花絨寄甲HSP70基因的特征與表達(dá)1)

郝春鳳　王化鵬　張正青　常勇　李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

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花絨寄甲HSP70基因的特征與表達(dá)1)

郝春鳳王化鵬張正青常勇李孟樓

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100)

摘要為闡明熱休克蛋白70(HSP70)在花絨寄甲(Dastarcus helophoroides)發(fā)育及雌雄成蟲(chóng)抵抗環(huán)境脅迫中的作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了其在發(fā)育階段和環(huán)境脅迫時(shí)的表達(dá)情況。從花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中獲得3條HSP70基因，分別命名為D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88。發(fā)育階段定量結(jié)果顯示，3條HSP70在所有發(fā)育階段均有表達(dá)，D.hHSP69.09在1齡幼蟲(chóng)期表達(dá)量最高；D.hHSP70.11和D.hHSP71.88在雄蟲(chóng)中表達(dá)量最高。在檢測(cè)的成蟲(chóng)組織中，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11在卵巢表達(dá)量最高；D.hHSP71.88在脂肪體中表達(dá)量最高。HSP70基因隨溫度升高(23 ℃升至44 ℃)、41 ℃下處理時(shí)間(0～270 min)延長(zhǎng)、氧化劑濃度(0～70 mmol·L-1)的升高表達(dá)量先增加后減少，雌雄表達(dá)量差異較大。饑餓試驗(yàn)顯示，雌雄蟲(chóng)表達(dá)模式不同；隨饑餓時(shí)間延長(zhǎng)，雄蟲(chóng)HSP70基因表達(dá)量有所降低，雌蟲(chóng)一定時(shí)間內(nèi)有所上升。因此，花絨寄甲HSP70可能與不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)換、幼蟲(chóng)的蛻皮行為相關(guān)； HSP70對(duì)溫度、氧化和饑餓脅迫的應(yīng)激敏感程度和表達(dá)水平不同，能夠有效應(yīng)對(duì)高溫、氧化、饑餓等環(huán)境脅迫。

關(guān)鍵詞花絨寄甲；逆境脅迫；HSP70；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

花絨寄甲(Dastarcus helophoroides)是多種林木蛀干害蟲(chóng)如栗山天牛(Massicus raddei)、云斑天牛(Batocera horsfieldi)、松褐天牛(Monochamus alternatus)、光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)、銹色粒肩天牛(Apriona swainsoni)等最為有效的天敵昆蟲(chóng)[1]，其幼蟲(chóng)寄生在天牛末齡幼蟲(chóng)和蛹上[2]。有報(bào)道指出，高溫等環(huán)境脅迫能夠顯著影響昆蟲(chóng)的存活、發(fā)育和生殖[3-4]?；ńq寄甲成蟲(chóng)有著相對(duì)較長(zhǎng)的壽命，人工飼養(yǎng)8 a以上，在自然環(huán)境中，由于各種不利環(huán)境因素的影響，比如氣候變化、生態(tài)環(huán)境惡化、病原微生物的入侵等，花絨寄甲的壽命往往達(dá)不到人工飼養(yǎng)條件下的壽命。由自然界中的逆境傷害所引起的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集對(duì)細(xì)胞的生存造成重要的威脅[5]。然而，昆蟲(chóng)已進(jìn)化出一系列生理方面的策略來(lái)避免逆境造成的傷害，如昆蟲(chóng)通過(guò)調(diào)節(jié)熱休克蛋白的合成來(lái)維持細(xì)胞蛋白平衡。熱休克蛋白作為分子伴侶，與其他保護(hù)蛋白和輔助蛋白一致，在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、定位和降解等必要的生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[6-7]。

熱激反應(yīng)是生物體自我保護(hù)的重要機(jī)制之一，首次發(fā)現(xiàn)于黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的短暫熱應(yīng)激過(guò)程[8]。熱休克蛋白家族作為一個(gè)大家族，依據(jù)分子質(zhì)量大小及其序列相似性，將HSP分為5個(gè)家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和small HSPs(sHSPs)[9]。其中，HSP70被認(rèn)為是最重要、最保守的熱休克蛋白家族,具有最高溫度敏感性。一般通過(guò)分子伴侶作用、抗氧化作用、協(xié)同免疫作用和抗細(xì)胞凋亡作用對(duì)出現(xiàn)的應(yīng)激有保護(hù)耐受作用[10]。

