與0.69%，均屬于專性厭氧的擬桿菌門.研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬能發(fā)酵多種單糖和二糖產(chǎn)生丙酸、乙酸和少量丁酸[11]，因此，這兩類微生物也是厭氧顆粒污泥中的功能菌屬.Clostridium(梭菌屬)所占比例為5.95%，包含序列500條，是顆粒污泥優(yōu)勢(shì)菌屬之一.Clostridium屬于厚壁菌門(Firmicutes)，是重要的酸化發(fā)酵菌，降解有機(jī)物產(chǎn)生甲酸、乙酸、丙酸等揮發(fā)酸，之前裴振洪等[2]通過(guò)16S rDNA文庫(kù)方法，分析了檸檬酸廢水厭氧顆粒污泥群落結(jié)構(gòu)，同樣發(fā)現(xiàn)梭菌屬是其優(yōu)勢(shì)菌屬.Syntrophomonas(互營(yíng)單胞菌)在顆粒中所占比例為2.75%，包含序列231條.該菌屬是厭氧發(fā)酵中常見(jiàn)的微生物，可以降解丁酸，為顆粒污泥功能菌屬之一.周軒宇[12]研究了處理造紙廢水的新型厭氧反應(yīng)器內(nèi)功能菌群，發(fā)現(xiàn)Syntrophomonas所占比例最高時(shí)達(dá)(20.76±0.51)%，是主要的優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)造紙廢水容積負(fù)荷波動(dòng)具有良好的抗沖擊性.

圖5　Genus水平上物種豐度圖

Methanosaeta(甲烷鬃菌屬)所占比例為3.44%，包含序列289條，是顆粒污泥進(jìn)行廢水厭氧消化產(chǎn)甲烷階段的功能菌屬.朱文秀等[13]進(jìn)行了IC反應(yīng)器處理啤酒廢水的效能及其微生物群落動(dòng)態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)Methanosaeta在高進(jìn)水負(fù)荷下優(yōu)勢(shì)地位顯著，表明這類產(chǎn)甲烷菌具有耐受高負(fù)荷性能.Phascolarctobacterium屬于厚壁菌門(Firmicutes)，在顆粒污泥中所占比例為1.63%，包含序列137條，具有厭氧發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的能力[14].

Levilinea(11.42%)和Longilinea(2.2%)為厭氧繩菌綱(Anaerolineae)的典型微生物菌屬.曹新塏等[15]發(fā)現(xiàn)Levilinea存在于處理含萘工業(yè)廢水的厭氧活性污泥中；王學(xué)華等[16]也發(fā)現(xiàn)Levilinea、長(zhǎng)繩菌屬(Longilinea)是處理印染廢水UASB反應(yīng)器內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬.因此，Levilinea與長(zhǎng)繩菌屬(Longilinea)均具有耐受工業(yè)廢水中有毒物質(zhì)侵害的能力.Thermovirga所占比例為1%，包含序列84條.王有昭[17]進(jìn)行了生物電化學(xué)強(qiáng)化偶氮染料脫色作用機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)Thermovirga在耐毒性馴化后的陽(yáng)極生物膜中所占比例為15.9%，在強(qiáng)化偶氮染料還原脫色中發(fā)揮關(guān)鍵作用，該菌屬的存在有助于提高顆粒污泥對(duì)工業(yè)廢水中有毒物質(zhì)的耐受性能.

Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus3種菌屬所占比例較低，分別為0.68%、0.61%與0.52%，這3類菌曾在秸稈發(fā)酵液微生物菌群分析中觀察到.其中Aminobacterium參與氨基酸代謝，Alkaliflexus具有纖維素降解功能，可提供底物給產(chǎn)酸菌[18].

此外，測(cè)序結(jié)果中有1 129條序列與已有菌屬相似性低，不能歸為其中一類，用Unclassified bacteria(未明確分類細(xì)菌)表示，所占比例為13.45%，這些序列的作用有待深入研究.所有比例低于0.5%的序列之和為727條，對(duì)應(yīng)菌屬豐度共占8.67%.說(shuō)明顆粒污泥中還存在許多低豐度微生物菌屬，雖不屬于優(yōu)勢(shì)菌群，但也是顆粒污泥菌群結(jié)構(gòu)的重要組分.

