添加乳酸菌和糖蜜對(duì)秸稈生物飼料的發(fā)酵品質(zhì)及In vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成的影響

周亞強(qiáng)，韓雅惠，蔣再慧，馬衍旋，石少磊，孫瑞濤，李悅，韓華，唐德江，侯建軍，曹陽

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江中升牧業(yè)有限公司）

添加乳酸菌和糖蜜對(duì)秸稈生物飼料的發(fā)酵品質(zhì)及In vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成的影響

周亞強(qiáng)1，韓雅惠1，蔣再慧1，馬衍旋1，石少磊1，孫瑞濤1，李悅1，韓華1，唐德江1，侯建軍2，曹陽1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江中升牧業(yè)有限公司）

采用小規(guī)模發(fā)酵法，試驗(yàn)處理包括無添加組（對(duì)照組）、乳酸菌、糖蜜以及乳酸菌和糖蜜共同添加組。30 d后開封，乳酸菌和糖蜜添加組感官評(píng)分良好；乳酸菌、乳酸菌和糖蜜混合添加組的pH低于（P＜0.05）對(duì)照組和糖蜜添加組。4個(gè)處理組的乳酸菌數(shù)量均在106～107（cfu·g-1）以上，3個(gè)添加組未檢出酪酸菌和大腸桿菌，而酵母菌、耐熱菌數(shù)量分別為102～106和103（cfu·g-1）；對(duì)照組中大腸桿菌和酵母菌均為106（cfu·g-1）。糖蜜、乳酸菌以及二者共同添加組的In vitro干物質(zhì)消失率顯著高于對(duì)照組，而只有乳酸菌添加組的瘤胃甲烷生成量低于對(duì)照組。由此可見，添加乳酸菌、糖蜜以及二者混合添加均有助于秸稈發(fā)酵，抑制有害細(xì)菌的生長，能夠得到高品質(zhì)的玉米秸稈生物發(fā)酵飼料，并且添加乳酸菌可以降低秸稈生物飼料的In vitro瘤胃甲烷生成量。

乳酸菌；糖蜜；風(fēng)干玉米秸稈；發(fā)酵品質(zhì)；甲烷

中國是農(nóng)業(yè)大國，玉米作為主要種植的農(nóng)作物，其副產(chǎn)物玉米秸稈資源更為豐富，年產(chǎn)量約2億t［1］。玉米秸稈是有著巨大潛力而尚未被充分開發(fā)利用的飼料資源［2］，玉米秸稈中含有豐富的營養(yǎng)成分，是反芻動(dòng)物粗飼料的主要原料之一。但是，就我國目前的情況來說，被用作飼料的玉米秸稈卻很少。這主要是因?yàn)橛衩捉斩捴写值鞍祝–P）含量較低，中性洗滌纖維（NDF）含量較高，而使其適口性較差［3］。正常情況下，一般要求反芻動(dòng)物飼料CP含量不低于8%［3］，而玉米秸稈中CP含量低于8%，且消化率低，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)沒有足夠的氮源［4］，最終影響到瘤胃微生物的增殖和發(fā)酵［5］。因此，為了克服這些限制玉米秸稈作為飼料利用的因素，提高其利用價(jià)值，我們需要對(duì)玉米秸稈進(jìn)行物理、化學(xué)和生物學(xué)處理，以改善玉米秸稈品質(zhì)，解決其存在的消化能低、適口性差以及粗蛋白含量低的問題［6］，從而研發(fā)出適合我國反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)使用的優(yōu)質(zhì)粗飼料。同時(shí)也能更好的利用這個(gè)豐富而廉價(jià)的資源，解決我國反芻動(dòng)物粗飼料利用率低的難題。

然而，當(dāng)飼料進(jìn)入瘤胃后，瘤胃中微生物發(fā)酵飼料中非纖維性碳水化合物和植物纖維，產(chǎn)生可吸收利用的揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的同時(shí)，瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌生成大量的甲烷［7］。瘤胃內(nèi)飼料總能量的12%左右以甲烷的形式損失掉的同時(shí)，甲烷作為溫室氣體也極大地加劇全球變暖［8］。全球每年甲烷的排放量約為525 Tg，其中反芻動(dòng)物甲烷的排放量約為85 Tg［8］。大量的反芻動(dòng)物不僅需要提供龐大數(shù)量的飼料，而且排放甲烷量也急劇上升。因此，利用秸稈調(diào)制發(fā)酵生物飼料，在擴(kuò)大飼料來源，節(jié)約飼料成本，減少資源的浪費(fèi)，降低空氣污染，同時(shí)也能減少瘤胃甲烷的排放，對(duì)減緩地球變暖具有重要意義。

