獨(dú)龍江水生絲孢菌資源調(diào)查*

王如瀟，李 卓，羅宗龍，保旦鳳，蘇錫鈞，蘇鴻雁

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,云南 大理 671003)

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獨(dú)龍江水生絲孢菌資源調(diào)查*

王如瀟1，李 卓2，羅宗龍2，保旦鳳2，蘇錫鈞2，蘇鴻雁2

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,云南 大理 671003)

目的：調(diào)查獨(dú)龍江水生絲孢菌資源，了解其多樣性特征。方法：從獨(dú)龍江中段(海拔1285-1692m)采集沉水腐木90份，采用保濕培養(yǎng)法對(duì)水生絲孢菌進(jìn)行培養(yǎng)，基于形態(tài)學(xué)特征對(duì)水生絲孢菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果：通過(guò)形態(tài)學(xué)特征比較，共鑒定出水生絲孢菌38屬49種。結(jié)論：獨(dú)龍江水生絲孢菌資源豐富，多樣性指數(shù)為3.56，其中Sporidesmiella(20%)、Ellisembia(8.9%)、Helminthosporium(6.7%)、Minimelanolocus(5.6%)的出現(xiàn)頻率相對(duì)較高。

獨(dú)龍江；水生絲孢菌；多樣性；沉水腐木

1.前言

水生真菌(Freshwater fungi)是指整個(gè)或部分生活史依賴于水環(huán)境的真菌[1]。Shearer認(rèn)為必須依靠水環(huán)境才能完成其整個(gè)生活史的真菌是水生真菌[2]。水生絲孢菌是水生真菌的主要類群之一，在分類學(xué)上屬于子囊菌和擔(dān)子菌的無(wú)性型[3]，是一類菌絲體發(fā)達(dá)，呈絮狀或絨狀，有絲分裂產(chǎn)孢的真菌[4]。水生絲孢菌可分為三個(gè)類群：Ingoldian水生真菌、木生水生真菌和好養(yǎng)水生真菌[5]。

水生真菌是一類珍貴的生物資源，與人類的生活息息相關(guān)，是水生生態(tài)環(huán)境中的重要分解者[6]。它有利于維持水生態(tài)的平衡，在自然生態(tài)系統(tǒng)中木質(zhì)素、纖維素的降解、物質(zhì)循環(huán)以及能量轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要的作用[7]，而且真菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的菌絲可以成為水體中動(dòng)物的食物從而進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈[8—11]。由于水生絲孢菌對(duì)污染物質(zhì)敏感，且只能生活在潔凈的水環(huán)境中，所以這種特性可以使其作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的指示菌[6]。在醫(yī)藥和農(nóng)藥研發(fā)等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用前景和重要的研究意義[12]。

Ingold最早報(bào)道了淡水中的絲孢菌[13]，而且在隨后的研究中，Ingold 報(bào)道了大量的水生絲孢菌[14—15]。我國(guó)對(duì)水生真菌的研究開始于20世紀(jì)80年代，最初是楊發(fā)蓉等在云南滇池、洱海做的一些研究報(bào)道[16—17]。直到2000年，云南大學(xué)張克勤、蔡磊等人才開始對(duì)云南地區(qū)水生真菌進(jìn)行研究[18]。2004年，羅晶等對(duì)中國(guó)水生真菌進(jìn)行了系統(tǒng)的研究并對(duì)中國(guó)發(fā)表的水生真菌各類群進(jìn)行了詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)[19]。2011年，陳燕等發(fā)表了水生絲孢菌新紀(jì)錄[20]，2012年胡殿明等報(bào)道西雙版納5新種[21]，截止到2013年，中國(guó)已經(jīng)報(bào)道水生絲孢菌416種[22]。2015年蘇鴻雁等報(bào)道大理蒼山溪流1新種[23]，劉曉英等報(bào)道蒼山水生真菌4新種[24]。

滇西北橫斷山區(qū)是中國(guó)三大特有物種分化中心之一，其生物多樣性保護(hù)具有極其特殊的地位和價(jià)值[35]。獨(dú)龍江位于滇西北地區(qū)，由于獨(dú)龍江與金沙江、瀾滄江、怒江在橫斷山區(qū)形成由北向南的并流奇觀，故有人將它稱為三江并流區(qū)的“第四江”[26]。獨(dú)龍江受西南季風(fēng)及地貌特征的影響，氣候溫和，降水充沛，年均降雨量為3672.8mm左右[27]，且該區(qū)內(nèi)森林覆蓋率高，生物多樣性豐富，素有 “物種基因庫(kù)”之稱[28]。獨(dú)龍江的自然條件獨(dú)特多樣，是一個(gè)獨(dú)特的地理單元[29]，而且獨(dú)龍江又擁有最完整的原始生態(tài)，這種特殊的生態(tài)環(huán)境和植被環(huán)境極有可能孕育了該地區(qū)豐富的水生絲孢菌物種多樣性。本實(shí)驗(yàn)擬采集獨(dú)龍江中段上、中、下游沉水腐木進(jìn)行觀察，目的是了解該地區(qū)水生絲孢菌物種的多樣性，為以后的科研提供一定的數(shù)據(jù)參考，并對(duì)獨(dú)龍江的水生絲孢菌物種多樣性進(jìn)行保護(hù)。

