過敏性紫癜患兒SOCS3、HMGB1的表達(dá)及意義

王鳳英，黃路圣，魯　曼，張?zhí)┥?/p>

(1.江蘇省泰興市人民醫(yī)院兒科　225400；2.山東省泰安市中心醫(yī)院兒科　271000)

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過敏性紫癜患兒SOCS3、HMGB1的表達(dá)及意義

王鳳英1，黃路圣1，魯曼2，張?zhí)┥?

(1.江蘇省泰興市人民醫(yī)院兒科225400；2.山東省泰安市中心醫(yī)院兒科271000)

[摘要]目的研究過敏性紫癜患兒外周血SOCS3和HMGB1的表達(dá)及其相互關(guān)系和臨床意義。方法選取過敏性紫癜兒童(HSP組)20例和正常健康兒童(對(duì)照組)15例。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中SOCS3 mRNA表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清HMGB1的水平。結(jié)果HSP組外周血單個(gè)核細(xì)胞SOCS3 mRNA表達(dá)量和血清HMGB1的表達(dá)量分別為1.87±0.53、(16.29±3.28)μg/L，高于對(duì)照組的0.77±0.13、(7.44±1.34)μg/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且二者成正相關(guān)(r=0.816，P<0.01)?；旌闲虷SP患兒SOCS3 mRNA表達(dá)量和血清HMGB1的表達(dá)量較單純型患兒的表達(dá)量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HSP患兒SOCS3 mRNA表達(dá)量和血清HMGB1的表達(dá)量無性別差異。結(jié)論SOCS3和HMGB1可能參與了兒童HSP的發(fā)病。

[關(guān)鍵詞]HMGB1蛋白質(zhì)；紫癜，過敏性；細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3；兒童

過敏性紫癜(HSP)是一種以小血管為主要病變的變態(tài)反應(yīng)性疾病，迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[1]。研究表明，在HSP患兒急性期體內(nèi)存在輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2的失衡，主要表現(xiàn)為Th2的優(yōu)勢(shì)活化[2]。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白3(SOCS3)主要表達(dá)在Th2細(xì)胞，促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化，抑制Th1細(xì)胞分化，使Th2型反應(yīng)增強(qiáng)[3-4]。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種新型的炎性細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。目前SOCS3和HMGB1在HSP患兒中的研究報(bào)道較少。本課題研究了SOCS3和HMGB1在HSP患兒外周血中的表達(dá)及相關(guān)性，以探討其在HSP發(fā)病中的作用及意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取HSP患兒與健康體檢兒童進(jìn)行對(duì)比研究，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均取得受試對(duì)象家長(zhǎng)知情同意。HSP患兒20例(HSP組)，診斷均符合諸福棠兒科學(xué)第7版HSP診斷標(biāo)準(zhǔn)及2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)免疫學(xué)組制訂的兒童過敏性紫癜循證診治建議，在受檢前4周內(nèi)未使用任何糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒性藥物。其中，男11例，女9例；平均年齡(7.4±2.2)歲；單純皮膚型5例，混合型15例(有12例伴關(guān)節(jié)癥狀，9例伴消化道癥狀，5例伴腎臟損害)。對(duì)照組為健康體檢兒童隨機(jī)抽樣15例，男8例、女7例；平均年齡(7.2±1.6)歲。HSP組與對(duì)照組年齡及性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集部位：外周靜脈血。試管：采用肝素鈉抗凝管和非肝素鈉抗凝管。采集對(duì)象：HSP組治療前及對(duì)照組。采血量：每管各2 mL。

1.2.2實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理采用密度梯度離心法將肝素鈉抗凝管分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，以備檢測(cè)SOCS3 mRNA表達(dá)，非肝素鈉抗凝管離心取血清，-20 ℃冰箱保存以備待測(cè) HMGB1水平。

1.2.3SOCS3 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)(1)mRNA提取和cDNA合成。試劑來源：采用山東賽恩斯科技有限公司代購(gòu)的Invitrogen公司的mRNA提取試劑、美國(guó)Thermo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑盒。實(shí)驗(yàn)步驟：嚴(yán)格按照Trizol試劑盒說明書的步驟用PBMC提取mRNA，然后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在0.2 mL的EP管里進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系為20 μL。(2)SOCS3基因的表達(dá)量應(yīng)用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR試劑檢測(cè)，反應(yīng)體系為50 μL(SYBR Green Ⅰ 25 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，加雙蒸水至50 μL)；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min變性；再95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。所用PCR儀為ABI Prism 7500，以β-actin作為內(nèi)參基因，SOCS3、β-actin的引物設(shè)計(jì)和合成由寶生物工程有限公司完成，目的基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1。(3)SOCS3 mRNA表達(dá)水平用SOCS3△Ct值表示，△Ct為目的基因Ct值與β-actin Ct值的差異，為基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1　目的基因和內(nèi)參基因的引物序列

1.2.4HMGB1的檢測(cè)試劑購(gòu)自上海百沃科技有限公司。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)其HMGB1血清水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。濃度的計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度(OD)值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算。

2結(jié)果

2.1兩組SOCS3 mRNA及HMGB1的比較HSP組SOCS3 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HSP組血清HMGB1水平較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。HSP組SOCS3 mRNA 和HMGB1的表達(dá)量成正相關(guān)(r=0.816，P<0.01)。

2.2臨床類型不同的HSP患兒SOCS3 mRNA、HMGB1檢測(cè)結(jié)果比較混合型HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達(dá)量分別為2.05±0.480、(17.45±2.90)μg/L；單純型患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達(dá)量分別為1.34±0.16、(12.82±1.23)μg/L；混合型HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達(dá)量較單純型患兒的表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.18、3.41，P=0.005、0.003)。