研究通過添加糖蜜和乳酸菌，對(duì)風(fēng)干玉米秸稈進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵處理，常溫貯存30 d后開封，感官評(píng)定發(fā)酵玉米秸稈的物理性狀，分析水分，pH以及微生物組成及數(shù)量，探討玉米秸稈發(fā)酵飼料調(diào)制的可行性技術(shù)，提高豐富而廉價(jià)的玉米秸稈資源的利用率。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用風(fēng)干玉米秸稈來源于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)田；糖蜜采購自濟(jì)南市歷城區(qū)圣茂化工有限公司；乳酸菌制劑（LAB，Lactobacillus plantarum，購自日本雪印公司）。

1.2 玉米秸稈的發(fā)酵及處理

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)處理包括無添加組、乳酸菌（LAB）、糖蜜（Molasses）以及乳酸菌和糖蜜共同（LAB+M）添加組。將收獲籽粒后的風(fēng)干玉米秸稈粉碎至1～2 cm，菌液按照每公斤飼料1 mL添加，糖蜜的添加量為4%。添加蒸餾水調(diào)整水分為60%并混合均勻。發(fā)酵用塑料袋尺寸為16×25 cm，每個(gè)處理3袋，每袋200 g，使用真空密封機(jī)（AT-620，北京吉奧德，北京），真空密封包裝室溫貯存30 d后開封，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 菌種準(zhǔn)備

將乳酸菌制劑用滅菌水溶解，每毫升菌液中含活乳酸菌數(shù)不少于1.0×105cfu（Colony-Forming U－nits），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 培養(yǎng)基

預(yù)先配制足夠的固體培養(yǎng)基，包括培養(yǎng)乳酸菌（MRS，de man，rogosa，sharpe agar）、大腸桿菌（BLU，blue light broth agar）、酵母菌和霉菌（PDA，potato dextrose agar）、好氧菌和奶熱菌（NA，nutrient agar）、酪酸菌（CLO，clostridial agar）的培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均購自青島海博生物有限公司。

1.5 pH測(cè)定方法

開封后，立即從4種發(fā)酵玉米秸稈樣品中分別取20 g，放入聚乙烯袋內(nèi)，再加入180 mL蒸餾水，隨后，用均質(zhì)器拍打90 s，再用定性濾紙進(jìn)行過濾，收集濾液，同時(shí)測(cè)定濾液的pH［6］。

1.6 發(fā)酵玉米秸稈物理性狀的感官評(píng)定

根據(jù)青貯質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［7］的說明，主要從質(zhì)地、氣味、色澤和有無霉變這4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)定。

1.7 微生物培養(yǎng)與細(xì)菌形態(tài)及計(jì)數(shù)

試驗(yàn)分別對(duì)4種處理的發(fā)酵玉米秸稈樣品中所含有的乳酸菌、大腸桿菌、酵母菌、霉菌、好氧菌、耐熱細(xì)菌和酪酸菌進(jìn)行培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。首先，制作足夠數(shù)量的MRS、BLU、NA、DRCA、PDA（需加入20%酒石酸）的固體培養(yǎng)基備用。按照Cao等所述的方法［9］，將4種處理的發(fā)酵玉米秸稈樣品待測(cè)菌液的原菌液依次進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋為10倍液、30倍液及50倍液，大腸桿菌、好氧菌和耐熱細(xì)菌、酵母菌和霉菌分別在BLU、NA、PDA培養(yǎng)基上30℃恒溫培養(yǎng)48 h；乳酸菌、酪酸菌分別在MRS、CLO培養(yǎng)基上30℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h。最后，觀察平板上長出的菌落，依依進(jìn)行區(qū)分并計(jì)數(shù)（單位質(zhì)量新鮮樣品中微生物數(shù)量cfu·g-1）［9］。

