莖瘤芥BjPKS1基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化

孫 全，阿麗亞·司地克，楊宏國(guó)，畢晶磊，何曉紅，蔡應(yīng)繁，朱利泉

（1.重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶 400065；2.河南大學(xué)棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004；3.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715）

莖瘤芥BjPKS1基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化

孫 全1，2，阿麗亞·司地克1，楊宏國(guó)1，畢晶磊3，何曉紅1，蔡應(yīng)繁2，朱利泉3

（1.重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶 400065；2.河南大學(xué)棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004；3.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715）

莖瘤芥（榨菜）具有瘤莖膨大的性狀，該特征是一種重要的經(jīng)濟(jì)性狀。在前期研究中，我們獲得一個(gè)可能與瘤莖膨大有關(guān)的基因片段，該基因與擬南芥PKS1基因相似。通過RACE技術(shù)獲得了該基因全長(zhǎng)序列，命名為BjPKS1。該基因的mRNA序列全長(zhǎng)1 440 bp，其預(yù)測(cè)的ORF長(zhǎng)度為1 131 bp，編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度為376aa。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)的氨基酸序列與其他物種的PKS基因家族蛋白具有高度相似性，在多個(gè)區(qū)域都高度保守，進(jìn)化分析顯示BjPKS與擬南芥的PKS1基因關(guān)系最近。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，該基因在莖瘤芥瘤莖膨大發(fā)育的過程中表達(dá)量明顯上升。將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株株高和節(jié)間都明顯縮短。結(jié)果表明BjPKS1可能具有其他物種中同源基因相似的分子功能，其在莖瘤芥瘤莖膨大過程中的作用有待進(jìn)一步研究。

榨菜；PKS1基因；瘤莖；膨大；轉(zhuǎn)基因

孫全，阿麗亞·司地克，楊宏國(guó)，等.莖瘤芥BjPKS1基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（5）：49-54.

莖瘤芥（榨菜）是十字花科蕓薹屬重要經(jīng)濟(jì)作物，其瘤莖是制作涪陵榨菜的原材料。由于莖瘤芥對(duì)光照和溫度等都比較敏感，其分布范圍相對(duì)較窄，目前主要在重慶、四川、湖南和湖北等長(zhǎng)江流域沿線廣泛栽種［1］。莖瘤芥是一年生植物，播種時(shí)間在9月中旬至10月中旬，其他時(shí)間播種容易發(fā)生提前抽薹，導(dǎo)致瘤莖不能膨大，影響莖瘤芥的產(chǎn)量［2］。目前，對(duì)莖瘤芥的研究主要集中在遺傳育種、生理生化和傳統(tǒng)分類等方面，分子水平上的研究鮮有報(bào)道，尤其是對(duì)影響莖瘤芥產(chǎn)量等最重要性狀（即瘤莖膨大的分子機(jī)理）的研究相當(dāng)匱乏。為了獲得更多的基因，加快榨菜分子遺傳育種的進(jìn)程，我們通過高通量的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，對(duì)莖瘤芥瘤莖膨大的不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行了系列研究，并篩選獲得了一些可能與瘤莖膨大相關(guān)的基因［3］。其中，有一個(gè)基因與擬南芥的光敏色素激酶底物1 （phytochrome kinase substrate 1，PKS1）具有較高的相似性。在擬南芥中，PKS1基因是一個(gè)典型的膜結(jié)合蛋白，屬于PKS基因家族的一員，該家族主要有PKS1、PKS2、PKS3、PKS4共4個(gè)成員［4-5］，其功能比較復(fù)雜。研究表明，PKS1、PKS2和PKS4都可與光敏色素A發(fā)生相互作用，當(dāng)PKS1與光敏色素A反應(yīng)時(shí)后者會(huì)使前者發(fā)生自身磷酸化。PKS1也可與向光素1發(fā)生作用，是植物體內(nèi)由向光素1介導(dǎo)的根和下胚軸屈光性現(xiàn)象的重要作用元件［6-7］，還可影響植物葉片的平展和位置布局等［8］。在體外，PKS1和PKS2分別可以與PHYA 和PHYB發(fā)生作用，過量表達(dá)PKS1會(huì)干擾體內(nèi)光敏色素發(fā)送信號(hào)［6，9-12］。

