精制竹醋液防治平菇細(xì)菌性褐斑病藥效試驗(yàn)

徐巖巖，李鐵軍，華美紅，薛紫夢，劉 盼，李 潔

(河北民族師范學(xué)院生物系，河北 承德 067000)

精制竹醋液防治平菇細(xì)菌性褐斑病藥效試驗(yàn)

徐巖巖，李鐵軍，華美紅，薛紫夢，劉 盼，李 潔

(河北民族師范學(xué)院生物系，河北 承德 067000)

測定不同濃度的精制竹醋液對平菇細(xì)菌性褐斑病菌的抑制作用以及對平菇菌絲生長的影響以及田間驗(yàn)證。結(jié)果表明10%精制竹醋液不僅具有明顯的抑菌效果而且能促進(jìn)平菇菌絲的生長。研究結(jié)果為精制竹醋液作為平菇細(xì)菌性褐斑病的防治藥劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

精制竹醋液；平菇；褐斑??；托拉斯假單胞桿菌

平菇(Pleurotusostreatus)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，不僅含有多種氨基酸、維生素以及各種對人體有益的酶類，還含有多種生物活性物質(zhì)，如多糖、多肽等，具有滋補(bǔ)提高機(jī)體免疫力等功效[1]。20世紀(jì)70年代初，平菇栽培技術(shù)出現(xiàn)重大突破，使得平菇生產(chǎn)發(fā)展迅猛，成為我國栽培量最大的食用菌[2]。在平菇種植過程中病蟲危害是造成減產(chǎn)的主要原因，尤其是平菇細(xì)菌性褐斑病破壞菇蓋表皮組織細(xì)胞，表面出現(xiàn)黃褐色病斑，影響了其商業(yè)價(jià)值[3]。

平菇細(xì)菌性褐斑病的病原菌是托拉斯假單胞桿菌(PseudomonastolaasiiPaine)[3-4]。目前，各種化學(xué)農(nóng)藥在防治平菇細(xì)菌性褐斑病的過程中農(nóng)藥殘留問題不易解決，也沒有抗性較好的平菇品種出現(xiàn)，現(xiàn)階段尋找綠色農(nóng)藥在食用菌病害防治過程中為大勢所趨。

竹醋液是是燒制竹炭的副產(chǎn)品，具有特殊的煙熏氣味，顏色為淡黃至紅褐色，成分復(fù)雜，主要是有機(jī)酸、酚類、酮類、醇類和酯類[5]。竹醋液以其純天然、綠色、安全等優(yōu)勢得到推廣，可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)、食品加工和醫(yī)藥衛(wèi)生等方面[6]。

本試驗(yàn)將精制竹醋液應(yīng)用于平菇細(xì)菌性褐斑病的防治，結(jié)合室內(nèi)抑菌毒力試驗(yàn)的方法[7]，測定不同濃度的精制竹醋液對托拉斯假單胞桿菌的抑制作用以及對平菇菌絲的生長調(diào)節(jié)作用，并從中測得精制竹醋液的最佳抑菌濃度，在田間實(shí)現(xiàn)防效驗(yàn)證，旨在為精制竹醋液在平菇細(xì)菌性褐斑病的防治的推廣提供科學(xué)用藥的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試平菇品種 “新育冬豐”平菇菌種及菌棒，由平泉縣希才應(yīng)用菌科技發(fā)展有限公司提供。

1.1.2 供試病原菌株 托拉斯假單胞桿菌從發(fā)生細(xì)菌性褐斑病的平菇子實(shí)體上分離獲得。

1.1.3 供試藥劑 硫酸鏈霉素可溶性粉劑(streptomycin, 效價(jià)1 000 U·mg-1)為江西博萊大藥廠產(chǎn)品，精制竹醋液為江陰中炬生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，瓊脂18 g，用于培養(yǎng)細(xì)菌。LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，用于培養(yǎng)細(xì)菌。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 托拉斯假單胞桿菌菌懸液的制備 挑取托拉斯假單胞桿菌單個(gè)菌株，接種在LB培養(yǎng)液中170/min振蕩培養(yǎng)36 h，用無菌水配制成濃度為1×108cfu·mL-1的菌懸液，備用。