1.8 In vitro體外培養(yǎng)

1.8.1 人工唾液

1.8.2 瘤胃液的收集

3頭安裝永久性瘤胃瘺管的綿羊提供瘤胃液。上午采食2 h后，通過4頭綿羊的瘤胃瘺管進(jìn)行采集瘤胃液，采集的瘤胃液用4層紗布過濾后，等體積混合，并通入CO2保持厭氧環(huán)境。

1.8.3 培養(yǎng)液的制備

人工唾液和瘤胃液以體積比4∶1的比例混合后，通入CO2，并置于39度水浴鍋中備用。

1.8.4 生物飼料培養(yǎng)

稱取粉碎（2 mm）的風(fēng)干樣品1 g，分別置于體積為128 mL的培養(yǎng)瓶中，稱取50 mL的培養(yǎng)液注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，通入氮?dú)獗３謪捬醐h(huán)境，立即蓋上膠蓋，并用專用封口鉗子壓緊鋁蓋，將培養(yǎng)瓶置于恒溫震蕩水浴鍋內(nèi)，39度震蕩培養(yǎng)48 h。

1.8.5 干物質(zhì)消失率、pH及甲烷測(cè)定

心一橫，跳下去，也就真一了百了了，這所有的艱難，這所有的要強(qiáng)和掙扎，就都不用了。那多舒坦呀，那多舒坦呀！那不就像睡在溫暖的房子里，躺在柔軟的床上嗎？

根據(jù)Cao Y［10］的方法，分別對(duì)培養(yǎng)后樣品的干物質(zhì)消失率、培養(yǎng)液的pH以及甲烷進(jìn)行了測(cè)定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用SAS9.0軟件對(duì)4組秸稈生物發(fā)酵飼料水分、pH、in vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成量的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)定

各組玉米秸稈經(jīng)30 d發(fā)酵處理，其中無添加處理的玉米秸稈顏色為褐黃色、松軟不粘手、有酒酸味，無發(fā)霉現(xiàn)象。經(jīng)其他3種處理的玉米秸稈質(zhì)地柔軟、疏松稍濕潤，松軟不粘手，無發(fā)霉現(xiàn)象，顏色為黃色，有淡酸味。結(jié)果見表1。根據(jù)玉米秸稈青貯感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得出各處理的感官評(píng)分均在51分以上（總分100分）。屬于良好的黃貯玉米秸稈。

表1 不同處理的秸稈生物發(fā)酵飼料的感官評(píng)分Table 1 Sensory score of corn stover silage treated by M or LAB

2.2 秸稈生物發(fā)酵的水分與pH

玉米秸稈經(jīng)過無添加、M、LAB、M+LAB 4種處理后的水分和pH見表2。4種處理水分含量關(guān)系為LAB>無添加>M>M+LAB，各處理間差異不顯著（P> 0.05）。經(jīng)過LAB、M+LAB處理后的pH顯著（P＜0.05）低于糖蜜處理組。

2.3 秸稈生物發(fā)酵飼料的微生物組成及數(shù)量

發(fā)酵玉米秸稈飼料中微生物組成及數(shù)量見表3。乳酸菌在4個(gè)處理組中的數(shù)量為106～107（cfu·g-1）；大腸桿菌僅在無添加組檢測(cè)出106（cfu·g-1）；好氧菌在4個(gè)試驗(yàn)處理組中的數(shù)量為106～107（cfu·g-1）；耐熱細(xì)菌在添加組和對(duì)照組中的數(shù)量分別為103和105（cfu·g-1）；酵母菌在和M添加組中的數(shù)量為106（cfu·g-1），而在LAB和M+LAB添加組中為102（cfu·g-1）；在添加組和對(duì)照組均沒有發(fā)現(xiàn)酪酸菌和霉菌。

表2 不同處理的秸稈生物發(fā)酵飼料的水分及pHTable 2 Moisture and pH of corn stover silage treated by M or LAB

表3 不同處理的發(fā)酵玉米秸稈的微生物組成及數(shù)量（cfu·g-1）Table 3 Microbial counts of corn stover silage treated by M or LAB