2.實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 樣品采集

2015年5月，沿獨(dú)龍江中段(海拔1285m—1692m)岸邊，從下游往上游隨機(jī)采集長(zhǎng)期(3個(gè)月以上)浸泡在溪水中的沉水腐木。一般選擇表皮脫落，指甲掐壓時(shí)松軟的木頭，直徑1—5cm、長(zhǎng)20—30cm的沉水腐木。共采集5個(gè)樣點(diǎn)，采集樣品數(shù)為90，放在自封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，并在袋子上標(biāo)記采集信息(表1)。

表1 采樣點(diǎn)地理信息

2.2 培養(yǎng)基的配制

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，蒸餾水加至1000mL[30]。

WA培養(yǎng)基：瓊脂18g，蒸餾水加至1000mL[30]。

MEA培養(yǎng)基：麥芽浸膏30g，大豆蛋白胨3g，瓊脂18g，蒸餾水加至1000mL[31]。

以上培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121℃, 20min)后冷卻至50℃(以不燙手為宜)時(shí)加入終濃度為100μg/mL氨芐青霉素混勻，倒入平板備用。

2.3 保濕培養(yǎng)

將采集的樣品裝在塑料自封袋后帶回實(shí)驗(yàn)室，采用保濕培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。室溫條件下，將已滅菌的吸水紙置于已消毒的保鮮盒底部用無(wú)菌水噴濕，然后放置2—4根適量長(zhǎng)度的塑料吸管作為支桿以保證樣品不與底部接觸，將樣品放于支桿上，適當(dāng)蓋上蓋子，但不密閉，以防止樣品發(fā)霉，將保鮮盒放于無(wú)陽(yáng)光直射的地方室溫培養(yǎng)即可。培養(yǎng)一周后開始觀察，期間根據(jù)需要向保鮮盒內(nèi)實(shí)時(shí)添加適當(dāng)無(wú)菌水，保持樣品的濕潤(rùn)，樣品可培養(yǎng)觀察1—3個(gè)月。

2.4 鏡檢

在GL-99BI連續(xù)變倍體視鏡下觀察水生絲孢菌子實(shí)體的外部形態(tài)，并用大頭針在相應(yīng)的地方做好標(biāo)記，對(duì)所觀察到的絲孢菌用Nikon-SMZ1000進(jìn)行外部形態(tài)拍照。用接種針將腐木上的菌體挑出，以無(wú)菌水、甘油等作為浮載劑，對(duì)所觀察到的真菌進(jìn)行制片，將制備好的絲孢真菌玻片置于普通顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果菌株各部分形態(tài)特征較好，將該片子置于OLYMPUS BX51生物顯微鏡下進(jìn)行微觀拍攝。

2.5 拍照及拼圖

每個(gè)菌種至少拍攝30個(gè)分生孢子及5—10個(gè)完整的分生孢子梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及其他特征。在拍攝完成后需要詳述各部分形態(tài)特征，并選取能真實(shí)反映菌種典型特征的各個(gè)結(jié)構(gòu)圖片用Photoshop軟件進(jìn)行拼圖，包括菌種的外形、微觀下的完整形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子、萌發(fā)的分生孢子和純培養(yǎng)等。

2.6 菌種的分離純化

在GL-99BI連續(xù)變倍體式鏡下鎖定目標(biāo)菌株，用無(wú)菌牙簽將分生孢子挑取下來(lái)，轉(zhuǎn)移到PDA或WA平板上，保證每皿至少有5—7個(gè)分生孢子。室溫培養(yǎng)，24h后進(jìn)行觀察，將萌發(fā)的分生孢子轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基或MEA培養(yǎng)基上，用保鮮膜封口，室溫培養(yǎng)，另挑取萌發(fā)的孢子制片，用OLYMPUS BX51顯微鏡拍照，以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，定期檢查菌落的生長(zhǎng)情況，若發(fā)現(xiàn)污染需要及時(shí)轉(zhuǎn)接純化。

2.7 菌株鑒定

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[31—36]，通過(guò)比較分生孢子梗、產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征以及分生孢子的形成方式、形狀大小、顏色、分隔、有無(wú)附屬物等特征將其鑒定到屬、種。

2.8 菌種的保存

MEA斜面試管保存：將目的菌株移置于MEA試管斜面上，適溫下培養(yǎng)至菌體充分生長(zhǎng)(至少兩周)，然后存放于4°C清潔冰箱中，整個(gè)過(guò)程需無(wú)菌操作。該方法需要每隔3—6個(gè)月移植1次，而且培養(yǎng)基容易干燥，菌體活力散失快，因此該方法只適合短期保存。

無(wú)菌水離心管保存：將目的菌株置于盛有無(wú)菌水的離心管中，密封后存于4°C清潔冰箱中，每一種菌均分裝于3—5個(gè)離心管中，整個(gè)過(guò)程需無(wú)菌操作。該方法適宜長(zhǎng)期保存，可使菌種存活多年。

