金雀異黃素對(duì)圍絕經(jīng)期模型小鼠卵巢組織及其安全性的影響

張明玉，遲曉星，丁嘯宇，錢麗麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

金雀異黃素對(duì)圍絕經(jīng)期模型小鼠卵巢組織及其安全性的影響

張明玉，遲曉星，丁嘯宇，錢麗麗

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

通過(guò)建立圍絕經(jīng)期小鼠模型，觀察金雀異黃素（Gen）對(duì)卵巢組織及安全性的影響。選用50只11～12月齡雌性ICR小鼠，按體重隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、高、中、低劑量組（15、30、60 mg·kg-1Gen灌胃）。采用ELISA法測(cè)小鼠卵巢組織中Bcl-2與Bax蛋白水平，對(duì)小鼠重要臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示小鼠體重及重要臟器無(wú)明顯變化，高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組Bax蛋白下降明顯（P＜0.05）。揭示實(shí)驗(yàn)劑量下Gen對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠重要臟器及體重?zé)o明顯影響，可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax蛋白水平來(lái)保護(hù)卵巢細(xì)胞。

金雀異黃素；圍絕經(jīng)期模型小鼠；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

圍絕經(jīng)期包括即將絕經(jīng)前的時(shí)期和絕經(jīng)后的第1年，其本質(zhì)是卵巢功能動(dòng)態(tài)衰退的過(guò)程，包括卵巢儲(chǔ)備加速下降和生殖激素波動(dòng)性變化，表現(xiàn)為月經(jīng)模式改變、生育能力下降、絕經(jīng)癥狀逐漸出現(xiàn)、發(fā)生各種慢性疾病的危險(xiǎn)性逐漸上升［1-2］，卵巢功能減退引起的內(nèi)分泌紊亂是導(dǎo)致圍絕經(jīng)期綜合征發(fā)生的主要原因［3］。近年來(lái)圍絕經(jīng)期綜合征有發(fā)病率上升、發(fā)病年齡提早的趨勢(shì)，由于病程纏綿、反復(fù)發(fā)作，給廣大圍絕經(jīng)期婦女的學(xué)習(xí)和工作造成了危害和痛苦，目前已成為影響婦女健康的嚴(yán)重問(wèn)題。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外一直采用激素替代療法治療圍絕經(jīng)期綜合征，雖然取得了一定療效［4］，但由于可能導(dǎo)致某些婦科腫瘤的患病幾率增加，甚至具有致癌的潛在危險(xiǎn)，因此尋求更安全有效的雌激素替代藥物，已成為當(dāng)前圍絕經(jīng)期綜合征防治工作的首要任務(wù)。

植物雌激素在人類飲食中主要體現(xiàn)在豆類及其制品中的異黃酮。金雀異黃素是大豆異黃酮中活性較強(qiáng)的主要成分，主要以游離型苷元和結(jié)合型糖苷的形式存在［5］。在富含豆肽的多種天然植物中含量較多，其抗氧化、類雌激素、抗腫瘤、影響骨代謝及心血管系統(tǒng)等作用已受到國(guó)內(nèi)外的重視［6-7］。金雀異黃素分子結(jié)構(gòu)與人體自身雌激素相同，能與雌激素受體結(jié)合，這種結(jié)合力雖然很低，活性只有內(nèi)源雌激素的千分之一，但進(jìn)入人體后可完全與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素的作用［8］，在生物體內(nèi)可產(chǎn)生典型的雌激素反應(yīng)［9］。對(duì)于不同組織，還可產(chǎn)生與雌激素相拮抗的作用，具有雌激素表達(dá)雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)，至于表現(xiàn)為何種活性主要取決于其局部濃度、內(nèi)源性雌激素含量以及組織器官的ERs水平［10］。除了研究金雀異黃素對(duì)圍絕經(jīng)期女性的有益作用之外，還要考慮其安全性問(wèn)題，因此研究通過(guò)建立圍絕經(jīng)期小鼠模型，以金雀異黃素為受試物，觀察金雀異黃素對(duì)小鼠體重、重要臟器、卵巢組織中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影響，探討金雀異黃素對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

金雀異黃素：分子式C15H1005，分子量270.23，溶解性：溶于DMSO、甲醇，幾乎不溶于水。上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度＞98%；戊酸雌二醇：拜耳醫(yī)藥保健有限公司，每片1 mg；羧甲基纖維素鈉；酶標(biāo)儀：澳大利亞TECAN公司；小鼠酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒：上海史瑞可科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

雌性ICR小白鼠50只，11～12月齡［11］，體重35± 10 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供（SPF級(jí)）。根據(jù)體重隨機(jī)分組，把小白鼠分成5組，每組10只，分別為對(duì)照組、雌激素組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。

1.3 圍絕經(jīng)期小鼠模型建立與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

SAFD飼料配方：富含GEN和紫花苜蓿成分由玉米、小麥和酪蛋白代替，以突出處理因素（GEN）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