2.4 In vitro干物質(zhì)消失率和瘤胃甲烷生成量

不同處理對(duì)秸稈飼料體外培養(yǎng)干物質(zhì)消失率和甲烷生成量的影響見表4。糖蜜、乳酸菌以及二者共同添加組的干物質(zhì)消失率顯著高于無添加組（P＜0.05），而乳酸菌添加組的甲烷生成量顯著低于無添加組和糖蜜添加組（P＜0.05）。

表4 不同處理秸稈生物發(fā)酵飼料的干物質(zhì)消失率及甲烷生成量Table 4 In vitro dry matter digestibility and methane production of corn stover silage treated by M or LAB

3 討論

試驗(yàn)從水分、pH、色澤、氣味、質(zhì)地等方面分別對(duì)無添加、M、LAB、M+LAB 4種處理的發(fā)酵玉米秸稈進(jìn)行感官評(píng)定。經(jīng)30 d發(fā)酵后，無添加處理的玉米秸稈顏色為褐黃色、質(zhì)地松軟不粘手、有淡酸味，無發(fā)霉現(xiàn)象；經(jīng)其他三種處理的玉米秸稈質(zhì)地疏松稍濕潤、不粘手，無發(fā)霉現(xiàn)象，顏色為黃色，有醇香味。各處理的感官評(píng)分均在51分以上，屬于良好的黃貯玉米秸稈。但是，試驗(yàn)為黃貯玉米秸稈，而感官評(píng)定中參考的是玉米秸稈青貯感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，所以水分含量比青貯玉米水分含量稍低。其中，LAB和M+LAB處理的玉米秸稈感官評(píng)分最高，而M的處理評(píng)分次之，這說明LAB處理對(duì)發(fā)酵玉米秸稈的發(fā)酵品質(zhì)有益。

青貯秸稈的發(fā)酵品質(zhì)主要由pH值和有機(jī)酸含量（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）等決定。pH是評(píng)價(jià)青貯飼料品質(zhì)最簡單且最直觀的指標(biāo)之一，pH越低，有機(jī)酸含量越高，青貯越容易保存［11］。玉米秸稈發(fā)酵時(shí)，水分越高，發(fā)酵品質(zhì)越差，試驗(yàn)中各個(gè)處理的水分都在60%左右，故發(fā)酵效果較好。同時(shí)，pH的高低也是判斷風(fēng)干玉米秸稈青貯是否成功的重要指標(biāo)，當(dāng)青貯玉米秸稈的pH在4.0以下時(shí)，青貯質(zhì)量為優(yōu)等；當(dāng)pH在4.1～4.3時(shí)，青貯質(zhì)量較為良好；當(dāng)pH在4.4～5.0時(shí)，青貯質(zhì)量較為一般；而當(dāng)pH在5.0以上時(shí)，青貯質(zhì)量則為劣等［12］。由此可見，試驗(yàn)中無添加組黃貯玉米秸稈質(zhì)量較為一般，LAB、M+LAB處理組的pH顯著下降，發(fā)酵質(zhì)量較好，發(fā)酵玉米秸稈青貯中的有害微生物處于被抑制狀態(tài)。

玉米秸稈黃貯中，乳酸菌是具有重要作用的益生菌，其種類和數(shù)量對(duì)發(fā)酵玉米秸稈品質(zhì)有很大影響［13］；酵母菌能夠提高奶牛干物質(zhì)采食量，產(chǎn)奶量以及消化粗蛋白和酸性洗滌纖維的能力［14］；而霉菌是飼料中的有害菌，不僅會(huì)造成飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失，還會(huì)危害家畜和人的健康［15］。一般情況下，發(fā)酵品質(zhì)良好的飼料，由于pH較低，會(huì)抑制微生物包括乳酸菌的活性［16］。

試驗(yàn)中，4種發(fā)酵飼料的乳酸菌均在106～107之間，說明試驗(yàn)所用的玉米秸稈附著一定數(shù)目的乳酸菌，并且由于乳酸菌的耐酸性較強(qiáng)，在密封發(fā)酵的過程中能夠進(jìn)行繁殖［9］。添加高效產(chǎn)酸LAB后，發(fā)酵飼料中可溶性糖生成乳酸，降低pH，抑制了酵母菌活性，大腸桿菌和霉菌被完全抑制。所以，在LAB添加組中，乳酸菌有輕微的減少，而酵母菌明顯減少，這與以前對(duì)發(fā)酵稻草的研究［10］結(jié)果相似。

