ω?6大豆油脂肪乳對小鼠腹瀉的保護作用

孫明立，趙海山，姚維范，魏敏杰

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110122）

·短篇論著·

ω?6大豆油脂肪乳對小鼠腹瀉的保護作用

孫明立，趙海山，姚維范，魏敏杰

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽 110122）

目的探討ω?6大豆油脂肪乳對番瀉葉導(dǎo)致的小鼠腹瀉的保護作用。方法將36只昆明小鼠隨機分為對照組、腹瀉組和ω?6大豆油脂肪乳組，每組12只。利用番瀉葉制備小鼠腹瀉模型。造模后，ω?6大豆油脂肪乳組注射ω?6大豆油脂肪乳（15 mL/kg，每日1次），對照組與腹瀉組小鼠每日尾靜脈注射等劑量生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。自造模之日起動態(tài)觀察小鼠一般狀態(tài)并記錄小鼠體質(zhì)量；并于給藥前及給藥第1、4、7和10天分別計算小鼠腹瀉指數(shù)；給藥10 d后處死小鼠，采用HE染色法觀察小鼠小腸黏膜形態(tài)學(xué)變化；采用生化法檢測小鼠血漿白蛋白（ALB）水平；采用免疫組化檢測小鼠小腸黏膜組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達。結(jié)果與腹瀉組相比，ω?6大豆油脂肪乳組小鼠的一般狀況和體質(zhì)量明顯改善，小鼠腹瀉指數(shù)明顯降低；給藥10 d后，與腹瀉組相比，ω?6大豆油脂肪乳組小鼠小腸黏膜損傷明顯改善、血漿ALB水平顯著升高，小腸黏膜中PCNA表達顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論ω?6大豆油脂肪乳對番瀉葉所致的小鼠腹瀉具有顯著的保護作用，其機制可能與上調(diào)PCNA表達水平有關(guān)。

ω?6大豆油脂肪乳；番瀉葉；腹瀉；小腸黏膜損傷

網(wǎng)絡(luò)出版地址

腹瀉是多因素引起的腸道疾病，是腸道在感染或非感染因素刺激下，腸黏膜出現(xiàn)發(fā)炎、水腫，腸分泌及運動功能亢進，出現(xiàn)稀便和便頻等癥狀。腹瀉持續(xù)可導(dǎo)致腸黏膜損傷、全身營養(yǎng)不良等。近年來腹瀉發(fā)病率上升，嚴(yán)重影響人的身體健康，因此開發(fā)用于預(yù)防和控制腹瀉的有效方法日益迫切。ω?6大豆油脂肪乳富含亞麻酸、亞油酸等必須脂肪酸，是腸外為機體提供必需脂肪酸和能量的營養(yǎng)成分之一，對于人體必需脂肪酸缺乏癥具有預(yù)防和治療的作用［1］。近來研究表明，胃腸黏膜內(nèi)必需脂肪酸可快速轉(zhuǎn)化成前列腺素E，進而促進胃腸黏膜損傷

網(wǎng)絡(luò)出版時間：修復(fù)［2］。此外，我們的前期研究［3］表明，必需脂肪酸的攝入可通過提高體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激能力促進胃黏膜損傷的修復(fù)。因此，提高飲食中亞油酸等必需脂肪酸的攝入量將對胃腸損傷后的修復(fù)具有重要作用。ω?6大豆油脂肪乳是否可促進腹瀉腸黏膜修復(fù)，進而改善腹瀉癥狀，目前尚未見報道。本研究以番瀉葉誘導(dǎo)的小鼠腹瀉模型為研究對象，探討ω?6大豆油脂肪乳對小鼠腹瀉是否具有保護作用，并初步探討其可能的作用機制。

1　　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物：10周齡清潔級昆明小鼠36只，雌雄各半，體質(zhì)量20～24 g，由中國醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2003?0009，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2003?0013。清潔環(huán)境下進行飼養(yǎng)及實驗操作，實驗動物不限食水，每籠6只。實驗室溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)實驗動物環(huán)境及設(shè)施GB14925?2001》。

1.1.2藥品與試劑：英脫利匹特（華瑞制藥有限公司，500 mL含50 g大豆油、6 g卵磷脂），白蛋白（albu?min，ALB）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear anti?gen，PCNA）抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），番瀉葉藥材（沈陽維康大藥房）。

1.1.3儀器：分析天平LA?204（常熟市百靈天平儀器有限公司），切片機KD?2508（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），石蠟包埋機LS?100、攤片機LS?80、烘片機LS?90（沈陽市龍首電子儀器有限公司），Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司），80i高級研究型顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2方法

1.2.1實驗分組及藥物處理：按照體質(zhì)量將小鼠隨機分為對照組、腹瀉模型組、ω?6大豆油脂肪乳組，每組12只。腹瀉組和ω?6大豆油脂肪乳組每日0.3 g/mL的番瀉葉（生藥）0.5 mL灌胃，連續(xù)灌胃15 d，對照組同步等體積生理鹽水灌胃。造模第6日起，ω?6大豆油脂肪乳組小鼠每日尾靜脈緩慢注射15 mL/kg英脫利匹特，連續(xù)給藥10 d，對照組和腹瀉模型組小鼠每日尾靜脈注射等體積生理鹽水。

