中草藥制劑對(duì)草魚生長和非特異性免疫效應(yīng)的研究

姜志勇　王智勇　李志斐

（1.廣東省海洋與漁業(yè)技術(shù)推廣總站　　廣州　510222）（2.惠州市惠城區(qū)水生動(dòng)物防疫檢疫站　　惠州　516001）（3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所　　廣州　510380）

中草藥制劑對(duì)草魚生長和非特異性免疫效應(yīng)的研究

姜志勇1王智勇2李志斐3

（1.廣東省海洋與漁業(yè)技術(shù)推廣總站廣州510222）
（2.惠州市惠城區(qū)水生動(dòng)物防疫檢疫站惠州516001）
（3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所廣州510380）

在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.5g/kg、1.0g/kg和1.5g/kg的中草藥制劑，配制成3種試驗(yàn)飼料，以基礎(chǔ)飼料為對(duì)照組飼料，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行組，對(duì)體重為16克左右的草魚進(jìn)行為期60天的飼養(yǎng)試驗(yàn)，每20天取樣一次，以相對(duì)增重率、成活率為指標(biāo)，探討了中草藥對(duì)草魚生長的影響；以血清中的溶菌酶（LZM）、一氧化氮合酶（NOS）、堿性磷酸酶（AKP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性為指標(biāo)，探討了中草藥制劑對(duì)草魚非特異性免疫效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，飼料中添加“中草藥制劑”可以顯著提高草魚的相對(duì)增重率，降低飼料系數(shù)（P＜0.05）。試驗(yàn)組草魚血清中的LZM、NOS、AKP和SOD等活性均高于對(duì)照組。因此，中草藥制劑具有顯著促生長、提高機(jī)體抗應(yīng)激以及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的作用，建議在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，添加量為1.0g/kg較為合適。

中草藥制劑；草魚；生長；免疫

草魚（Ctenopharyngodon idella）作為傳統(tǒng)淡水養(yǎng)殖品種，在我國具有悠久的養(yǎng)殖歷史，是內(nèi)陸居民的重要食用魚類之一，我國年產(chǎn)量在400多萬噸。隨著草魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害頻繁發(fā)生，其防病抗病的研究也日趨重要。開發(fā)新的免疫增強(qiáng)劑成為草魚研究的重點(diǎn)。

中草藥具有藥源豐富、成本低廉、作用廣泛、低毒、副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，且其中某些成分不僅有抗菌作用，而且有免疫作用，能改善機(jī)體的免疫狀態(tài)，提高自身抗菌能力，同時(shí)還可明顯地提高魚類的生產(chǎn)性能，從而增加了養(yǎng)魚的經(jīng)濟(jì)效益，充分顯示了中草藥在防治魚病上的優(yōu)勢(shì)。近幾年來，中草藥已被廣泛用于水生動(dòng)物養(yǎng)殖中，并且在預(yù)防疾病、加速生長、提高生產(chǎn)性能和改善水產(chǎn)品品質(zhì)等方面取得了明顯的效果。蔡中華等研究了黃連、大黃、無花果及花粉對(duì)鯉非特異性免疫功能的影響，其結(jié)果顯示，除無花果外，黃連、大黃及花粉都對(duì)鯉魚的非特異性免疫功能有增強(qiáng)的作用。王景華報(bào)道，在鯉的飼養(yǎng)過程中添加茯苓多糖，有助于降低其死亡率。大量的應(yīng)用結(jié)果表明，中草藥飼料添加劑作用主要有：增進(jìn)食欲，促進(jìn)日增重和提高水產(chǎn)動(dòng)物的餌料利用率；增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高抗病，抗應(yīng)激能力；改善水生動(dòng)物的肉質(zhì)；增強(qiáng)水生動(dòng)物的繁殖性能；用于人工配合飼料的防霉防腐，保鮮效果顯著。本文研究了一種中草藥制劑對(duì)草魚生長和免疫功能的影響，以期通過刺激草魚自身免疫系統(tǒng)，從而提高機(jī)體防御能力而達(dá)到防治疾病的目的。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1中草藥制劑

中草藥添加劑由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖與營養(yǎng)研究室研制。中草藥添加劑主要成分是大蒜素30%、板藍(lán)根15%、黃芪15%、甘草10%、金銀花10%、杜仲5%、首烏散10%等，輔助添加了維生素C和維生素E。按上述比例混合粉碎，100目過篩后均勻拌飼使用。

1.1.2試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)所需要的草魚取自佛山市南海區(qū)通威水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，暫養(yǎng)1周后開始試驗(yàn)。挑選體質(zhì)健壯、外觀無明顯癥狀、規(guī)格整齊的個(gè)體用于試驗(yàn)。

