香蕉細菌性軟腐病菌細胞壁降解酶pelD、pelE基因的克隆表達及活性分析

任小平，蒲小明，沈會芳，張景欣，林壁潤

（1.廣東省農(nóng)業(yè)有害生物預(yù)警防控中心，廣東 廣州 510500，2.廣東省農(nóng)科院植物保護研究所，廣東 廣州 510640）

香蕉細菌性軟腐病菌細胞壁降解酶pelD、pelE基因的克隆表達及活性分析

任小平1，蒲小明2，沈會芳2，張景欣2，林壁潤2

（1.廣東省農(nóng)業(yè)有害生物預(yù)警防控中心，廣東 廣州 510500，2.廣東省農(nóng)科院植物保護研究所，廣東 廣州 510640）

細胞壁降解酶與植物病害癥狀有重要的相關(guān)性。根據(jù)已知軟腐病細菌細胞壁降解酶基因序列，設(shè)計兩對特異性引物，對香蕉細菌性軟腐病菌進行PCR克隆，獲得具有完整閱讀框的基因pelD、pelE序列。通過構(gòu)建重組表達載體pET28b（+）-pelD和pET28b（+）-pelE，重組表達載體轉(zhuǎn)化子在IPTG誘導(dǎo)下，經(jīng)SDSPAG分析，獲得了pelD和pelE的表達蛋白。將兩種表達蛋白接種于7～8片葉的粉蕉假莖和離體葉片上，發(fā)現(xiàn)接種pelE表達蛋白的粉蕉假莖和葉片出現(xiàn)了腐爛癥狀，但接種pelD表達蛋白沒有引起發(fā)病癥狀。

香蕉細菌性軟腐病菌；克?。槐磉_；活性分析

任小平，蒲小明，沈會芳，等.香蕉細菌性軟腐病菌細胞壁降解酶pelD、pelE基因的克隆表達及活性分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（5）：96-100.

狄克氏屬細菌（Dickeya）可為害作物造成嚴重系統(tǒng)性維管束病害，特別對香蕉、玉米、馬鈴薯等為害極大［1］。香蕉細菌性軟腐病菌（Dickeya zeae）［2］是我國進境檢疫性有害生物，2009年首次在廣東報道了香蕉細菌性軟腐病的發(fā)生與危害［3］，發(fā)現(xiàn)該病在粉蕉種植區(qū)發(fā)病株率初期為20%～30%，后期嚴重可達90%以上甚至造成絕收，對香蕉生產(chǎn)造成嚴重損失。目前國內(nèi)在江蘇、上海、浙江、福建、廣東［4］、湖南、湖北、廣西、云南［5］，臺灣種植的百合［6］和安徽等地的水稻、蝴蝶蘭、馬蹄蓮等作物上有報道由Dickeya病原菌引起的病害。國外研究Dickeya的致病性，主要認為是病原菌產(chǎn)生和分泌大量的細胞壁降解酶，包括果膠裂解酶、纖維素酶、核酸酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲基酯酶等［7］，其中果膠裂解酶是主要的致病因子，主要包括5個主要的果膠裂解酶和至少3個次要的果膠裂解酶，但一些次要基因的失活比主要基因的突變更能削弱病原菌的組織浸染能力和繁殖［8］，也可能產(chǎn)生誘導(dǎo)因子和更適合的底物來提高主要酶的活性［9］。一些研究表明果膠酶基因在病原菌侵染過程的不同時間表達［10］，一些基因通過協(xié)同作用，提高細菌穿越植物組織的能力，加快植物細胞壁降解，釋放出細胞壁成分供細菌營養(yǎng)［11］。因此可以通過基因克隆技術(shù)，測定基因在植物病理進程中的重要性，也可進行菌種選育，縮短從研究到應(yīng)用的時間，克服傳統(tǒng)育種方法的盲目性［12］。同時也可利用植物細胞壁基因的表達產(chǎn)物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性［13］。

目前國內(nèi)尚未有報道關(guān)于香蕉細菌性軟腐病菌致病機理研究。本研究通過克隆和分析了香蕉細菌性軟腐病菌的pelD和pelE基因，并對兩基因表達蛋白進行致病性驗證，以期為進一步研究該病原菌的致病機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試香蕉材料為粉蕉（Musa ABB），品種為粉蕉1號，由廣東省農(nóng)科院果樹研究所提供，香蕉細菌性軟腐病菌（D.zeae）由廣東省農(nóng)科院植物保護研究所提供。

TaqTM、dNTP﹝寶生物工程（大連）有限公司﹞；DL15000、DL2000、DL3000 DNA凝膠回收試劑盒（TIANGEN公司）；卡那霉素（Kan）、氯霉素（Amp）（威佳公司）；IPTG、X-gal（晶美生物工程公司）。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g、酵母浸膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂18 g、水1 000 mL，pH 7.0。NA液體培養(yǎng)基：稱取牛肉浸膏3 g、酵母浸膏1 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、水1 000 mL，pH 7.0。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，加入到適量蒸餾水中并緩慢加熱使其充分溶解，再補充蒸餾水定容至1 000 mL，加熱混勻。