大量研究表明擬南芥中，PKS1基因參與了多種信號(hào)傳遞和調(diào)控過程。莖瘤芥作為十字花科的一員，與擬南芥的親緣關(guān)系非常近。莖瘤芥的瘤莖膨大與光照條件密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)也顯示莖瘤芥的PKS1同源基因在瘤莖膨大過程中具有顯著的表達(dá)差異。因此，本研究希望通過克隆莖瘤芥的PKS1同源基因?qū)ζ涔δ苓M(jìn)行初步研究，探索該基因在瘤莖膨大中的作用，同時(shí)為更好地研究膨大的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

莖瘤芥品種永安1號(hào)（由重慶農(nóng)科院涪陵研究所提供），在10月中上旬播種，自然條件下生長(zhǎng)至18～25周左右，分別取約18周（莖1，瘤莖無膨大）、20周（莖2，瘤莖膨大前）、22周（莖3，瘤莖開始膨大）和25周（莖4，瘤莖膨大后）的莖以及開花期的根、葉、花、果實(shí)，經(jīng)過生理鹽水和無菌水清洗后，用液氮速凍并轉(zhuǎn)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

擬南芥（Columbia型）種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)消毒和春化后播種于1/2MS培養(yǎng)基，待溫室培養(yǎng)至3～4葉后移栽到營(yíng)養(yǎng)土中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的抽提和cDNA的合成 總RNA的抽提使用plant RNA Easyspin kit（艾德萊，北京）試劑盒進(jìn)行，通過分光光度計(jì)和電泳檢測(cè)合格的樣品儲(chǔ)存-70℃?zhèn)溆?。cDNA第一鏈的合成參考PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（寶生物，大連）試劑盒進(jìn)行。

1.2.2 莖瘤芥PKS1（BjPKS1）基因的雙末端克隆 使用莖2的總RNA，5' 端的克隆參考5' -Full RACE kit（寶生物）說明書進(jìn)行，分別使用兩個(gè)特異的引物GSP1和GSP2進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，其中第2輪PCR的退火溫度為58℃，延伸時(shí)間為2 min（表1）。3' 端的克隆使用引物AP參考前述方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后使用引物UAP和3-in進(jìn)行第1次PCR，再使用UAP引物和3-out引物進(jìn)行第2次巢式PCR。以上5' 端和3' 端的產(chǎn)物經(jīng)過膠回收后連接到pMD19-T載體后克隆測(cè)序。

1.2.3 莖瘤芥BjPKS1基因的序列分析 將以上克隆并測(cè)序的5' 端和3' 端序列通過序列組裝的軟件（CAP）進(jìn)行拼接，獲得該基因的全長(zhǎng)序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異的引物WPKS（表1），使用莖2 的cDNA模板，通過引物WPKS和引物UAP進(jìn)行PCR檢測(cè)并克隆測(cè)序，反應(yīng)程序參考5' 端克隆的第2次PCR反應(yīng)。測(cè)序結(jié)果與組裝序列一致后，將組裝序列遞交到GenBank，并命名為BjPKS1。該基因的預(yù)測(cè)氨基酸序列等理化性質(zhì)分析均使用Bioedit軟件進(jìn)行，多序列比對(duì)使用Clustalx軟件，系統(tǒng)進(jìn)化樹基于鄰接法使用MAGE5.0構(gòu)建。

1.2.4 莖瘤芥BjPKS1基因的表達(dá)模式分析 使用各時(shí)期各組織的cDNA模板，參考SYBR premix ExTaqTMkit（寶生物）試劑盒，使用熒光定量PCR方法對(duì)BjPKS1基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。18S基因作為內(nèi)參，使用引物BjPKS-F和BjPKS-R在BIO-RAD iQ5熒光定量PCR儀（伯樂）進(jìn)行，其退火溫度設(shè)置為57℃，其他使用默認(rèn)設(shè)置。反應(yīng)產(chǎn)物通過溶解曲線分析，以確保產(chǎn)物的唯一性，相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用ddCt方法。