甘油保存：15%甘油，85%蒸餾水，將培養(yǎng)好的菌種置于盛有甘油無(wú)菌水的離心管中，密封后存放于4°C清潔冰箱中，每一種菌均分裝于3—5個(gè)離心管，整個(gè)過(guò)程需無(wú)菌操作，該方法一般每隔1年轉(zhuǎn)接一次，可保存2—3年。

2.9 干標(biāo)本制作

在GL-99BI連續(xù)變倍體式鏡下鎖定真菌子實(shí)體，用大頭針在相應(yīng)的地方做好標(biāo)記，再用小刀將生長(zhǎng)有真菌子實(shí)體的小塊木片(約3×3厘米大小)切割下來(lái)。將切割下來(lái)的小塊木片用膠水粘貼在一張12×8厘米大小的白紙上，放在空氣中風(fēng)干，并對(duì)其編號(hào)。風(fēng)干后的干標(biāo)本放入信封中，放一個(gè)樟腦丸，長(zhǎng)期保藏。

2.10 數(shù)據(jù)分析

水生絲孢菌出現(xiàn)頻率(%)=(某個(gè)種出現(xiàn)次數(shù)/樣品總數(shù))×100%

采用香農(nóng)-威納指數(shù)(H)分析獨(dú)龍江水生絲孢菌的多樣性[37]。Shannon Wiener指數(shù)為：

其中H是香農(nóng)-威納指數(shù)，Ni是某種真菌的數(shù)量，N是所有真菌的數(shù)量，Pi是某種真菌的數(shù)量占所有真菌數(shù)量的百分比，S是所有真菌的種數(shù)。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究從獨(dú)龍江中段采集沉水腐木90份，采用保濕培養(yǎng)法對(duì)樣品進(jìn)行培養(yǎng)，基于形態(tài)學(xué)對(duì)所獲得的所有水生絲孢菌進(jìn)行鑒定，共鑒定出水生絲孢菌38屬49種，其中出現(xiàn)頻率相對(duì)較高的屬為Sporidesmiella(20%)、Ellisembia(8.9%)、Minimelanolocus(6.7%)、Helminthosporium(5.6%)(表2),采用香農(nóng)-威納指數(shù)計(jì)算得出獨(dú)龍江多樣性指數(shù)是：3.56。

表2 獨(dú)龍江已鑒定的水生絲孢菌的屬級(jí)出現(xiàn)頻率

(注：檢出率為該物種在所有樣品中的出現(xiàn)頻率。)

4.討論

2007年，Shearer等預(yù)測(cè)淡水中含有大量的水生真菌有待研究發(fā)現(xiàn)[38]。獨(dú)龍江位于滇西北地區(qū)，滇西北橫斷山區(qū)是中國(guó)三大特有物種分化中心之一，是中國(guó)生物多樣性的中心[25]。本研究對(duì)獨(dú)龍江中段的90份樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)形態(tài)學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，共鑒定出水生絲孢菌38屬49種，其中Sporidesmiella(20%)、Ellisembia(8.9%)、Minimelanolocus(6.7%)、Helminthosporium(5.6%)，為獨(dú)龍江常見屬，獨(dú)龍江水生絲孢菌的香農(nóng)-威納指數(shù)(H)為：3.56，這一結(jié)果表明獨(dú)龍江的水生絲孢菌物種豐富，多樣性較高，這與Shearer等的預(yù)測(cè)一致。

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(責(zé)任編輯 徐成東)

InvestigationontheResourcesofFreshwaterHyphomycetesoftheDulongRiver

WANGRuxiao,LIZhuo,LUOZonglong,BAODanfeng,SUXijun&SUHongyan

(College of Basic Medicine, Dali University, Dali, 671000, Yunnan Province; College of Agriculture & Biology Sciences, Dali University, Dali, 671003, Yunnan Province)

Objective:ToinvestigatediversityandresoursesofhyphomycetesinDulongRiver.Method: 90sampleswerecollectedfrommiddleofDulongRiver(Altitude1285m-1692m)inMay2015,usingthemoisturizingincubationmethodtoincubatethefreshwaterhyphomycetesandidentifiedthemunderthemorphologicalcharacters.Results:Underthemorphologicalcharacters,theinvestigationindicatedthatthereare38genera49speciesofhyphomycetes.Conclusion:TherearehighrichnessanddiversityoffreshwaterhyphomycetesinDulongRiver.Theindexofdiversityis3.56.Amongthegenerafoundinthisarea, Sporidesmiella(20%)、 Ellisembia(6.7%)、Helminthosporium(6.7%)、Minimelanolocus(5.6%)appearshighfrequencyrelatively.

DulongRiver;Hyphomycetes;Diversity;submergeddecayedwood

國(guó)家基金，項(xiàng)目編號(hào)：31460015；云南省中青年學(xué)術(shù)帶頭人資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2012HB-042。

2016 - 05 - 15

王如瀟，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锛凹膊　?/p>

蘇鴻雁(1968—)，女，教授，從事菌物學(xué)研究。

Q949.3

A

1671 - 7406(2016)06 - 0026 - 06