目前，熱休克蛋白在抵抗熱脅迫方面的重要作用已經(jīng)得到了人們的廣泛認(rèn)識(shí)[11-12]。當(dāng)環(huán)境溫度高于正常水平時(shí)，誘導(dǎo)性熱休克蛋白就會(huì)合成，從而能夠增加生物體對(duì)高溫的耐受力，保護(hù)機(jī)體免受熱損傷[13]。雖然熱休克反應(yīng)在果蠅中首次被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)昆蟲(chóng)熱休克蛋白的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如細(xì)菌、植物和哺乳類(lèi)動(dòng)物。除了分子伴侶的基本功能外，最近研究表明，HSP70還可能與昆蟲(chóng)的發(fā)育有關(guān)，特別是幼蟲(chóng)到蛹的轉(zhuǎn)變過(guò)程。在斑潛蠅(Liriomyza sativae)的研究中蛹期3條sHSPs的表達(dá)量最高，3條sHSPs的表達(dá)量隨著發(fā)育不斷上升[14]。在小菜蛾(Mamestra brassicae)的研究中也表現(xiàn)出相似的結(jié)果[15]。

隨著對(duì)熱休克蛋白認(rèn)識(shí)的不斷深入，熱休克蛋白應(yīng)對(duì)高溫、低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究，雖然人們已經(jīng)明確知道熱休克蛋白的功能還有很多，如抗氧化、饑餓等，但對(duì)于其他抗性的研究并不多見(jiàn)。近年來(lái)，抗逆性研究是科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展與成熟使研究基因表達(dá)不再局限于模式物種[16-17]。

利用釋放花絨寄甲防治天牛類(lèi)害蟲(chóng)，高效、對(duì)環(huán)境友好。花絨寄甲具有耐高溫、耐饑餓等特性，對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)。在中國(guó)，花絨寄甲作為防治天牛類(lèi)害蟲(chóng)的重要天敵昆蟲(chóng)，在生物的防治中具有重要的地位，而對(duì)于花絨寄甲熱休克蛋白方面的研究尚未開(kāi)展。不同種類(lèi)的熱休克蛋白在抵抗環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮的作用及表達(dá)模式尚不明確。因此，研究花絨寄甲熱休克蛋白70家族是十分必要的。

從花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中獲得3條HSP70基因，通過(guò)RT-qPCR分析其在不同發(fā)育階段與組織中的表達(dá)模式。檢測(cè)花絨寄甲對(duì)不同環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。應(yīng)用RT-qPCR的方法探究HSP基因在非生物應(yīng)激(如高溫、氧化、饑餓處理)中的表達(dá)特性，分析HSP70在非生物應(yīng)激中的作用。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx(chóng)和處理方式

花絨寄甲幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林害蟲(chóng)生物防治實(shí)驗(yàn)室提供?；ńq寄甲成蟲(chóng)用主要成分為蠶蛹粉的人工飼料飼養(yǎng)在人工氣候箱內(nèi)。飼養(yǎng)條件為，溫度(23±1)℃、相對(duì)濕度70%～80%、光照周期16 h光照8 h黑暗。

溫度處理：用干式恒溫器對(duì)雌雄成蟲(chóng)進(jìn)行溫度處理，包括不同溫度(26、29、35、38、41、44 ℃)刺激2 h后保存；41 ℃處理不同時(shí)間(0、30、60、90、120、150、180、210、240、270 min)后保存。

饑餓處理：將待試雌雄成蟲(chóng)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，飼養(yǎng)在相同條件下，對(duì)照組正常喂食，試驗(yàn)組不進(jìn)行喂食，按照時(shí)間梯度(2 d)收集后保存。

氧化處理：用百草枯作為氧化劑。成蟲(chóng)用0、10、20、30、40、50、60、70 mmol·L-1的百草枯處理2 h，選取HSP表達(dá)敏感的濃度進(jìn)行不同時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6 h)處理。

饑餓處理：由于雌雄成蟲(chóng)在饑餓條件下存活時(shí)間不同，選取雌蟲(chóng)饑餓條件下(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 d)的樣品，雄蟲(chóng)饑餓條件下(0、2、4、6、8、10、12、14、16 d)的樣品。

