藍(lán)莓酒渣中多酚提取工藝的研究

劉文靜，徐婉蒙，王成玉，李丹丹，王超，郭德軍，阮長(zhǎng)青

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.九三集團(tuán)天津大豆科技有限公司）

藍(lán)莓酒渣中多酚提取工藝的研究

劉文靜1，徐婉蒙1，王成玉1，李丹丹1，王超2，郭德軍1，阮長(zhǎng)青1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319；2.九三集團(tuán)天津大豆科技有限公司）

為充分利用藍(lán)莓酒渣中的多酚資源，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用溶劑提取法對(duì)藍(lán)莓酒渣中多酚的提取工藝進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，藍(lán)莓酒渣中多酚的最優(yōu)提取工藝為：提取劑0.1%鹽酸的60%乙醇水溶液，料液比1∶40（g∶mL），提取溫度80℃，提取時(shí)間3 h。此條件下藍(lán)莓酒渣中多酚提取量為8.89 mg·g-1，粗提取物得率22.1%，總酚純度為5.69%。為藍(lán)莓酒渣的利用及生物活性成分研究提供了依據(jù)。

藍(lán)莓；酒渣；多酚；提取

藍(lán)莓是杜鵑花科的越橘屬植物，起源于北美，多年常綠灌木或生落葉。我國(guó)野生藍(lán)莓資源豐富，主要分布在東北、華北、西南等地區(qū)，大興安嶺地區(qū)年產(chǎn)量10～20萬(wàn)t［1］。藍(lán)莓中含有豐富的維生素，蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，每100 g新鮮藍(lán)莓中含有花色苷100～200 mg，多酚類物質(zhì)400～500 mg［2］，具有保護(hù)視力、防止腦神經(jīng)老化、預(yù)防癌癥、軟化血管、增強(qiáng)人體免疫力以及很強(qiáng)的抗氧化性等多種功效［3-4］。

藍(lán)莓酒加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的酒渣，通常被當(dāng)作廢棄物處理。其中富含酚酸、黃烷醇、花色苷等生物活性成分［5-7］，探究酒渣中包含上述成分的各種多酚類物質(zhì)，研究其成分以及抗氧化等生物活性，開(kāi)發(fā)新型天然食品成分，是藍(lán)莓酒生產(chǎn)企業(yè)急需解決的問(wèn)題。王超等［8］關(guān)于野生藍(lán)莓酒渣中花色苷的提取方法及抗氧化活性的研究，為藍(lán)莓酒渣中其他活性成分的深入研究提供了參考。

現(xiàn)以野生藍(lán)莓酒渣為原料，對(duì)多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，望為藍(lán)莓酒渣中多酚的生物活性研究及開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生藍(lán)莓酒渣，野生藍(lán)莓釀酒后廢棄酒渣，40℃干燥，粉碎，過(guò)60目篩，4℃冷藏備用。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.0%，中科院成都生物研究所；Follin-Ciocalteu試劑，Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHA-C型水浴恒溫振蕩器，榮華儀器制造有限公司；722s型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海博通化學(xué)科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；ALPHA1-2 LD plus型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓酒渣中多酚的提取方法

藍(lán)莓酒渣經(jīng)40℃干燥至恒重，粉碎，過(guò)篩（60目），4℃冷藏備用。取一定量干燥的酒渣粉在不同濃度鹽酸-乙醇水溶液、不同料液比、提取溫度及時(shí)間下，水浴振蕩（200 r·min-1）提取，抽濾，濾液備用。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.3.2 多酚的測(cè)定

采用Follin-Ciocalteu比色法測(cè)定樣品中多酚含量［9-10］，略加改動(dòng)，方法如下：分別取0、1、2、3、4、5 mL 0.1 mg·mL-1沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，酒渣提取液稀釋一定倍數(shù)，各加2 mL 0.2 mol·L-1Follin-Ciocalteu試劑，搖勻，4 min后，加入2 mL 7.5%Na2CO3溶液，定容，混合，避光反應(yīng)2 h后在760 nm波長(zhǎng)下，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測(cè)定吸光值（A），繪制吸光值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)做試劑空白。藍(lán)莓酒渣中多酚提取量按式（1）計(jì)算。

在優(yōu)化的提取條件下，將提取物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至盡干，洗滌、轉(zhuǎn)移至表面皿中凍干，稱重，為提取物的質(zhì)量（m1），按上述方法測(cè)定并計(jì)算其中多酚的質(zhì)量（m2），按式（2）、（3）分別計(jì)算提取物中多酚的得率及純度。