1.1.3試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所健康養(yǎng)殖基地進(jìn)行。

1.1.4試驗(yàn)條件

試驗(yàn)是在2.0×2.0×1.0m的水泥池中進(jìn)行，試驗(yàn)期間水深0.8m。試驗(yàn)用水為經(jīng)過沙濾的天然池塘水，經(jīng)過沙濾后直接放入養(yǎng)殖池中。試驗(yàn)期間水溫為21.5～28.0℃。絕大多數(shù)時(shí)間在25℃左右。試驗(yàn)整個(gè)過程連續(xù)充氣，上午溶解氧維持在4.0mg/L，下午維持在6.0mg/L左右。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)以中草藥制劑添加水平為試驗(yàn)因子，采用單因素梯度法。添加量設(shè)3個(gè)水平，分別為0組（對(duì)照）、A組（0.5kg/T）、B組（1.0kg/T）和C組（1.5kg/T）。每組設(shè)3個(gè)平行。每個(gè)重復(fù)25尾魚。每種飼料隨機(jī)投喂3個(gè)水泥池。生長試驗(yàn)和免疫試驗(yàn)各自單獨(dú)進(jìn)行?；A(chǔ)飼料配方見表1。

表1試驗(yàn)基礎(chǔ)料配比

1.3日常管理

試驗(yàn)期間日投飼率為3%～5%，具體根據(jù)魚的攝食情況，每天進(jìn)行調(diào)整。每天分2次投喂，分別在上午8：00-9：00和下午16：00-15：00。每天收集殘餌和污物一次，每周換水一次，換水量為30% ～50%。

1.4生長指標(biāo)

試驗(yàn)共60天。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)平行逐尾記數(shù)魚的尾數(shù)計(jì)算成活率，并稱量全部體重。

相對(duì)增重率=（末重-初重）/初重×100%；

餌料系數(shù)=攝食飼料的重量/魚體重增加量；

成活率=收獲尾數(shù)/放養(yǎng)尾數(shù)×100%。

1.5非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定

分別在試驗(yàn)開始后的第20天、40天和60天，每個(gè)水泥池取3尾魚尾部靜脈取血。室溫靜止1小時(shí)后，于4℃冰箱過夜，4000r/min離心5分鐘，取上清液標(biāo)記后放在-20℃冰箱待測(cè)。

選用超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）和溶菌酶（LZM）作為非特異性免疫指標(biāo)。SOD、AKP、LZM和NOS活性采用試劑盒測(cè)定，試劑盒購自南京建成生物研究所。具體測(cè)定步驟按說明書進(jìn)行。

1.6數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，利用方差分析（ANOVA）來檢驗(yàn)各組之間的顯著性。

2　結(jié)果與討論

2.1添加“中草藥制劑”對(duì)草魚生長情況的影響

在飼料中添加“中草藥制劑”飼喂草魚對(duì)其生長情況的影響結(jié)果列于表2。由表2可見，飼料中添加“中草藥制劑”投喂60d，均能顯著提高相對(duì)增重倍數(shù)（P＜0.05），對(duì)成活率的影響以及飼料系數(shù)有一定的影響，表現(xiàn)各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05），但是各個(gè)試驗(yàn)組之間沒有顯著差異。綜合相對(duì)增重率、成活率以及飼料系數(shù)來看，B組效果最好。

表2試驗(yàn)結(jié)果

2.2添加中草藥制劑對(duì)草魚非特異性免疫情況的影響

表3　中草藥制劑對(duì)草魚幾種酶活力的影響

超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，具有催化超氧化物陰離子自由基O2-的歧化反應(yīng)，清除自由基，阻止自由基引起連鎖反應(yīng)，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。從表3可看出，飼料中分別添加不同濃度的“中草藥制劑”，投喂草魚20d后，各試驗(yàn)組組織液中超氧化物歧化酶活性與對(duì)照組相比有明顯差異，且B組與其他兩試驗(yàn)組也存在差異；投喂40d后，超氧化物歧化酶活性著高于基礎(chǔ)料組，與20d時(shí)的情況基本一致；至60d時(shí)，雖然各試驗(yàn)組和對(duì)照組之間還存在差異，但相互之間的差異不再顯著。

NOS可以催化L-精氨酸產(chǎn)生NO，NO能作用于微生物的關(guān)鍵代謝酶，從而抑制代謝酶的活性或使其失活而發(fā)揮抗微生物的作用，還可以和氧自由基作用生成強(qiáng)氧化劑達(dá)到殺滅微生物的作用。從表3可看出，飼料中分別添加不同濃度的“中草藥制劑”，投喂草魚20d后，各試驗(yàn)組組織液中NOS活性與對(duì)照組相比有明顯差異；投喂40d后，NOS活性著高于基礎(chǔ)料組，且C組與其他兩組之間存在顯著差異；至60d時(shí)，各試驗(yàn)組和對(duì)照組之間還存在差異，C組與其他兩組之間同樣存在顯著差異。