金雀異黃素不溶于水，用羧甲基纖維素鈉助溶。對(duì)照組（Control group）：0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃；低劑量組（Low dose group）：Gen 15 mg·kg-1灌胃；中劑量組（Middle dose group）：Gen 30 mg·kg-1灌胃；高劑量組（High dose group）：Gen 60 mg·kg-1灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組（Positive control group）：戊酸雌二醇0.5 mg·kg-1灌胃。試驗(yàn)持續(xù)8周。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)與方法

末次給藥后，各組小鼠禁食12 h，不禁水，用電子天平稱重后，斷頭取血，低速離心分離血清-20℃保存，迅速取出兩側(cè)卵巢，液氮凍存。ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠卵巢組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白。用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)450 nm）測(cè)定吸光度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)定指標(biāo)濃度。分別摘取肝臟、脾臟、腎臟、腦、卵巢、子宮稱重。一部分樣品固定，HE染色，切片。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPASS19.0軟件進(jìn)行方差分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重分析

表1 各組小鼠體重測(cè)定結(jié)果（±s，g）（n=10）Table 1 Results of each group of mice weight（xˉ±s，g）（n=10）

表1 各組小鼠體重測(cè)定結(jié)果（±s，g）（n=10）Table 1 Results of each group of mice weight（xˉ±s，g）（n=10）

注：*P＜0.05與對(duì)照組比較顯著。

周數(shù)C-Gen P-Gen H-Gen M-Gen L-Gen 1周43.91±5.64 43.81±3.06 43.78±2.96 43.68±2.48 42.65±2.91 2周38.76±4.54 41.80±2.63 41.10±1.88 39.77±2.91 40.71±3.29 3周35.17±5.44 41.73±2.30 41.55±1.94 43.85±5.07 40.70±4.34 4周31.64±4.00 40.13±2.70 41.01±2.47 40.43±3.40 36.87±4.67 5周30.51±2.97 41.06±3.30 40.66±2.59 39.04±4.39 32.84±5.50 6周30.48±4.01 37.27±2.77 37.80±4.65 34.53±5.81 29.41±2.95 7周29.94±3.61 31.88±4.28 32.66±4.12 32.75±7.70 30.03±3.07 8周29.90±4.28 31.28±3.62 30.45±2.01 32.58±6.71 30.15±4.30*

表1結(jié)果顯示各組小鼠體重生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯差異，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，說(shuō)明金雀異黃素對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。

2.2 小鼠內(nèi)臟/體比結(jié)果

表2結(jié)果表明，與對(duì)照組比較高劑量組小鼠卵巢/體比降低，差異顯著（P＜0.05）與陽(yáng)性對(duì)照組作用相似。

表2 各組小鼠內(nèi)臟/體比測(cè)定結(jié)果（xˉ±s）（n=10）Table 2 Results of mice viscera/body ratio measurement（xˉ±s）（n=10）

2.3 小鼠主要臟器病理檢查結(jié)果

圖1～圖3對(duì)小鼠卵巢、腦和肝臟組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，可以看出各組小鼠的肝臟和腦的病理組織學(xué)檢查都沒(méi)有明顯的病理改變。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠卵巢發(fā)生了明顯的病理學(xué)改變，腺體數(shù)量增多，細(xì)胞呈高柱狀，內(nèi)膜上皮細(xì)胞數(shù)量增多，增生明顯，間質(zhì)疏松。高劑量組小鼠卵巢腺體數(shù)量輕度增多，但不明顯，內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列基本正常，偶爾可見(jiàn)細(xì)胞高度不一，間質(zhì)無(wú)明顯變化。由此可見(jiàn)，在當(dāng)前劑量下，金雀異黃素對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠的重要臟器無(wú)明顯影響。

圖1 小鼠卵巢腺體組織病理學(xué)檢查（A.CG；B.PG C.H-Gen，40×）Fig.1 Histopathological examination of mouse ovary glandular tissue

圖2 小鼠腦組織病理學(xué)檢查（A.CG；B.PG；C.H-Gen，40×）Fig.2 Histopathological examination of mouse brain tissue

圖3 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查（A.CG；B.PG；C.H-Gen，40×）Fig.3 Histopathological examination of mouse liver tissue

2.4 小鼠Bcl-2蛋白、Bax蛋白檢測(cè)結(jié)果

表3可知，中、高劑量GEN可升高小鼠卵巢組織中Bcl-2蛋白水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＞0.05）；各劑量組小鼠卵巢組織中Bax蛋白水平呈下降趨勢(shì)，其中高劑量組和雌激素組下降明顯，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明金雀異黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)促細(xì)胞凋亡蛋白和抗細(xì)胞凋亡蛋白的水平來(lái)保護(hù)卵巢細(xì)胞功能。

表3 各組小鼠卵巢組織Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)結(jié)果（xˉ±s，n=10）（pg·m L-1）Table 3 Expression results of mice ovarian tissue in each group of Bcl-2 and Bax protein（xˉ±s，n=10）（pg·mL-1）