成蟲(chóng)組織分離：將活的成蟲(chóng)置于冰上解剖，迅速分離頭、胸、中腸、后腸、脂肪體、精巢、卵巢及殘?bào)w，用生理鹽水沖洗后立即保存。

所有試驗(yàn)樣本選取后立即放入液氮中冷凍，并于冰箱中-80 ℃保存。每個(gè)處理均進(jìn)行3個(gè)生物重復(fù)。

1.2花絨寄甲HSP70序列檢索

花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中所有序列已經(jīng)通過(guò)NCBI中的Blastx工具在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋?zhuān)⑨尳攸c(diǎn)E值為10-5。通過(guò)在轉(zhuǎn)錄組中的注釋文件中檢索關(guān)鍵詞(HSP或者h(yuǎn)eat shock protein)篩選出花絨寄甲的HSP70序列。

1.3序列分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

采用NCBI中的ORF finder工具，分析HSP70其可能的開(kāi)放閱讀框并翻譯為氨基酸。對(duì)所有的HSP70氨基酸序列進(jìn)行氨基酸組成分析；獲得的氨基酸序列通過(guò)ExPASy的compute pI/Mw工具預(yù)測(cè)蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。通過(guò)Blast將cDNA和氨基酸序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的其他物種序列進(jìn)行比較。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載鞘翅目的赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、異色瓢蟲(chóng)(Harmonia axyridis)、馬鈴薯葉甲(Leptinotarsa decemlineata)、大猿葉甲(Colaphellus bowringi)，鱗翅目的八字地老虎(Xestia cnigrum)、二化螟(Chilo suppressalis)，半翅目的扶桑綿粉(Phenacoccus solenopsis)、褐飛虱(Nilaparvata lugens)，以及雙翅目的致倦庫(kù)蚊(Culex quinquefasciatus)的HSP70氨基酸序列，利用ClastalW軟件對(duì)所有下載的HSP70和花絨寄甲的HSP70進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)后用Mega 5.02分析其演化關(guān)系，采用Neighbor-joining算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，置信度設(shè)置為1 000[16]。

1.4生物信息學(xué)分析

保守區(qū)域檢測(cè)：NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

等電點(diǎn)及分子質(zhì)量預(yù)測(cè)：http://us.expasy.org/tools/peptidemass.html。

蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)：PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)http://cn.expasy.org/prosite。

DNAman 5.5.2軟件用于氨基酸或者核苷酸的多序列比對(duì)；MEGA 5.2軟件用于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及分析；Photoshop 10軟件用于圖像處理。

1.5總RNA提取和第1鏈cDNA合成

花絨寄甲樣品均用Trizol reagent試劑盒(Sangon，上海)提取其總RNA。總RNA的質(zhì)量和濃度在Maestro-NANO UV spectrophotometer上用分光光度法測(cè)定。每個(gè)重復(fù)各取1 μg的總RNA構(gòu)建20 μL的反應(yīng)體系，使用oligo(dT)18引物和Moloney Murine Leukemia virus(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶(Sangon，上海)進(jìn)行第1鏈cDNA的合成。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR)表達(dá)分析

完成每個(gè)樣第1鏈cDNA的合成后，用RT-qPCR技術(shù)在Bio-rad IQ5儀器上測(cè)定HSP70 mRNA的表達(dá)量。染料選用SYBR Green Mix(CWBIO，北京)。根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果，內(nèi)參基因用EF-1α和α-Tubulin。每對(duì)定量引物通過(guò)10倍稀釋的模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證，引物見(jiàn)表1。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)中所用引物

RT-qPCR試驗(yàn)采用20 μL的反應(yīng)體系進(jìn)行，循環(huán)條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.7數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算分析[18]。數(shù)據(jù)顯著差異性分析采用SPSS中的Tukey方法。用Origin 8.5進(jìn)行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1花絨寄甲HSP70基因的檢索和序列分析

通過(guò)搜索花絨寄甲成蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)得到3條HSP70基因，經(jīng)NCBI的Blastp工具在線比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其同源性與其他昆蟲(chóng)的HSP70基因同源性最高，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小分別命名為D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88。

D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88基因的ORF大小分別為1 980、1 967、1 910 bp，編碼626、636和655個(gè)氨基酸。利用在線軟件對(duì)HSP70進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88的理論等電點(diǎn)分別為5.57、6.01和5.93，相對(duì)分子質(zhì)量約為69 092、70 112、71 881。