1.2.2 平板擴(kuò)散法抑菌 取100 mL LB培養(yǎng)基微波爐融化后，待溫度降至65 ℃，在無菌條件下，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中制作平板，每皿25 mL，冷卻至凝固。將100 μL濃度為的1×108cfu·mL-1的托拉斯假單胞桿菌菌懸液加到培養(yǎng)基上，涂布均勻，晾干，打孔8 mm×8 mm，每皿4孔，加入100 μL藥劑，37 ℃黑暗培養(yǎng)2 d，每隔24 h記錄一次，測定抑菌圈直徑。設(shè)置無菌水對照和鏈霉素(0.5 mg·mL-1)藥劑對照處理。每組處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 最佳抑菌濃度篩選 利用無菌水將精制竹醋液分別稀釋至濃度梯度為50%，20%，12.5%，10%，5%，然后利用平板擴(kuò)散法篩選出精制竹醋液抑菌劑的最佳抑菌濃度，設(shè)置無菌水和鏈霉素對照。

1.2.4 精制竹醋液對平菇菌絲生長的影響 采用平板抑菌法檢測不同濃度的精制竹醋液對平菇菌絲生長的影響，設(shè)置無菌水和鏈霉素對照。在無菌操作下，取100 mL PDA培養(yǎng)基微波爐融化后，待溫度降至65 ℃，倒平板，每皿25 mL，冷卻。取100 μL精制竹醋液抑菌劑均勻涂布在平板上，至完全吸收。在無菌操作下，用打孔器從菌種皿取材，在外緣生活力比較強(qiáng)的菌落處取6 mm×6 mm菌餅，備用。將打好的菌餅放置在平板中央，26 ℃培養(yǎng)8 d。培養(yǎng)8 d后，用“十字交叉法”測定平菇菌絲生長直徑，以平均值代表菌落直徑。

1.2.5 田間試驗(yàn) 涂抹接種法：待平菇子實(shí)體直徑5 cm左右開始進(jìn)行試驗(yàn)。將精制竹醋液均勻噴霧于生長情況一致的幼小子實(shí)體菌蓋上。4 h后，用滅菌的刷子占取2 mL托拉斯假單胞桿菌菌懸液，均勻涂布在已噴施竹醋液的菌蓋上。在接種后，每隔24 h進(jìn)行一次病級的調(diào)查。設(shè)置無菌水、鏈霉素與只接種托拉斯假單胞桿菌對照。參考Rodriguez Estrada & Royse等(2007)[8]的分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情指數(shù)。

病情指數(shù)= Σ(各級病菇數(shù)×相應(yīng)級數(shù))/(調(diào)查總菇數(shù)×9)×100

防治效果=[ 病原菌對照的病情指數(shù)-(處理的病情指數(shù)-未接病原菌對照的病情指數(shù))]/病原菌對照的病情指數(shù)×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 采用IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度精制竹醋液的抑菌效果

不同濃度精制竹醋液均可不同程度的抑制托拉斯假單胞桿菌的生長。不同濃度精制竹醋液的抑菌效果達(dá)到差異極顯著(P<0.05)，且濃度與抑菌效果與成比，即精制竹醋液濃度越大，抑菌圈直徑也越大。其中，精制竹醋液原液的抑菌圈達(dá)到最大，為36.06 mm，抑菌效果最顯著。

表1 不同濃度精制竹醋液對托拉斯假單胞桿菌的抑菌圈直徑的影響

“-”表示沒有抑菌圈; 不同小寫字母表示處理間的差異達(dá)到顯著水平，P<0.05

“-” present no inhibition zone; different lower case letters indicate a significant difference atP<0.05

圖1 不同濃度精制竹醋液對托拉斯假單胞桿菌的抑菌圈直徑的影響Fig.1 Effect of the refined bamboo vinegar at various concentrations on the diameter of inhibition zone of Pseudomonas tolaasii

2.2 不同濃度精制竹醋液對平菇菌絲生長的影響

精制竹醋液對平菇菌絲具有顯著的生長調(diào)節(jié)作用。為了探討精制竹醋液對平菇菌絲生長的影響，在培養(yǎng)基中加入不同濃度精制竹醋液，測定了其對平菇菌絲生長的影響，。與空白組對照和鏈霉素對照相比，發(fā)現(xiàn)精制竹醋液原液和50%精制竹醋液對平菇菌絲生長有明顯的抑制作用，其余濃度下的精制竹醋液均表現(xiàn)為促進(jìn)作用，其中12.5%精制竹醋液的促進(jìn)作用最為顯著，平菇菌落直徑可達(dá)82.67 mm，具有顯著差異(P<0.05)。