AKP是巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的標(biāo)志酶，是溶酶體的重要組成部分，已經(jīng)有研究結(jié)果證明，在甲殼動(dòng)物血細(xì)胞進(jìn)行吞噬和包圍化的免疫反應(yīng)中，會(huì)伴隨有AKP的釋放。從表3可看出，飼料中分別添加不同濃度的“中草藥制劑”，投喂草魚20d后，B、C組組織液中AKP活性與對(duì)照組相比有明顯差異，并且兩者之間也存在顯著差異，但A組和對(duì)照組之間差異不顯著；投喂40d后，AKP活性與20d時(shí)情況相似；至60d時(shí)，A、B組和對(duì)照組之間還存在差異，但C組與對(duì)照組相比差異不顯著。

LZM在引發(fā)和維持機(jī)體防御免疫的過程中起著重要的作用。它在機(jī)體免疫過程中除了溶解細(xì)菌細(xì)胞壁外，還可誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌。從表3可看出，飼料中分別添加不同濃度的“中草藥制劑”，投喂草魚20d后，各試驗(yàn)組組織液中LZM活性與對(duì)照組相比有明顯差異；投喂40d后，LZM活性著高于基礎(chǔ)料組，且A組與其他兩組之間存在顯著差異；至60d時(shí)，各試驗(yàn)組和對(duì)照組之間還存在差異，但兩兩之間不存在顯著差異。

3　討論

3.1中草藥添加劑對(duì)草魚生長性能的影響

在草魚基礎(chǔ)飼料中添加一定量的中草藥添加劑能顯著提高草魚的相對(duì)增重率、提高成活率、降低飼料系數(shù)。研究表明，中草藥含有多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，通常有多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、油脂、酶、色素、維生素、有機(jī)酸、鞣質(zhì)、生物堿、黃酮、甙類、無機(jī)鹽等，以及一些未知的促生長活性物質(zhì)，作為餌料添加劑，有補(bǔ)充營養(yǎng)、促進(jìn)生長的作用。段賢彩用辣蓼草、松針等組方，在飼料中添加l%飼喂草魚、鯉魚，成活率從30%～50%提高到70%～80%，畝產(chǎn)量增加了200%；韓如政在l齡和2齡鯉餌料中分別添加0.4%的復(fù)方中草藥，可提高18%的生長速度，餌料系數(shù)降低18.2%～24%。與本次試驗(yàn)結(jié)果相一致。

3.2復(fù)方中草藥對(duì)草魚肝臟六種酶活力的影響

抗生素雖然在抵抗疾病能力等方面具有一定的效果，但也存在很大的副作用，它不僅破壞免疫力，而且會(huì)造成一定的環(huán)境負(fù)效應(yīng)，中草藥等無殘留、無污染且又能增強(qiáng)免疫力的“綠色”藥物逐漸被廣泛開發(fā)和應(yīng)用。它主要是通過促進(jìn)機(jī)體免疫器官發(fā)育、增加非特異性免疫和特異性免疫等途徑來增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。機(jī)體非特異性免疫功能狀態(tài)直接反映出機(jī)體的抗逆能力強(qiáng)弱。超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）和溶菌酶（LZM）可作為非特異性免疫功能強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)指標(biāo)。梁擁軍等在基礎(chǔ)飼料中添加0.5%、1.0%、2.0%復(fù)方中草藥飼養(yǎng)寶石鱸，結(jié)果表明，添加1.0%復(fù)方中草藥可顯著提高寶石鱸肝臟中SOD、溶菌酶和過氧化氫酶活性。劉紅柏等研究認(rèn)為，1.0%與2.0%黃芪水煎劑可顯著提高史氏鱘肝臟中的NO含量。劉紅柏等研究了6個(gè)復(fù)方和5個(gè)單方中草藥對(duì)施氏鱘血漿和肝臟中酶指標(biāo)的影響，認(rèn)為三黃粉、甘草復(fù)方方劑能顯著性增加施氏鱘血漿和組織樣中NOS的含量。本試驗(yàn)用添加了一定量復(fù)方中草藥的飼料飼喂草魚，測(cè)定其血清中超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）和溶菌酶（LZM）四種酶活性的影響，結(jié)果顯示，復(fù)方中草藥可以不同程度提高草魚血清中相關(guān)酶的活力。試驗(yàn)結(jié)果表明，在基礎(chǔ)飼料中添加一定量的復(fù)方中草藥制劑，可以提高草魚的非特異性免疫功能。

4　結(jié)語

4.1飼料中添加中草藥制劑能顯著提高草魚溶菌、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶和一氧化氮合酶的活性，提高機(jī)體抗病能力。

4.2飼料中添加中草藥制劑，可以提高草魚的生長速度。

4.3從本次試驗(yàn)來看，飼料中中草藥制劑的適宜添加量為1.0g/kg。

（略）

資金項(xiàng)目：廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：B20140C01）資助。