編碼的氨基酸組成中，D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88分別含有73、70、73個(gè)谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)，占總氨基酸的比例分別為11.7%、11.0%和11.2%。

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88與其他昆蟲(chóng)(T.castaneum、H.axyridis、L.decemlineata、X.cnigrum、C.suppressalis、P.solenopsis、N.Culex quinquefasciatus)的HSP基因的同源性在65%～100%(圖1)。

暖風(fēng)器入口風(fēng)溫是暖風(fēng)器設(shè)計(jì)的一個(gè)重要參數(shù)，按照《GB 50660—2011大中型火力發(fā)電廠設(shè)計(jì)規(guī)范》：“選擇暖風(fēng)器所用的環(huán)境溫度，對(duì)采暖地區(qū)宜取用冬季采暖室外計(jì)算溫度,對(duì)非采暖區(qū)宜取用冬季最冷月平均溫度，并適當(dāng)留有加熱器面積”[1]，但是在實(shí)際運(yùn)行中發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)寒地區(qū)暖風(fēng)器出口風(fēng)溫不滿足空預(yù)器入口溫度的要求。

利用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)氨基酸序列進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)(表2)，3條HSP70基因中均具有3個(gè)HSP70簽名序列，位置大致相同。3條HSP70基因的簽名序列1均相同，D.hHSP69.09與D.hHSP70.11的簽名序列2相同，3條HSP70的簽名序列3均有所不同。

表2　花絨寄甲HSP70基因氨基酸序列功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)

在D.hHSP69.09和D.hHSP70.11的C-末端存在V/IEEVD基序。有研究表明，C-末端保守的V/IEEVD基序與分子伴侶輔助因子的識(shí)別有關(guān)，能夠使HSP70綁定到其他協(xié)同伴侶上[19]，表明D.hHSP69.09和D.hHSP70.11是一種細(xì)胞質(zhì)型HSP。D.hHSP71.88的C-末端為IDEAD，目前尚未找到關(guān)于該序列的研究。

從NCBI上通過(guò)比對(duì)下載氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。圖2表明，3條序列分為3個(gè)獨(dú)立進(jìn)化支，其中，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11所在分支親緣關(guān)系更近，D.hHSP71.88單獨(dú)在另一分支。從進(jìn)化樹(shù)上可見(jiàn)，D.hHSP69.09和同屬鞘翅目的大猿葉甲、馬鈴薯葉甲的HSP70基因遺傳距離較近；D.hHSP70.11與同屬鞘翅目的赤擬谷盜的HSP70基因遺傳距離最近。

黑色背景.一致性為100%；灰色背景.一致性大于等于75%。

圖2　花絨寄甲HSP70基因與GeneBank已登錄的其他物種的HSP70基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2定量PCR

2.2.1HSP70在花絨寄甲不同發(fā)育階段的表達(dá)

以EF-1α作為內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)，分析HSP70 mRNA在不同發(fā)育階段中的表達(dá)模式。表3所示，3條基因的表達(dá)水平在花絨寄甲整個(gè)發(fā)育過(guò)程中波動(dòng)很大。D.hHSP69.09在1齡幼蟲(chóng)期表達(dá)量最高；D.hHSP70.11和D.hHSP71.88在雄蟲(chóng)中表達(dá)水平最高。3條HSP70在蛹期的相對(duì)表達(dá)量均較高。表明，3條HSP70基因表達(dá)的增強(qiáng)總是與不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，包括幼蟲(chóng)-蛹、蛹-成蟲(chóng)的轉(zhuǎn)換。通過(guò)SPSS分析，老熟幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)之間HSP70的表達(dá)量在生物學(xué)統(tǒng)計(jì)上差異顯著。

幼蟲(chóng)階段HSP70基因隨齡期的增加，mRNA的表達(dá)量逐漸減小，因此，推測(cè)HSP70基因可能和花絨寄甲幼蟲(chóng)的發(fā)育存在某種關(guān)系。

表3　花絨寄甲不同發(fā)育階段HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2HSP70在花絨寄甲不同組織中的表達(dá)

為探究花絨寄甲HSP70基因組織分布特性，以EF-1α作為內(nèi)參基因，對(duì)HSP70基因在頭、胸、精巢、卵巢、中腸、后腸和脂肪體中表達(dá)量進(jìn)行分析。HSP70基因在不同組織中表達(dá)量的異同可能反映在一個(gè)特定的組織對(duì)熱休克蛋白的需要。