1.2.5 莖瘤芥BjPKS1基因的遺傳轉(zhuǎn)化 以莖2 cDNA為模板，使用引物CBD-F和CBD-R（表1）參考前述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)BglⅡ和SpeI雙酶切反應(yīng)后連接到經(jīng)同樣酶切后回收的pCAMBIA1302-35S-OCS質(zhì)粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，并命名為pCAMBIA1302-PKS1。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后將目的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101。

待擬南芥幼苗開花后，參考Clough等的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。T0代種子通過含50 mg/L Kana霉素的1/2MS平板篩選存活的幼苗移栽于營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)。取T1代幼苗的葉片提取基因組DNA，使用引物1302-F和1302-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。收取T2代種子收獲后獲得純合個(gè)體，T3代種子播種并觀察性狀。

表1 引物種類

圖1 BjPKS1基因的全長(zhǎng)克隆

2 結(jié)果與分析

2.1 莖瘤芥BjPKS1基因的克隆

通過5' RACE和3' RACE，分別獲得一條長(zhǎng)約1 200 bp和300 bp的片段（圖1A、B），測(cè)序后將兩端序列進(jìn)行組裝獲得一條長(zhǎng)度為1 440的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：JQ799043）。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的跨兩端引物進(jìn)行PCR，獲得一條1 200 bp的片段，測(cè)序結(jié)果顯示與原序列一致，說明該基因的組裝序列無誤（圖1C）。

2.2 莖瘤芥BjPKS1基因的序列分析

通過分析發(fā)現(xiàn)該基因有一個(gè)長(zhǎng)度為1 131 bp的開放閱讀框，其編碼一個(gè)長(zhǎng)度為376個(gè)氨基酸的序列，預(yù)測(cè)的分子量為41.6 ku、等電點(diǎn)為9.22。5'端有一段192個(gè)堿基的UTR區(qū)域，3' 端有一段包含典型ploy（A）尾巴結(jié)構(gòu)的非編碼序列（圖2）。

通過BlastP比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因的預(yù)測(cè)氨基酸序列與擬南芥的PKS家族基因都具有較高的相似性，多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因與多個(gè)物種的PKS基因家族的蛋白都具有較高的相似性，且具有多個(gè)比較保守的位點(diǎn)，其中與擬南芥等的PKS1蛋白相似性最高達(dá)82%（圖3）。

根據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果，對(duì)該蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與擬南芥的PKS1同處一個(gè)分支，而擬南芥的PKS3和PKS4在另外一個(gè)分支，說明莖瘤芥的PKS1基因應(yīng)該是擬南芥PKS1的同源基因，可能具有與擬南芥PKS1基因相似的分子功能（圖4）。

圖2 BjPKS1基因全長(zhǎng)序列及推導(dǎo)的氨基酸序列示意圖

圖3 BjPKS1蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果

圖4 PKS蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)生樹

2.3 莖瘤芥BjPKS1基因的表達(dá)模式分析

將以上提取的各時(shí)期各組織的RNA逆轉(zhuǎn)錄后，通過熒光定量PCR方法對(duì)該基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。在這些器官發(fā)育過程中，PKS1基因的表達(dá)量具有顯著的表達(dá)差異，該基因在開花期后的花和根中的表達(dá)量明顯較高，這說明該基因與生殖生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)吸收等可能有關(guān)。而從發(fā)育時(shí)期來看，該基因的表達(dá)量在瘤莖開始膨大和膨大后都明顯比未膨大時(shí)高，說明在瘤莖膨大過程中，該基因可能參與了與此相關(guān)的部分功能調(diào)控。

2.4 莖瘤芥BjPKS1基因的遺傳轉(zhuǎn)化

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，獲得了莖瘤芥BjPKS1基因的轉(zhuǎn)擬南芥植株，通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株多個(gè)株系中，BjPKS1基因的表達(dá)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因植株（圖6）。

圖6 BjPKS1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥苗中的表達(dá)模式

比較轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株和正常植株的表型，其葉片顏色比正常植株顯得更深綠（圖7A），轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)育明顯落后于正常植株，高度明顯低于正常植株（圖7B），形成分枝的時(shí)間也明顯滯后。