表達載體pET28b（+）（Novagen），E.coli DH5α（TaKaRa）作為克隆的宿主菌，E.coli BL-21（DE3）（TaKaRa）作為表達宿主菌。PMD-18T、SimplePMD-18T（TaKaRa）作為克隆載體，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞等均從寶生物工程（大連）有限公司購置。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 細菌基因組的提取方法按照試劑盒〔寶生物工程（大連）有限公司〕提供的說明書進行。提取的DNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的基因引物設(shè)計及PCR擴增 根據(jù)國外已報道的編碼Dickeya spp.果膠酶基因的序列，分別設(shè)計pelD基因上下游引物：F：5'-CGGA ATTCATGAACAACACACGAGTGTCT-3'和R：'-GCCTCGAGCAGTTTGCCGTATCCTGCATT-3'，pelE基因上下游引物：F：5'-GCGGATCCATGAACAAC TCACGTATGTCT-3'和R：5'-GCCTCGAGCAGTTT ACCGTAGCCCGCGTT-3'，進行PCR擴增，擴增條件：25 μL反應(yīng)體系10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 2 μL，5 μmol/L上游引物1 μL，5 μmol/L下游引物1 μL，5 U/μL Tag酶0.2uL，DNA模板1 μL，補水ddH2O 17.3 μL。反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、52.5℃退火30 s、72℃延伸3 min，35個循環(huán)；72℃總延伸10 min，最后在4℃下保存。片段擴增后，電泳結(jié)果檢測。用Takara公司的DNA Fragement Purification Kit Ver2.0試劑盒回收和純化目的片段，并將目的基因片段送上海上海英駿公司進行測序。

1.2.3 基因序列比對 將獲得的DNA序列與GenBank中已知種屬的序列進行BLAST比對和同源性分析。

1.2.4 基因克隆 將目的基因片段與PMD-18T載體的連接，反應(yīng)體系為PMD-18T Vector DNA 1 μL，PCR回收產(chǎn)物4 μL，Solution I 5 μL，總體積10 μL，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑選培養(yǎng)皿中的白色單菌落，進行擴繁，提取質(zhì)粒，用雙酶切方法鑒定PMD-18T重組質(zhì)粒。

1.2.5 pelD和pelE基因的重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 基因的擴增產(chǎn)物凝膠回收后，與PMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗證后的陽性克隆子，再分別提取陽性克隆子和表達載體pET28b（+）的質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別回收目的片段和載體片段，以合適的比例進行粘端連接，反應(yīng)體系為25 μL，3.4 μL pET28b（+）載體，2.5 μL T4連接緩沖液，3.6 μL目的片段，1 μL T4DNA連接酶，14.5 μL ddH2O2。16℃連接過夜，于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)18～34 h，篩選陽性重組質(zhì)粒。

1.2.6 pelD和pelE基因的誘導(dǎo)表達和表達蛋白的純化 篩選含有重組質(zhì)粒的單菌落，在含35 μg/mL卡那霉素，35 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min擴大培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，30℃、100 r/min誘導(dǎo)12 h。分別取1 mL菌液，經(jīng)離心、超聲波破碎和離心后，收集沉淀。將沉淀用pH 7.0的0.2 mmol/L PBS（Na2HPO4-Na2HPO4）溶解液懸浮，8 mol/L尿素進行懸浮，室溫振蕩3 h，12 000 r/min、4℃離心30 min，收集上清進行SDS-PAGE電泳檢測，并采用鎳瓊脂糖親和層析法進行洗脫。

1.2.7 基因表達產(chǎn)物接種 分別取0.1 mL pelD、pelE基因表達12 h并純化的蛋白，注射接種7～8片葉的粉蕉苗莖基部和粉蕉苗葉脈處，3 d后剖開觀察粉蕉苗假莖和粉蕉苗葉片癥狀，以無菌水為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 pelD和pelE基因片段的擴增

對pelD基因進行常規(guī)PCR擴增，在1 200 bp處有一特異的條帶（圖1）。對pelE基因進行常規(guī)PCR擴增，在1 200 bp處也有一特異的條帶（圖2）。

圖1 pelD基因的PCR擴增電泳結(jié)果

圖2 pelE基因的PCR擴增電泳結(jié)果

2.2 pelD和pelE基因序列測定與分析

測序結(jié)果表明，基因pelD和基因pelE的序列大小分別為1 165 bp、1 197 bp，與目的基因大小一致。經(jīng)BLAST比對分析，該基因序列與國外報道的果膠酶基因pelD和pelE同源性高，且具有完整的閱讀框。

2.3 pelD和pelE基因克隆至PMD18-T載體的鑒定

將凝膠回收的目的基因pelD和基因pelE，分別克隆到PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞。挑取陽性的菌落進行PCR擴增，得到與預(yù)期大小相當?shù)臈l帶（圖3、圖4）。