表4所示，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在卵巢中最高，其次在中腸。D.hHSP71.88基因在脂肪體中相對(duì)表達(dá)量最高，其次在精巢。HSP70基因相對(duì)表達(dá)量在脂肪體和中腸中相對(duì)較高。

表4　花絨寄甲不同組織中HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.3高溫應(yīng)激反應(yīng)下花絨寄甲HSP70的表達(dá)

以α-Tubulin作為內(nèi)參基因，分析HSP70基因在高溫應(yīng)激下的表達(dá)模式。表5顯示，雌雄成蟲(chóng)HSP70 mRNA的表達(dá)量存在明顯差異。在23 ℃時(shí)，D.hHSP69.09雌蟲(chóng)mRNA的表達(dá)量顯著高于雄蟲(chóng)，雌蟲(chóng)的表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的2倍；與D.hHSP69.09不同，D.hHSP70.11和D.hHSP71.88雄蟲(chóng)mRNA的表達(dá)量顯著高于雌蟲(chóng)，D.hHSP70.11雄蟲(chóng)的表達(dá)量約為雌蟲(chóng)的5倍；D.hHSP70.11雄蟲(chóng)的表達(dá)量約為雌蟲(chóng)的150倍。

表5　不同溫度(處理2 h)下花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

高溫刺激下HSP70基因均被誘導(dǎo)，表達(dá)趨勢(shì)相似。隨溫度上升，表達(dá)量逐漸升高，至一定溫度后下降。但是，不同基因表達(dá)程度存在巨大差異，表達(dá)量最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的溫度不同。雌雄成蟲(chóng)中D.hHSP69.09在38 ℃高溫刺激時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，其中，雌蟲(chóng)的mRNA表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的3倍。D.hHSP70.11雌蟲(chóng)在38 ℃高溫刺激時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，雌蟲(chóng)的mRNA表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的2倍，雄蟲(chóng)在35 ℃高溫刺激時(shí)mRNA表達(dá)量最高，雄蟲(chóng)的mRNA表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的12倍。D.hHSP71.88雌蟲(chóng)在38 ℃高溫刺激時(shí)表達(dá)量最高，雄蟲(chóng)的mRNA表達(dá)量約為雌蟲(chóng)的3倍；雄蟲(chóng)在38 ℃高溫刺激時(shí)表達(dá)量最高，雄蟲(chóng)的mRNA表達(dá)量約為雌蟲(chóng)的77倍。

為更好地分析HSP70基因在高溫刺激下的生理作用，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)較為敏感的溫度41 ℃做不同時(shí)間熱激處理。由表6可見(jiàn)，3條基因均出現(xiàn)隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而誘導(dǎo)增加的趨勢(shì)。41 ℃高溫刺激后短時(shí)間內(nèi)雌蟲(chóng)HSP70基因表達(dá)量明顯高于雄蟲(chóng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)雄蟲(chóng)的表達(dá)量高于雌蟲(chóng)。

表6　41 ℃處理不同時(shí)間時(shí)花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.4氧化脅迫下花絨寄甲HSP的表達(dá)

由表7可見(jiàn)，以α-Tubulin作為內(nèi)參基因，在不同濃度氧化處理下HSP70表現(xiàn)出被誘導(dǎo)，表達(dá)量先升高后下降；雌雄成蟲(chóng)HSP70 mRNA的表達(dá)量存在顯著差異。D.hHSP69.09雌蟲(chóng)mRNA的表達(dá)量顯著高于雄蟲(chóng)，雌蟲(chóng)在20 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，約為雄蟲(chóng)的3.8倍；雄蟲(chóng)在30 mmol·L-1時(shí)最高，雌蟲(chóng)的表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的1.8倍；D.hHSP70.11和D.hHSP71.88雄蟲(chóng)mRNA的表達(dá)量顯著高于雌蟲(chóng)。D.hHSP70.11和D.hHSP71.88雌蟲(chóng)在20 mmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，其中，D.hHSP70.11雌蟲(chóng)的表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的3.8倍，D.hHSP71.88雌蟲(chóng)的表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的100倍，D.hHSP70.11雄蟲(chóng)在30 mmol·L-1時(shí)最高，雌蟲(chóng)的表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的2.3倍；D.hHSP71.88雄蟲(chóng)在20 mmol·L-1時(shí)最高，雌蟲(chóng)的表達(dá)量約為雄蟲(chóng)的19倍。