式中，C：藍(lán)莓酒渣中多酚提取量（mg·g-1）；A、A0：樣液、試劑空白液的吸光值；V：提取液體積；f：稀釋倍數(shù)；k：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；m0：藍(lán)莓酒渣質(zhì)量（g）；m1：多酚提取物質(zhì)量（g）；m2：提取物中多酚的質(zhì)量（g）；Y：藍(lán)莓酒渣中多酚的得率（%）；P：提取物中多酚的純度（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

系列濃度沒(méi)食子酸溶液與Follin-Ciocalteu試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，反應(yīng)液吸光值（A）與濃度（c）的線性方程為A=9.731 7c-0.027 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，濃度線性范圍：0.02～0.10 mg·mL-1，吸光值范圍：0.173～0.940。

2.2 乙醇濃度對(duì)多酚提取的影響

用含0.2%鹽酸的0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇水溶液，料液比1∶20，30℃水浴振蕩（200 r·min-1）1 h，乙醇濃度對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)藍(lán)莓酒渣中多酚提取的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of polyphenols in blueberry wine pomace

由圖1可知，在乙醇濃度為0%～60%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，多酚提取量呈增加趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，提取量最大。當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，多酚提取量呈下降趨勢(shì)。乙醇濃度過(guò)高時(shí)會(huì)溶出較多的醇溶性色素、雜質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分，這些成分可與多酚形成氫鍵，同時(shí)高濃度提取液會(huì)導(dǎo)致組織的通透性下降，導(dǎo)致多酚提取量下降［11］。提取液濃度為40%、60%時(shí)，總酚提取量差異無(wú)顯著意義（P>0.05），因此，選擇濃度40%乙醇水溶液為提取劑進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。

2.3 鹽酸的濃度對(duì)多酚提取的影響

分別以含0.00%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%鹽酸的40%乙醇水溶液為提取劑，料液比1∶20，30℃水浴振蕩（200 r·min-1）1 h，鹽酸濃度對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 鹽酸濃度對(duì)藍(lán)莓酒渣中多酚提取的影響Fig.2 Effect of hydrochloric acid concentration on extraction of polyphenols in blueberry wine pomace

由圖2可知，以不同濃度的鹽酸-40%乙醇水溶液為提取劑時(shí)，鹽酸濃度的變化對(duì)多酚提取量的影響較小，變化規(guī)律并不明顯（P＞0.05），但少量的酸利于花色素的的溶出［12］，有利于多酚的提取及穩(wěn)定。因此，選擇濃度為含0.1%鹽酸的40%乙醇水溶液為提取劑進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。

2.4 料液比對(duì)多酚提取的影響

以含0.1%鹽酸的40%乙醇水溶液為提取劑，料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL），30℃水浴振蕩（200 r·min-1）1 h。料液比對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)藍(lán)莓酒渣中多酚提取的影響Fig.3 Effect of material-solvent ratio on extraction of polyphenols in blueberry wine pomace

由圖3可知，多酚提取量隨料液比的增加而提高。其中在料液比1∶40時(shí)達(dá)到較高值，之后趨于平緩。這是因?yàn)槿軇┯昧康脑黾舆_(dá)一定程度，多酚的溶出近于飽和，提取量不再增加；此外，溶劑用量較大時(shí)，體系振蕩過(guò)程中溶劑含氧量增加，多酚易于被氧化，從經(jīng)濟(jì)角度考慮料液比增大會(huì)提高提取劑成本［13］。因此，選擇料液比為1∶30進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。

2.5 時(shí)間對(duì)多酚提取的影響

以含0.1%鹽酸的40%乙醇水溶液為提取劑，料液比為1∶30（g∶mL），30℃水浴振蕩（200 r·min-1）。提取時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓酒渣中多酚提取的影響Fig.4 Effect of time on extraction of polyphenols in blueberry wine pomace

由圖4可知，在提取時(shí)間1～4 h范圍內(nèi)，隨時(shí)間的增加，多酚提取量呈增加趨勢(shì)，4 h時(shí)提取量最大，此后，開(kāi)始降低。這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)多酚充分溶解于溶劑中，使多酚提取量增加。而4 h后使多酚提取量降低可能有兩方面原因，一方面可能是提取時(shí)間的增加引起藍(lán)莓酒渣細(xì)胞基質(zhì)中的其他組分的溶出量的增加，使溶劑的粘度變大，溶質(zhì)中總酚的輸出速率受到阻礙而減??；另一方面原因可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)因溫度的影響使多酚的分子結(jié)構(gòu)破壞［14］，例如被氧化成醌類化合物，從而使多酚提取量下降。提取2 h與4 h時(shí)，提取量相差不大，因此，選擇提取時(shí)間為2 h進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)。