圖3 pelD基因的PCR擴增電泳結(jié)果

圖4 pelE基因的PCR擴增電泳結(jié)果

2.3 pelD和pelE基因重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

挑取含有pelD和pelE基因的陽性菌落進行PCR擴增，分別得到一條為1 165 bp和1 197 bp大小的條帶（圖5、圖6）。

圖5 pelD基因克隆載體的PCR擴增電泳結(jié)果

圖6 pelE基因克隆載體的PCR擴增電泳結(jié)果

2.4 基因pelD和pelE誘導(dǎo)12 h的表達

對轉(zhuǎn)化重組表達載體pET28b（+）菌株的蛋白進行了12 h的誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析。從圖7、圖8可以看出，基因pelD和pelE在誘導(dǎo)表達12 h后，在45 ku處有一條明顯的電泳帶，表明基因pelD和pelE蛋白是一種誘導(dǎo)表達蛋白。

2.5 基因pelD和pelE表達蛋白活性測定

將pelD和pelE基因表達蛋白，取0.1 mL純化的蛋白液體注射接種7～8片葉的粉蕉苗莖基部和粉蕉苗葉脈處，以無菌水和直接注射菌株為對照，3 d后剖開觀察粉蕉苗假莖和粉蕉苗葉片癥狀。結(jié)果顯示pelD基因表達蛋白，對粉蕉假莖組織沒有造成變色或腐爛（圖9，封三）；接種粉蕉葉片葉脈，也沒有造成葉片變色或腐爛（圖10，封三）。pelE基因表達蛋白，造成粉蕉假莖組織出現(xiàn)腐爛癥狀，而且有逐步縱向延伸的趨勢（圖11，封三）。接種到離體的粉蕉苗葉片的中脈處，粉蕉苗葉片也從中脈延伸腐爛（圖12，封三）。

圖7 純化pET28b（+）-pelD表達產(chǎn)物的SDS-PAGE（誘導(dǎo)12 h）

圖8 純化pET28b（+）-pelE表達產(chǎn)物的SDS-PAGE（誘導(dǎo)12 h）

3 結(jié)論與討論

本研究對香蕉細菌性軟腐病菌的pelD和pelE基因進行測序和原核表達，獲得了pelD和pelE基因的完整序列，與BLAST比對分析，該基因序列與國外報道的果膠酶基因pelD和pelE同源性高。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，在45 ku處有明顯的條帶，與pelD和pelE基因表達的蛋白大小一致。

Dickeya 的果膠酶類型、果膠酶基因表達和作用已進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)pelA-pelE-pelD為獨立的轉(zhuǎn)錄單元，并對外界環(huán)境條件比較敏感［14］?；騪elE、pelD的表達受到pH的調(diào)控［15］，在pH 7以下，pelD和pelE的活力只保持25%～30%［16］。在酸性條件下，基因pelD在病菌侵染過程的早期表達，而基因pelE主要在正常情況下轉(zhuǎn)錄［17］。pelE酶能導(dǎo)致植物萎蔫、電解質(zhì)流失和細胞死亡［18］。cAMP通過CRP蛋白抑制基因pelD和pelE基因的轉(zhuǎn)錄表達，但低濃度的Fe2+有利于pelD和pelE基因的表達。Dickeya的pelD和pelE酶的分子量分別為42 ku［19］和42.5 ku［20］。

對粉蕉假莖進行注射接種，基因表達蛋白pelE引起粉蕉組織腐爛，表明基因表達蛋白pelE對粉蕉組織具有降解能力。但基因表達蛋白pelD對粉蕉組織沒有明顯的降解癥狀。本研究成功克隆到香蕉細菌性軟腐病菌的pelE基因，及表達獲得pelE蛋白，為下一步研究香蕉細菌性軟腐病菌細胞壁降解酶的作用機制提供重要的資源。

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（責任編輯 楊賢智）

Cloning and expression analysis of cell wall degrading enzyme genes from banana soft rot pathogen

REN Xiao-ping1，PU Xiao-ming2，SHEN Hui-fang2，ZHANG Jing-xin2，LIN Bi-run2
（1.Forecast and Control Center for Agricultural Pest of Guangdong Provincie，Guangzhou 510500，China；2.Plant Protection Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）

Cell wall degrading enzymes had important relationship with the symptoms of plant diseases.Two pairs of specific primers were designed for amplification and cloning gene sequences of Banana soft rot pathogen according to reported cell wall degrading enzyme genes.A complete reading frame sequence of gene pelD and pelE were obtained by cloning technology.The expression vector pET28b （+） was used to investigate the pelD and pelE gene expression.According to the results of SDS-PAGE，under the inducing of IPTG，transformants of recombinant expression vectors expressed much protein.After the purified protein was inoculated into banana false stem and leaves in vitro，similar rot symptoms were presented compared to Banana bacterial soft rot pathogen，the purified protein from vector pET28b （+）-pelE after expressing 12 h appeared serious rot，while the purified protein from vector pET28b （+） -pelD did not cause rot in plant.

banana soft rot pathogen；gene cloning；expression；activity analysis

S436.68+1

A

1004-874X（2016）05-0096-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.05.019

2016-02-25