表2　HSP組與對(duì)照組SOCS3 mRNA、HMGB1表達(dá)差異

2.3性別不同HSP患兒SOCS3 mRNA、HMGB1檢測(cè)結(jié)果比較男性HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達(dá)量分別為1.80±0.56、(16.34±2.99)μg/L；女性患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達(dá)量分別為1.95±0.49、(16.23±3.78)μg/L；不同性別HSP患兒SOCS3 mRNA和HMGB1的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.62、0.07，P=0.539、0.945)。

3討論

SOCS3和SOCS1是SOCS家族中研究較深入的成員之一，可通過多種途徑負(fù)向調(diào)控JAK-STAT(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription)信號(hào)通路，影響多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)與釋放，參與免疫性、炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[6-7]。SOCS1在Thl細(xì)胞中高表達(dá)，SOCS3在Th2細(xì)胞中高表達(dá)；白細(xì)胞介素(IL)-12/STAT4、 IL-4/STAT6途徑分別是Th1、Th2分化所必需的[8]。研究表明SOCS1可使Th1型反應(yīng)增強(qiáng)，而SOCS3可使Th2型反應(yīng)增強(qiáng)，作用機(jī)制分別為抑制IL-4/STAT6和IL-12/STAT4通路信號(hào)的傳導(dǎo)[3-4]。研究已證實(shí)HSP是Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)的變態(tài)反應(yīng)性疾病[2]。本研究結(jié)果顯示，HSP患兒SOCS3的表達(dá)量較健康兒童明顯增高，且混合型HSP較單純型HSP患兒的表達(dá)量增高更明顯，推測(cè)HSP患兒在體內(nèi)炎性因子的作用下，表達(dá)顯著增高的SOCS3促使HSP患兒表現(xiàn)為Th2的優(yōu)勢(shì)活化，SOCS3表達(dá)越高的患兒越易合并皮膚外的臟器受累，提示SOCS3表達(dá)越高者炎性反應(yīng)越重，故SOCS3可能參與了兒童HSP的發(fā)病。本研究HSP患兒SOCS3表達(dá)量未發(fā)現(xiàn)有性別差異。

HMGB1是一種非組蛋白的核 DNA 結(jié)合蛋白，是HMG超家族成員之一，生理狀態(tài)下結(jié)合于核染色體，參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和修復(fù)等生命活動(dòng)，病理狀態(tài)下是一種促炎介質(zhì)，具有細(xì)胞因子的功能，同時(shí)也可作為損傷相關(guān)分子模式家族(damage-associated molecular patterns，DAMPs)成員激活抗原提呈細(xì)胞(APC)，啟動(dòng)增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，參與免疫細(xì)胞的分化、成熟和活化，進(jìn)一步參與多種疾病的病理變化[9-10]。既往研究表明HMGB1具有廣泛的免疫活性，促進(jìn)一系列免疫炎性細(xì)胞因子如單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、IL-1、IL-6、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等及趨化因子和黏附因子的大量釋放[10]；反之，腫瘤壞死因子(TNF-α)、脂多糖(LPS)、IL-1等多種炎癥介質(zhì)能促使單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等加速表達(dá)和分泌HMGB1，不斷放大炎性信號(hào)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)失控[11]。在HSP發(fā)病中有多種細(xì)胞因子的參與，如TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-26、IL-28、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等均可能是參與HSP發(fā)病的重要因子。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1可能通過誘導(dǎo)TNF-α和IL-6介導(dǎo)HSP的血管內(nèi)皮炎癥，進(jìn)一步參與HSP的病理發(fā)展。本研究結(jié)果顯示HSP組HMGB1血清水平較對(duì)照組顯著增高，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且混合型HSP患兒HMGB1血清水平較單純型HSP增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HMGB1可能參與了兒童HSP的發(fā)病。HMGB1的水平越高，病情越重，累積的臟器越多，但表達(dá)量無性別差異，與甘世偉等[13]的報(bào)道相一致。

Huang等[14]研究表明大劑量HMGB1能誘導(dǎo)人或鼠T淋巴細(xì)胞向Th2功能性分化，降低Th1/Th2比例，出現(xiàn)Th2優(yōu)勢(shì)。郭惠芳等[15]研究表明HMGB1刺激能增加細(xì)胞SOCS1、SOCS3的表達(dá)。本研究表明HSP患兒SOCS3的表達(dá)和HMGB1的表達(dá)量均增高，且二者表達(dá)成正相關(guān)，由此推測(cè)HSP患兒體內(nèi)增高的SOCS3和HMGB1相互作用，促使HSP患兒出現(xiàn)TH2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)活化及相應(yīng)細(xì)胞因子的分泌，加之HMGB1本身及活化的免疫炎癥細(xì)胞，破壞免疫平衡，導(dǎo)致全身小血管的損傷和炎癥。

研究認(rèn)為SOCS、HMGB1可作為靶點(diǎn)干預(yù)治療多種免疫相關(guān)疾病，本課題組擬進(jìn)一步探索SOCS3、HMGB1參與HSP發(fā)病的分子機(jī)制及相互作用機(jī)制，為SOSC3、HMGB1治療HSP等免疫性疾病的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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作者簡(jiǎn)介：王鳳英(1975-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事小兒免疫性疾病研究。

doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.033

[中圖分類號(hào)]R725.9

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)15-2130-03

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-01-16)