表7　氧化脅迫下花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.5饑餓處理下花絨寄甲HSP的表達(dá)

在相同的饑餓條件處理下，花絨寄甲雌蟲(chóng)耐饑餓能力高于雄蟲(chóng)，雌性成蟲(chóng)可存活超過(guò)一月，但是雄成蟲(chóng)只能存活半月。

以α-Tubulin作為內(nèi)參基因，由表8所示，在饑餓刺激下雌雄蟲(chóng)表達(dá)水平不同。隨饑餓處理時(shí)間延長(zhǎng)，雄蟲(chóng)中HSP70基因mRNA的表達(dá)量降低，表現(xiàn)出被抑制。

3討論

昆蟲(chóng)產(chǎn)生熱休克蛋白來(lái)抵御環(huán)境中的各種壓力，如極端高溫、種群密集、干燥缺水和低氧等不利生活條件。熱休克蛋白可以保護(hù)機(jī)體蛋白在壓力脅迫下發(fā)生不可逆變性，而且促進(jìn)在脅迫刺激后蛋白的折疊和降解。HSP70被認(rèn)為通過(guò)形成分子網(wǎng)絡(luò)在蛋白合成、抗壓能力和滯育方面等發(fā)揮著非常重要的作用。大量表達(dá)的熱休克蛋白是昆蟲(chóng)生存的重要調(diào)節(jié)器，參與昆蟲(chóng)的正常發(fā)育和滯育行為。熱休克蛋白在面對(duì)諸多非生物刺激時(shí)如高溫和寒冷、紫外輻射、重金屬、化學(xué)殺蟲(chóng)劑等不良環(huán)境時(shí)，其表達(dá)量顯著被誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)。

3.1花絨寄甲HSP70基因的結(jié)構(gòu)

對(duì)D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP71.88氨基酸序列分析顯示，花絨寄甲HSP70與其他昆蟲(chóng)HSP70具有較高的同源性。結(jié)構(gòu)與功能有著密切聯(lián)系，利用PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)，3條HSP70基因中均具有3條HSP70家族的簽名序列，位置大致相同。此外，在D.hHSP69.09和D.hHSP70.11的C-末端存在的V/IEEVD基序，表明D.hHSP69.09和D.hHSP70.11是一種細(xì)胞質(zhì)型HSP70。而D.hHSP71.88的C-末端為IDEAD，目前尚未找到關(guān)于該序列的文獻(xiàn)。

表8　饑餓脅迫下花絨寄甲HSP70的表達(dá)模式

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

花絨寄甲HSP70基因編碼的氨基酸組成中，Gln和Glu在總氨基酸中的比例較高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白質(zhì)在遭受高溫脅迫時(shí)，Gln和Glu可能通過(guò)提供額外的靜電作用力維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定[20]。

3.2花絨寄甲HSP70基因的時(shí)間和空間特異性

昆蟲(chóng)的發(fā)育階段是決定一個(gè)昆蟲(chóng)的耐熱性和耐寒性的一個(gè)重要的因素[21]?；ńq寄甲HSP70基因mRNA表達(dá)在花絨寄甲整個(gè)發(fā)育過(guò)程中波動(dòng)很大，波動(dòng)總與不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，包括幼蟲(chóng)-蛹、蛹-成蟲(chóng)。在完全變態(tài)昆蟲(chóng)中，不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)換總是伴隨相關(guān)基因表達(dá)水平的劇烈波動(dòng)[22]。在意大利蜜蜂(Apis mellifera)中，卵-幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)換改變了65種蛋白和34種磷蛋白的表達(dá)水平，新孵化幼蟲(chóng)增強(qiáng)了蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞骨架及代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，以確保意大利工蜂的快速生長(zhǎng)[23]。因此，花絨寄甲HSP70基因在不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)換時(shí)的高水平表達(dá)暗示著其可能通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)折疊來(lái)參與花絨寄甲的發(fā)育過(guò)程。幼蟲(chóng)階段HSP70基因隨著齡期的增加，mRNA的表達(dá)量逐漸減小，推測(cè)HSP70基因可能和花絨寄甲幼蟲(chóng)的蛻皮存在某種關(guān)系。