1.2.2一般狀況及體質(zhì)量動態(tài)觀察：動態(tài)監(jiān)測小鼠體質(zhì)量，描記生長曲線，觀察小鼠的飲食、精神、體溫、皮毛、鼻唇、眼睛、尾部、糞便等一般狀態(tài)變化。

1.2.3ALB水平測定：末次給藥后4 h，取小鼠外周血，生化法測定血中ALB水平，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4腹瀉指數(shù)檢測：小鼠予單籠飼養(yǎng)，籠底墊濾紙和鐵絲網(wǎng)，在給藥前1 d及治療后第1、4、7、10天于給藥后開始計時，觀察5 h內(nèi)腹瀉情況，通過計算腹瀉指數(shù)反映腹瀉情況。腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級。稀便率：每只動物排稀便數(shù)與總便數(shù)之比。稀便級：表示每只動物稀便的程度，以稀便污染濾紙的直徑定級。分為4級：1級，＜1 cm；2級，1～1.9 cm；3級，2～3 cm；4級，＞3 cm。平均稀便級=所有稀便級數(shù)相加/稀便次數(shù)。

1.2.5腸黏膜形態(tài)學(xué)檢測：末次給藥后6 h，剖腹，取十二指腸韌帶遠端5 cm處小腸5 cm，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。

1.2.6PCNA表達檢測：末次給藥后6 h，取小腸標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。免疫組化SP法檢測PCNA表達。石蠟組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，降梯度乙醇脫苯、水化。將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），80 kPa高壓修復(fù)10 min。切片經(jīng)3%過氧化氫/甲醇及10%非免疫性正常山羊血清處理后，滴加鼠抗人PCNA單克隆抗體（1∶100，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），4℃孵育過夜。次日切片先后經(jīng)生物素標(biāo)記的二抗（1∶200）和鏈霉菌抗生物素蛋白辣根過氧化酶復(fù)合物孵育，然后滴加新鮮配制的DAB溶液顯色。最后，切片經(jīng)蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后觀察。同步操作陰性對照，采用PBS代替PCNA抗體，其他步驟不變。結(jié)果判定：陽性細胞以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為準(zhǔn)，陽性細胞最密集處任選5個非重疊視野，高倍鏡（×40）下計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞百分率。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student?Newman?Keuls法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1ω?6大豆油脂肪乳對小鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

造模后小鼠神態(tài)萎靡，食少納呆，被毛散亂而無光澤，腹瀉癥狀明顯，腹瀉嚴(yán)重時甚至有脫肛，分籠前易聚堆，單籠飼養(yǎng)后喜蜷縮一角，少動，體質(zhì)量呈下降趨勢。ω?6大豆油脂肪乳處理后，小鼠腹瀉癥狀明顯減輕，精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，飲食及活動明顯增加，體質(zhì)量于給藥后第4、7及10天有所改善，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1　　各處理組小鼠體質(zhì)量、腹瀉指數(shù)、ALB水平及PCNA陽性表達率的變化（±s）Tab.1　Effect of soybean oil fat emulsion on body weight，diarrhea index，ALB level and positive rate of PCNA in mice（±s）

表1　　各處理組小鼠體質(zhì)量、腹瀉指數(shù)、ALB水平及PCNA陽性表達率的變化（±s）Tab.1　Effect of soybean oil fat emulsion on body weight，diarrhea index，ALB level and positive rate of PCNA in mice（±s）

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs diarrhea group.

Item　Control group　Diarrhea group　　ω?6 soybean oil fat emulsion group Body weight（g）Before modeling　22.21±1.27　22.47±1.04　21.75±1.12 4 d after modeling　22.66±1.07　20.59±1.241）　20.33±1.11 1 d after administration　22.83±1.11　20.17±1.161）　20.00±1.36 4 d after administration　22.95±1.17　18.60±0.941）　19.67±1.50 7 d after administration　24.53±1.59　17.56±1.291）　19.00±1.49 10 d after administration　24.94±0.83　17.13±0.671）　18.20±0.87 Diarrhea index Before modeling　-　1.87±0.50　1.86±0.53 1 d after administration　-　1.99±0.54　1.23±0.442）4 d after administration　-　1.81±0.54　0.84±0.412）7 d after administration　-　1.76±0.70　0.78±0.452）10 d after administration　-　1.71±0.64　0.83±0.412）ALB level（g/L）　16.92±2.19　13.50±1.601）　17.20±2.152）Positive rate of PCNA（%）　10.06±2.56　8.99±3.05　21.98±2.892）

2.2ω?6大豆油脂肪乳對小鼠血漿ALB水平的影響

與對照組相比，腹瀉組小鼠血漿ALB水平顯著降低（P＜0.05）；與腹瀉組相比，ω?6大豆油脂肪乳組小鼠血漿ALB水平顯著增加（P＜0.05），見表1。

2.3ω?6大豆油脂肪乳對小鼠腹瀉指數(shù)的影響

腹瀉組小鼠腹瀉指數(shù)隨時間推移呈先升高后下降的趨勢，各時間點腹瀉指數(shù)均＞1.5。與腹瀉組小鼠相比，ω?6大豆油脂肪乳組小鼠給藥后各時間點腹瀉指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），見表1。