3 討論

（1）金雀異黃素作為一種存在于大豆異黃酮中的活性成分而具有許多生物學(xué)活性，包括能夠與雌激素受體結(jié)合的弱的雌激素樣作用及在藥理作用下能夠抑制蛋白酪氨酸激酶的作用，也被稱為植物雌激素［12］。圍絕經(jīng)綜合征主要是由于卵巢老化，雌激素分泌減少而引起的。實(shí)驗(yàn)以11～12月齡雌性ICR小鼠模擬女性圍絕經(jīng)期階段，以不同濃度的金雀異黃素對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠灌胃，通過(guò)金雀異黃素對(duì)小鼠體重、重要臟器、卵巢組織中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影響作為研究，探討金雀異黃素對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠的安全性。灌胃期間小鼠體重變化及主要臟器病理檢查無(wú)異常變化，證明金雀異黃素在實(shí)驗(yàn)劑量下對(duì)小鼠的正常生長(zhǎng)無(wú)異常影響，與雌激素對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠卵巢的副作用相比，在當(dāng)前劑量下，不會(huì)影響小鼠體重及重要臟器功能，對(duì)小鼠是安全的。

（2）作為許多化學(xué)作用靶器官之一的卵巢，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)與女性性腺和生殖功能密切相關(guān)。圍絕經(jīng)期的本質(zhì)是卵巢功能動(dòng)態(tài)衰退的過(guò)程。Bcl-2蛋白抑制一切生物體細(xì)胞凋亡過(guò)程，它可以在正常細(xì)胞激活和發(fā)展中表達(dá)，也能在成熟組織中表達(dá)，但在凋亡細(xì)胞中表達(dá)量很低甚至無(wú)表達(dá)。Bcl-2在卵巢細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［13］。Bax蛋白是Bcl-2蛋白的同系物，在器官和組織中的分布要比Bcl-2蛋白廣泛，其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)理可能與抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白有關(guān)，后者會(huì)促使Bax蛋白失去促蛋白凋亡的作用［14］。多項(xiàng)資料表明［15-17］，Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制中兩個(gè)非常重要的因子，當(dāng)Bcl-2大量表達(dá)時(shí)，形成Bcl-2同源二聚體，細(xì)胞受到保護(hù)；當(dāng)Bax大量表達(dá)時(shí)，形成Bax同源二聚體，細(xì)胞趨向凋亡。實(shí)驗(yàn)以金雀異黃素為試受藥物，通過(guò)檢測(cè)卵巢組織中Bcl-2和Bax含量以達(dá)到對(duì)圍絕經(jīng)期小鼠安全性的研究。研究結(jié)果表明，高劑量GEN（60 mg·kg-1）可明顯降低促凋亡基因Bax在圍絕經(jīng)期小鼠卵巢組織中的表達(dá)，效果與雌激素相似，提示金雀異黃素對(duì)卵巢功能的保護(hù)作用可能與抑制Bax蛋白表達(dá)，從而抑制卵巢細(xì)胞凋亡有關(guān)。

（3）金雀異黃素是來(lái)源于植物并有與雌激素相似結(jié)構(gòu)的植物雌激素，其雌激素的調(diào)節(jié)作用引起廣泛關(guān)注。目前植物雌激素作為激素替代藥物、抗癌藥物以及食品添加物和補(bǔ)充物應(yīng)用［18］。在研究金雀異黃素與人類健康的關(guān)系時(shí)，從細(xì)胞分子水平、動(dòng)物模型到人體實(shí)驗(yàn)、大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果存在較大的爭(zhēng)議，實(shí)驗(yàn)室中金雀異黃素用量通常遠(yuǎn)高于食物中的含量，且使用的種類、純度、用量、采用的細(xì)胞系以及其他實(shí)驗(yàn)條件等均不盡相同，缺乏統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，給金雀異黃素的研究工作和廣泛應(yīng)用帶來(lái)一定的困難。隨著對(duì)金雀異黃素功能性和營(yíng)養(yǎng)性的深入研究，其提取及精制工藝的不斷完善，金雀異黃素將會(huì)在醫(yī)藥、保健品、食品、飲料及其他行業(yè)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［19］。

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Safety of Genistein Acting on Ovaries of M enopausal M odel M ice

Zhang M ingyu，Chi Xiaoxing，Ding Xiaoyu，Qian Lili
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

According to set up the perimenopausal mice model and observed the impact on ovarian tissue and security，50 female 11～12 months-old ICR mice were chosen to be divided into five groups by weight，each group was control group，positive dose group of high，middle and low dose group（Gen concentration 15，30，60 mg·kg-1），respectively.The levels of Bcl-2 and Bax protein in mice’ovarian tissues were detected by ELISA，and the histopathologic examination of vital organs was carried.The results showed that there was no obvious change in mice weight and vital organs.The level of Bax protein decreased in high dose group and positive dose group，which had a significant difference（P＜0.05）.The revealing Gen had no obvious effects on menopausal transition model mice of important organs and weight，and it could protected the ovarian cells by adjusting Bcl-2 and Bax protein levels.

genistein；perimenopause mouse model；Bcl-2 protein；Bax protein

Q78

A

1002-2090（2016）03-0051-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.011

2015-03-10

農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（大慶）工作站博士后資助課題（LRB13-153）。

張明玉（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2013級(jí)碩士研究生。

遲曉星，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：chixiaoxing@sina.com。