昆蟲(chóng)中HSP70的表達(dá)模式顯示出明顯的組織特異性。HSP70基因相對(duì)表達(dá)量在脂肪體和中腸中較高，推測(cè)其可能參與對(duì)外源毒物的解毒和氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，說(shuō)明熱休克蛋白可能在保護(hù)昆蟲(chóng)機(jī)體免受外源毒物損害存在潛在作用[23]。

D.hHSP69.09和D.hHSP70.11 mRNA在精巢中相對(duì)表達(dá)量最高，表明其可能與雄性生殖系統(tǒng)存在某種關(guān)系。精子發(fā)育對(duì)高溫極其敏感。果蠅的初級(jí)精母細(xì)胞在導(dǎo)入HSP70后對(duì)高溫遲鈍[24]。對(duì)中國(guó)樟木天蠶蛾(Antheraea pernyi)的研究中發(fā)現(xiàn)，Ap-sHSP21在高溫誘導(dǎo)后，在精巢中的表達(dá)水平明顯高于其他組織[25]。在黑腹果蠅的雄配子發(fā)育過(guò)程中觀察到熱休克蛋白。HSP26在精子和卵子的發(fā)育中表達(dá)水平需要被調(diào)整[26]。HSP27在精子細(xì)胞減數(shù)分裂后期也被檢測(cè)到[27]。由組織特異性分析結(jié)果推測(cè)，D.hHSP69.09和D.hHSP70.11可能參與花絨寄甲雄性生育調(diào)節(jié)過(guò)程。

3.3花絨寄甲HSP70基因在不同非生物應(yīng)激中的表達(dá)特性

溫度是重要的環(huán)境因素，它能誘導(dǎo)生物體發(fā)生相關(guān)生理變化而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[28]。在高溫脅迫下，昆蟲(chóng)會(huì)出現(xiàn)各種熱害反應(yīng)。高溫會(huì)加快昆蟲(chóng)體內(nèi)水分的散失，影響昆蟲(chóng)正常的生理代謝；高溫還會(huì)改變昆蟲(chóng)體內(nèi)代謝途徑，誘發(fā)細(xì)胞中的活性氧簇(ROS)大量增加，從而對(duì)蟲(chóng)體造成傷害。同時(shí)，昆蟲(chóng)具有一定程度的環(huán)境適應(yīng)性。熱休克蛋白在昆蟲(chóng)耐溫度脅迫中發(fā)揮著重要作用，可提高昆蟲(chóng)對(duì)不良環(huán)境的耐受性，保護(hù)昆蟲(chóng)免受或少受脅迫傷害[29]?；ńq寄甲作為變溫動(dòng)物，它的分布及生存深受環(huán)境溫度的限制，花絨寄甲具有較高的耐高溫特性，最高生存溫度能達(dá)到47 ℃；雌雄成蟲(chóng)HSP70 mRNA的表達(dá)量存在明顯差異，在高溫刺激下，HSP70基因均被誘導(dǎo)，表達(dá)模式相同，隨溫度上升，表達(dá)量逐漸升高至一定溫度后下降。但不同基因表達(dá)程度存在巨大差異，表達(dá)量最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的溫度不同。因此，花絨寄甲HSP70基因被高溫誘導(dǎo)表達(dá)下過(guò)表達(dá)，意味著HSP70基因可能在花絨寄甲熱應(yīng)激反應(yīng)中，通過(guò)分子伴侶活性發(fā)揮重要的保護(hù)作用。

以往研究已經(jīng)揭示高濃度的活性氧會(huì)對(duì)機(jī)體生物大分子產(chǎn)生嚴(yán)重危害，如蛋白、核苷酸和其他細(xì)胞組件等[30]。為減輕過(guò)氧化物的損傷，機(jī)體產(chǎn)生了相應(yīng)的防御系統(tǒng)。許多研究已經(jīng)證實(shí)，氧化損傷可被多種環(huán)境條件誘導(dǎo)產(chǎn)生，包括溫度、殺蟲(chóng)劑、紫外輻射和重金屬等[31]。

熱休克蛋白被認(rèn)為是響應(yīng)氧化損傷時(shí)細(xì)胞中重要的調(diào)節(jié)器[32]。采用百草枯作為氧化刺激源，結(jié)果表明，根據(jù)花絨寄甲在百草枯氧化應(yīng)激后熱休克蛋白表達(dá)量的變化模式推測(cè)，熱休克蛋白在花絨寄甲抗氧化脅迫中發(fā)揮著重要作用。本結(jié)果為熱休克蛋白的抗氧化功能提供了又一理論依據(jù)。