飼料在發(fā)酵過程中，乳酸菌利用原料中的可溶性糖生成乳酸，降低pH，抑制有害微生物，減少養(yǎng)分損失［17］。改變了碳水化合物的組成和降解特性，而碳水化合物的組成和降解特性在很大程度上決定了瘤胃內(nèi)甲烷的生成量［18］。根據(jù)甲烷生成量的預(yù)測(cè)模型：甲烷生成量（g·d-1）=91+50×可消化纖維素（kg·d-1）+ 40×可消化半纖維素（kg·d-1）+24×可消化淀粉（kg·d-1）+ 67×可消化糖（kg·d-1）（R2=0.84）［18］。通常發(fā)酵飼料中的乳酸菌和其他菌類很容易發(fā)酵分解糖分、淀粉及一部分纖維素，轉(zhuǎn)變?yōu)榫w蛋白等并生成有機(jī)酸［17］，降低了飼料中一部分碳水化合物，即改變了碳水化合物組成，并且發(fā)酵生成的有機(jī)酸可以直接被瘤胃或微生物吸收利用，使他們不參與瘤胃內(nèi)發(fā)酵，可能導(dǎo)致甲烷生成量減少［17］。

試驗(yàn)中，盡管糖蜜和乳酸菌共同添加可以促進(jìn)秸稈生物飼料乳酸發(fā)酵，降低pH，減少養(yǎng)分損失，進(jìn)而提高干物質(zhì)消失率。但由于添加糖蜜增加了飼料中的可消化糖分，便導(dǎo)致瘤胃甲烷生成量的增加。如上所述，乳酸菌添加后，可以分解秸稈中可溶性糖生成乳酸，減少了甲烷生成量等式中的可消化糖的含量，進(jìn)而降低瘤胃甲烷的生成。

4 結(jié)論

添加乳酸菌以及LAB+M可以降低pH，抑制有害微生物的生長，減少飼料養(yǎng)分損失，促進(jìn)玉米秸稈生物飼料發(fā)酵。同時(shí)添加乳酸菌也可以提高體外培養(yǎng)干物質(zhì)消失率，減少瘤胃甲烷生成。

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Effects of Adding Lactic Acid Bacteria and M olasses on Fermentation Characteristics and in Vitro Rum inal M ethane Production of Corn Stover Silage

Zhou Yaqiang1，Han Yahui1，Jiang Zaihui1，Ma Yanxuan1，Shi Shaolei1，Sun Ruitao1，Li Yue1，Han Hua1，Tang Dejiang1，Hou Jianjun2，Cao Yang1
（1.College of Animal science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Zhongsheng Husbandry Co.Ltd.）

A small-scale fermentation system was used and treatments were designed as control group without additive and experimental group with molasses（M），lactic acid bacteria（LAB），and M+LAB.The silos were stored at room temperature for 30 days of fermentation，and sensory evaluation，pH and counts of viable microorganisms were determined.The silages treated by M，LAB and M+LAB have high sensory score，and 106～107（cfu·g-1）LAB，no clostridia or coliform bacteria，and 103（cfu·g-1）bacilli and 102～106（cfu·g-1）yeasts.But the control silage had 107（cfu·g-1）LAB，106（cfu/g）coliform bacteria or yeasts.There was no difference for the moisture content among the four groups of silage.The values of pH for LAB and M+LAB silage were significantly lower（P＜0.05）than that for the control silage or M silage.The results showed that adding LAB，M and M+LAB inhibited the growth of the bad bacteria and improved the fermentation quality of the silage with dry corn stover，and got a good quality fermented feed，and the addition of LAB could decrease in vitro ruminal methane of the silage of dry corn stover.

Lactic acid bacteria；molasses；dry corn stover；fermentation quality；methane

S816.7

A

1002-2090（2016）03-0046-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.010

2015-06-26

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（20141022318）。

周亞強(qiáng)（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2011級(jí)動(dòng)物科學(xué)專業(yè)本科生。

曹陽，教授，E-mail：hbdkcaoyang@136.com。