圖7 BjPKS1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的表型

3 結(jié)論與討論

本研究采用RACE方法克隆了莖瘤芥BjPKS1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分析發(fā)現(xiàn)，該基因與擬南芥PKS1基因具有高度相似性，應(yīng)該同屬于PKS基因家族的成員，可能具有該家族同源基因的相似功能。通過定量PCR發(fā)現(xiàn)，BjPKS1基因的表達(dá)量在瘤莖膨大過程中明顯上升，表明在膨大過程中，該基因可能直接或者間接地參與了膨大的調(diào)控。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，過量表達(dá)的BjPKS1基因影響了擬南芥的發(fā)育過程，表現(xiàn)出抑制植株長(zhǎng)高的性狀，即抑制了擬南芥莖的伸長(zhǎng)，縮短了節(jié)間長(zhǎng)度。盡管擬南芥沒有莖膨大的特征，但有報(bào)道顯示在莖瘤芥中，莖瘤芥一旦發(fā)生抽薹性狀，其瘤莖就會(huì)出現(xiàn)膨大不足，甚至不膨大的現(xiàn)象，這與該基因控制擬南芥的節(jié)間縮短可能有相同原因。在莖瘤芥中，該基因的表達(dá)可能通過抑制莖的抽薹伸長(zhǎng)從而達(dá)到促進(jìn)瘤莖膨大的作用。

Lariguet等［13］研究發(fā)現(xiàn)PKS1是向光性生長(zhǎng)所必需的向光素結(jié)合蛋白，且該蛋白能負(fù)調(diào)控PhyB信號(hào)。Wu等［14］發(fā)現(xiàn)擬南芥中表達(dá)大豆的PhyB基因具有相似功能，且該基因在短日照下加速擬南芥開花，影響下胚軸伸長(zhǎng)。因此，在擬南芥中過表達(dá)BjPKS1可能通過影響PhyB的功能，從而影響了擬南芥表型。此外，PKS1是PhyA信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的組成部分，可以調(diào)節(jié)極低幅照度反應(yīng)（VLFR）［13］。PhyA也具有促進(jìn)植株矮化、色素沉積以及延遲葉片老化等多種功能［12，15］。因此，PhyA信號(hào)途徑可能也受到BjPKS1基因的共同影響，從而導(dǎo)致性狀的改變。綜上所述，BjPKS1在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中具有明顯功能，這為進(jìn)一步弄清該基因在莖瘤芥發(fā)育過程中的功能打下了基礎(chǔ)。

［1］劉義華，張召榮，冷蓉，等.莖瘤芥（榨菜）對(duì)播種期的響應(yīng)及其篩選研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010 （3）：805-809.

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（責(zé)任編輯 張輝玲）

Cloning and genetic transforming of BjPKS1 in tumourous stem mustard （Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）

SUN Quan1，2，Aliya Sidik1，YANG Hong-guo1，BI Jing-lei1，HE Xiao-hong1，CAI Ying-fan2，ZHU Li-quan3
（1.College of Bioinformatics，Chongqing University of Posts and Telecommunications，Chongqing 400065，China；2.State Key Laboratory of Cotton Biology，Henan University，Kaifeng 475004，China；3.College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Tumourous stem mustard （Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee） is an economically and nutritionally important vegetable crop of the Cruciferae family that also provides the raw material for Fuling mustard.In the previous studies，a gene may be associated with the tumor stem swelling was obtained，which was similar to PKS1 gene in Arabidopsis thaliana.In this study，through RACE technology，the full lenth sequence was cloned and named BjPKS1.It had 1 440 bp cDNA and a complete opening reading frame （ORF） of 1 131 bp，containing the initial code （ATG） and terminal code （TAG） （accession number： JN714279）.The predicted protein of complete ORF comprised 376 amino acids.From a search for BjPKS1 cDNA and amino acid sequences in the database，it had highly sequence identity with the PKS1 protein from A.thaliana.We proposed that BjPKS1 may play the same role as PKS1.In addition，expression of BjPKS1 in development of tumor stem swelling was studied by quantitative RT-polymerase chain reaction，and the level in tumor stem swelling stage was obviously higher than that in un-swelling stage，suggesting that BjPKS1 may be related to tumor stem swelling.The BjPKS was genetic transformed to A.thaliana，and the plant height and internode were significantly shorter than WT.

Tumourous stem mustard；PKS1；Tumourous stem；swell；transgenes

S336；Q75

A

1004-874X（2016）05-0049-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.05.010

2015-11-20