從以上分析可知，厭氧顆粒污泥功能菌群包括4大類，分別為有機(jī)物水解發(fā)酵菌群Paludibacter、Parabacteroides、Erysipelotrichaceae、Clostridium、Phascolarctobacterium、Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus(所占比例之和為24.93%)；產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群Petrimonas與Syntrophomonas(所占比例之和為34.89%)；產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta(3.44%)及可耐受工業(yè)廢水毒害的微生物菌群Levilinea、Longilinea與Thermovirga(所占比例之和為14.62%).由多種功能菌群組成厭氧顆粒污泥群落結(jié)構(gòu)，可有效地完成高濃度檸檬酸廢水處理及抵抗有害物質(zhì)對(duì)微生物的毒害作用.

3結(jié)論

1)厭氧顆粒污泥可揮發(fā)性懸浮固體濃度(VSS)所占比例較高(0.611)，大部分顆粒粒徑在1.0～4.0 mm(74.4%).ESEM顯示顆粒污泥中存在大量直徑約1 μm的球形細(xì)菌；EDS結(jié)果表明C、O、Ca、P、N、Fe、S這7種元素所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高.

2)高通量測(cè)序獲得8 397條有效序列，可劃分操作分類單元(OTU)873個(gè)，Alpha多樣性指數(shù)顯示樣品文庫(kù)覆蓋率為0.936，Shannon指數(shù)為4.376，而ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)分別為3 415.51與2 246.51，各自對(duì)應(yīng)的曲線趨向平坦，反映出顆粒污泥中微生物多樣性與豐富度均較高.

3)厭氧顆粒污泥功能菌群包括4大類，分別為有機(jī)物水解發(fā)酵菌群Paludibacter、Parabacteroides、Erysipelotrichaceae、Clostridium、Phascolarctobacterium、Aminobacterium、Saccharofermentans與Alkaliflexus(所占比例之和為24.93%)；產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群Petrimonas與Syntrophomonas(所占比例之和為34.89%)；產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta(3.44%)及可耐受工業(yè)廢水毒害的微生物菌群Levilinea、Longilinea與Thermovirga(所占比例之和為14.62%).

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(編輯劉彤)

doi：10.11918/j.issn.0367-6234.2016.08.019

收稿日期:2015-07-26

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(51408293);中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目(2014M562114);湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(14B154)

作者簡(jiǎn)介:曾濤濤(1985—)，男，博士，講師; 謝水波(1964—)，男，教授，博士生導(dǎo)師

通信作者:謝水波，xiesbmr@263.net

中圖分類號(hào):X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0367-6234(2016)08-0115-06

Analysis of bacterial community in anaerobic granular sludge for citric acid wastewater treatment

ZENG Taotao1,2, LIAO Wei2, XIE Shuibo2,3, RONG Lishan2, LI Shiyou2, JIANG Xiaomei2, MA Hualong2

(1.Postdoctoral Research Centre of Mining Engineering，University of South China, Hengyang 421001,Hunan,China；2.Hunan Province Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse Technology(University of South China), Hengyang 421001, Hunan,China；3.Key Discipline Laboratory for National Defence for Biotechnology in Uranium Mining and Hydromentallurgy (University of South China), Hengyang 421001, Hunan,China)

Abstract:To clarify the performance of functional microorganisms involved in biological citric acid wastewater treatment systems, bacterial community structure of anaerobic granular sludge was investigated in an internal circulation (IC) anaerobic reactor treating citric acid industry wastewater. Microstructure observation was carried out by environmental scanning electron microscope (ESEM), and the microbial diversity and microfloras were analyzed by high-throughput sequencing. Particle size distribution results showed that the most particles’ diameters ranged from 1.0 mm to 4.0 mm (accounted for 74.4%). ESEM results showed that spherical bacteria were the dominant microorganisms in granular sludge. The total dataset comprised 8 397 high quality sequences, which could be subdivided into 873 operational taxonomic units. A library coverage of 0.936 implied that the granular sludge exhibited a high microbial diversity and abundance. The Shannon index, ACE index and Chao1 index were 4.376, 3 415.51 and 2 246.51, respectively. Genus classification revealed that there were four typical bacterial groups: hydrolytic fermentative bacteria for organic matter degradation were closely related to Paludibacter, Parabacteroides, Erysipelotrichaceae, Clostridium, Phascolarctobacterium, Aminobacterium, Saccharofermentans and Alkaliflexus, which accounted 24.93% of the bulk bacterial; H2-producing and acetogenic bacteria were correlated with Petrimonas and Syntrophomonas, which accounted for 34.89%; methanogens of Methanosaeta accounted 3.44%; and the microflora groups of Levilinea, Longilinea and Thermovirga could be capable of tolerating toxic industrial wastewater, accounting for 14.62% instead.

Keywords:anaerobic granular sludge; microbial community; high-throughput sequencing; citric acid wastewater