饑餓刺激會(huì)對(duì)昆蟲(chóng)產(chǎn)生一系列的復(fù)雜影響，包括營(yíng)養(yǎng)缺乏、離子平衡被打破以及水平衡失調(diào)等[14]。大量研究報(bào)導(dǎo)表明，饑餓可誘導(dǎo)熱休克蛋白基因的表達(dá)[33]。在對(duì)蝶蛹金小峰(Pteromalus puparum)的研究中發(fā)現(xiàn)，饑餓處理24 h后，4條熱休克蛋白基因的表達(dá)水平發(fā)生明顯變化[34]?；ńq寄甲雌蟲(chóng)的耐饑餓能力高于雄蟲(chóng)。在相同的饑餓條件下，雌性成蟲(chóng)可存活超過(guò)一月，但雄成蟲(chóng)只能存活半月。饑餓脅迫環(huán)境下花絨寄甲雌雄蟲(chóng)HSP70 mRNA的表達(dá)水平不同，雄蟲(chóng)中3條HSP70基因均被抑制；短時(shí)間的饑餓處理，雌成蟲(chóng)中HSP70基因出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。推測(cè)HSP70基因在雌雄成蟲(chóng)中的不同表達(dá)模式可能與花絨寄甲耐饑能力以及饑餓壽命相關(guān)。有研究指出，HSP70與昆蟲(chóng)衰老有重要關(guān)系[24]，這也為下一步的研究提供了方向。

4結(jié)論

從花絨寄甲轉(zhuǎn)錄組中獲得3條熱休克蛋白70基因，分析序列的基本結(jié)構(gòu)特征以及與其他昆蟲(chóng)HSP70之間的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)花絨寄甲具有HSP70多樣性，在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性。利用Real-time PCR技術(shù)對(duì)花絨寄甲HSP70在不同發(fā)育階段以及在高溫、氧化、饑餓刺激下的表達(dá)模式研究，HSP70在花絨寄甲生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖過(guò)程中和抗氧化、抗饑餓等不良環(huán)境刺激下發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果將有助于在分子水平上來(lái)評(píng)估花絨寄甲的抗逆性能力，而花絨寄甲作為生物防治中重要的天敵昆蟲(chóng)，在天牛類(lèi)害蟲(chóng)生物防治中具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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第一作者簡(jiǎn)介：郝春鳳，女，1989年4月生，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:hlzsdau2009@163.com。 通信作者：李孟樓，西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:limenglou@hotmail.com。

收稿日期：2015年12月21日。

分類(lèi)號(hào)S763.3 Q786

Characterization and Expression Analysis of HSP70 Gene in Dastarcus helophoroides//

Hao Chunfeng, Wang Huapeng, Zhang Zhengqing, Chang Yong, Li Menglou(Northwest A&F University, Yangling 712100, P.R.China)//

Journal of Northeast Forestry University，2016,44(7)：108-115，124.

Three full-length HSP70 genes, D.hHSP69.09, D.hHSP70.11 and D.hHSP71.88, were obtained from Dastarcus helophoroides.The development stage expression analysis by real-time qPCR displayed that three HSP70 genes were expressed in all development stage.The highest expression level of D.hHSP69.09 was detected in the first instar larva.The highest expression level of D.hHSP70.11 and D.hHSP71.88 were in the adult of male.The same condition of three HSP70 genes were the relative expression were high at the stage of pupal.By the tissue distribution analysis, the highest expression level of D.hHSP69.09 and D.hHSP70.11 was in the spermary.The relatively highest level of D.hHSP71.88 appeared in the corpus adiposum.The three HSPs of female and male adults were both up-regulated with the rise of temperature, time duration for 41 ℃ and concentration of oxidizing agent, then decreased.When treated with starvation stress, the expression patterns of male and female were different.When the processing time was prolonged, for male, the expression of three HSP70 genes were declined.However, in female adult, they were up-regulated.Therefore, HSP70 genes were correlated with the transition of different development stages and molting of larva in D.helophoroide.Moreover, HSP70 genes have direct relationship with resistibility to environmental stress including high temperature, oxidative stress, and starvation.

KeywordsDastarcus helophoroides; Environmental stress; HSP70; Real-time qPCR

1)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170608)。

責(zé)任編輯：程紅。