2.6 溫度對(duì)多酚提取的影響

以含0.1%鹽酸的40%乙醇水溶液為提取劑，料液比1∶30（g∶mL），水浴振蕩（200 r·min-1）2 h。提取溫度對(duì)多酚提取量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)藍(lán)莓酒渣中多酚提取的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction of polyphenols in blueberry wine pomace

由圖5可知，隨著溫度的升高，多酚提取量在30℃～80℃之間逐漸上升，80℃達(dá)到最大（9.03 mg·kg-1），此后明顯下降。這是由于升高溫度能提高總酚的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，利于細(xì)胞破碎、提高細(xì)胞膜的通透性。但過(guò)高的溫度會(huì)加速多酚的氧化，降低總酚含量［15-16］。

2.7 提取工藝的正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)多酚影響較大的乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間和料液比4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L43（9）正交試驗(yàn)，優(yōu)化藍(lán)莓酒渣中多酚的提取工藝。因素水平設(shè)計(jì)及結(jié)果分別見(jiàn)表1、表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factor and level of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)直觀分析Table 2 Intuitive analysis of orthogonal experiment

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

由表2可知，影響藍(lán)莓渣多酚提取量的因素依次為有乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比，提取時(shí)間最佳工藝條件為A2B3C3D3，即最佳提取工藝為乙醇濃度60%、提取溫度80℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶40。在此條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，提取量為8.89±0.08 mg·g-1。

2.8 藍(lán)莓酒渣多酚粗提物得率和總酚純度

在上述條件下，將提取液濃縮、凍干后，根據(jù)公式（2）計(jì)算出提取液粗提物得率為22.1%，根據(jù)公式（3）計(jì)算出多酚純度為5.69%。安曉婷報(bào)道的藍(lán)莓果渣多酚在AB-8樹(shù)脂純化前純度為11.05%［17-18］，高于試驗(yàn)獲得的多酚產(chǎn)品純度，是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中多酚的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)［7］，酒渣中多酚含量較低；另外，因發(fā)酵工藝的需要，提取物中可能含有一定量可溶于60%乙醇的蔗糖及發(fā)酵后的單糖等產(chǎn)物，導(dǎo)致其凍干后的固體中多酚純度較藍(lán)莓果渣提取物中多酚低。

3 結(jié)論

藍(lán)莓酒渣中多酚在醇溶液中的溶解性比較好，在酸性條件下較穩(wěn)定，以藍(lán)莓酒渣為原料提取多酚的優(yōu)化工藝為：以含0.1%鹽酸的60%乙醇水溶液為提取劑，料液比1∶40（g∶mL），80℃提取3 h。此時(shí)藍(lán)莓酒渣中多酚提取量為8.89 mg·g-1，提取物得率為22.1%，提取物多酚純度為5.69%。

藍(lán)莓酒渣中多酚提取的方法研究，能夠?yàn)橄乱徊介_(kāi)展藍(lán)莓多酚的純化提供原料和技術(shù)支持，為藍(lán)莓酒渣中生物活性成分的基礎(chǔ)研究提供指導(dǎo)。對(duì)于拓展藍(lán)莓鮮果資源的綜合利用領(lǐng)域，減少?gòu)U物排放，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，具有一定的應(yīng)用意義。

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Extraction Process of Polyphenols from Blueberry W ine Pomace

Liu W enjing1，Xu W anmeng1，W ang Chengyu1，Li Dandan1，W ang Chao2，Guo Dejun1，Ruan Changqing1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Jiusan Group Tianjin Soybean Science and Technology Company Limited）

To take full advantage of polyphenols resources in blueberry wine pomace，solvent extraction process of polyphenols from blueberry wine pomace was studied on the basis of single factor test.The results showed that the optimum extraction process of polyphenols in blueberry wine pomace included 60%ethanol aqueous solution containing 0.1%hydrochloric acid as extraction solvent，solid-liquid ratio of 1∶40（g∶mL），extraction temperature of 80℃，and extraction time of 3 hours.Under these conditions，the extraction amount of polyphenols was 8.89 mg·g-1，the yield of crude extract was 22.1%and total phenols purity was 5.69%.It provided the basis for the research and utilization of bioactive constituents in blueberry wine pomace.

blueberry；wine pomace；polyphenols；extraction process

TS261.9

A

1002-2090（2016）03-0082-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.017

2015-06-03

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410223012）；黑龍江省農(nóng)墾總局科技局技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目（HNK13KF-15-01）。

劉文靜（1992-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與工程專業(yè)2011級(jí)本科生。

阮長(zhǎng)青，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：cqruan@163.com。