表2 不同濃度精制竹醋液對平菇菌絲生長的影響

“+++”表示菌落整齊，菌絲潔白、濃密、有彈性；“++”表示菌落整齊，菌絲潔白、較濃；“+”表示菌落不整齊，菌絲灰白、稀疏，不同小寫字母表示處理間的差異達(dá)到顯著水平，P<0.05

"+++" present neat colonies, white, thick and elastic hyphae; "++" present neat colonies, white, thick hyphae; "+" present no neat colonies, pale hyphae; Different lower case letters indicate a significant difference atP<0.05

2.3 精制竹醋液對平菇細(xì)菌性褐斑病田間防治效果

在田間試驗(yàn)中，證實(shí)了精制竹醋液對平菇細(xì)菌性褐斑病的發(fā)生確實(shí)有較好的防治效果，但較高的濃度(原液、50%、20%)會(huì)對平菇子實(shí)體產(chǎn)生藥害，導(dǎo)致子實(shí)體卷曲。對照藥劑鏈霉素病情指數(shù)為30.36，防效為69.64%，10%精制竹醋液防效可達(dá)79.64%，防治效果優(yōu)于鏈霉素。只接致病菌的平菇子實(shí)體發(fā)病較嚴(yán)重，病斑面積較大，顏色呈深褐色，隨著接種時(shí)間病斑逐漸擴(kuò)展至整個(gè)菌蓋表層。

表3 精制竹醋液對平菇細(xì)菌性褐斑病田間防治效果

“+”代表藥害程度，“-”代表無藥害；不同小寫字母表示處理間的差異達(dá)到顯著水平，P<0.05

"+" present phytotoxicity level, "-" present no phytotoxicity; Different lower case letters indicate a significant difference atP<0.05

3 討 論

目前國內(nèi)外平菇細(xì)菌褐斑病的防治主要是栽培過程中使用化學(xué)藥劑如農(nóng)用鏈霉素、金霉素[9]、春日霉素[10]、漂白粉液[11]和溴硝醇(bronopol)[12]等。平菇子實(shí)體生長期比較短，一旦使用化學(xué)藥劑，藥劑殘留來不及降解，危害人體健康。隨著生活水平的提高，人們越來越重視食品安全，所以用藥需選用低毒、綠色環(huán)保、高效和特異性強(qiáng)的抑菌劑防治細(xì)菌性褐斑病，防止對人體或平菇本身造成農(nóng)藥危害，這對保證食用菌安全及食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。竹醋液作為竹業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品，生產(chǎn)成本低廉，本試驗(yàn)中使用的竹醋液經(jīng)重蒸，除去了焦油，重金屬等雜質(zhì)，提高了竹醋液的純度。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為10%精制竹醋液不僅有顯著的抑菌效果與田間防治效果，且可作為平菇生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)平菇菌絲的生長。因此，純植物源的精制竹醋液, 以其高活性、無毒、無殘留等特點(diǎn)[13]，在食用菌病害防治與栽培方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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The Pesticide Effect of Refined Bamboo Vinegar on Brown Blotch Disease ofPleurotusostreatus

XU Yan-yan, LI Tie-jun, HUA Mei-hong, XUE Zi-meng, LIU Pan, LI Jie

(Department of Biology, Hebei Normal University for Nationalities, Chengde 067000, Hebei, China)

Plate and field efficacy tests were conducted to evaluate the effects of refined bamboo vinegar at various concentrations on the brown blotch disease ofPleurotusostreatuscaused byPseudomonastolaasii. The results showed that the refined bamboo vinegar at 10% concentration not only had obvious antibacterial effect, but also promoted the growth of mushroom mycelia. This indicated that the refined bamboo vinegar can be used as an antibacterial agent of the brown blotch disease ofPleurotusostreatus.

Refined bamboo vinegar;Pleurotusostreatus; Brown blotch disease;Pseudomonastolaasii

2015-12-10

河北省科技廳資助項(xiàng)目(13226511)；承德市財(cái)政局資助項(xiàng)目(CZ2013007)；承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20157029)

徐巖巖(1985-)，女，講師，博士，從事農(nóng)業(yè)微生物學(xué)方面研究。E-mail：xuyanyan_sd@163.com。通信作者：李潔(1962-)，女，教授，碩士，從事食用菌資源開發(fā)利用研究。E-mail：lijie0651@163.com