2.4ω?6大豆油脂肪乳對腹瀉小鼠腸黏膜損傷的影響

對照組小鼠小腸腸壁各層結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮形成絨毛突向腸腔。腹瀉組小鼠小腸黏膜變薄，絨毛高度及表面積減少。ω?6大豆油脂肪乳組小鼠小腸上皮及絨毛不同程度恢復(fù)。見圖1。

2.5ω?6大豆油脂肪乳對腹瀉小鼠腸黏膜PCNA表達的影響

圖1　　各處理組小鼠小腸黏膜組織病理學(xué)改變 HE×100Fig.1　The pathological changes of intestine mucosa in each group HE×100

PCNA陽性細胞主要分布于腸隱窩區(qū)。腹瀉組和對照組小鼠腸隱窩區(qū)PCNA陽性表達細胞較少。ω?6大豆油脂肪乳組小鼠腸隱窩區(qū)可見陽性表達細胞顯著增多（P＜0.05）。見圖2，表1。

圖2 各處理組小鼠小腸黏膜組織PCNA表達 HE×400Fig.2　The PCNA expression in intestine mucosa in each group HE×400

3　　討論

成功建立動物模型是評價抗腹瀉藥物療效的前提。本研究中利用番瀉葉制備小鼠腹瀉模型，造模后小鼠出現(xiàn)排便次數(shù)增多，糞便稀薄如糊狀，甚至稀如水樣等典型的腹瀉癥狀，同時出現(xiàn)體質(zhì)量降低等營養(yǎng)缺乏表現(xiàn)，造模成功率達100%。此外，該方法具有操作簡單、設(shè)備簡易、周期短等優(yōu)點，因此該模型適用于本研究。

為探討ω?6大豆油脂肪乳對小鼠腹瀉是否具有保護作用，本研究首先觀察了ω?6大豆油脂肪乳對小鼠腹瀉指數(shù)及小腸病理學(xué)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與腹瀉組比較，ω?6大豆油脂肪乳組小鼠腹瀉指數(shù)明顯降低，小腸黏膜損傷病理學(xué)變化緩解。同時我們觀察了ω?6大豆油脂肪乳對腹瀉小鼠營養(yǎng)狀況的影響，包括一般狀態(tài)、體質(zhì)量及血漿ALB含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與腹瀉組比較，ω?6大豆油脂肪乳組小鼠一般狀態(tài)改善、體質(zhì)量增加，同時血漿ALB含量增加。以上提示，ω?6大豆油脂肪乳對小鼠實驗性腹瀉具有較好的保護作用。

PCNA是一種核蛋白，是DNA合成酶的輔助蛋白，為細胞合成DNA所必需，幾乎在所有處于增殖狀態(tài)的細胞核均有表達。PCNA陽性表達的強弱直接反映了細胞增殖活動的高低，是評價細胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)［4?6］。近來研究［7?8］表明，PCNA參與腸黏膜損傷后細胞增殖修復(fù)，是評價抗腹瀉藥物療效的常用指標(biāo)。有研究［9］報道，ω?6不飽和脂肪酸可促進腸組織PCNA表達，進而促進結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于ω?6不飽和脂肪酸是否可促進PCNA表達進而促進小腸黏膜損傷修復(fù)，目前未見報道。因此，為探討ω?6大豆油脂肪乳促進腹瀉恢復(fù)的作用機制，我們考察了ω?6大豆油脂肪乳對腹瀉小鼠小腸組織中PCNA表達水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ω?6大豆油脂肪乳可顯著增加PCNA表達水平，提示ω?6大豆油脂肪乳可能通過增加PCNA表達、促進腸黏膜細胞DNA合成，促進腸黏膜損傷后細胞增殖修復(fù)。

綜上所述，ω?6大豆油脂肪乳可能通過促進腹瀉小鼠腸黏膜中PCNA表達，進而促進小鼠腹瀉的恢復(fù)，但確切的機制仍需進一步研究。

［1］段葉輝，李鳳娜，李麗立，等.n?6/n?3多不飽和脂肪酸比例對機體生理功能的調(diào)節(jié)［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（4）：626-631.

［2］白雪，李世擁，于波，等.橄欖油脂肪乳在老年胃腸手術(shù)患者腸外營養(yǎng)治療中的應(yīng)用［J］.中華普外科手術(shù)學(xué)雜志，2014，8（3）：251-255.DOI：10.3877/cma.j.issn.1674?3946.2014.03.073.

［3］何林秀，孫明立，邊競，等.ω?3魚油脂肪乳對環(huán)磷酰胺所致小鼠胃黏膜損傷的保護作用［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，44（12）：1090-1093.DOI：10.3969/j.issn.0258?4646.2015.12.009.

［4］VASCONCELOS PC，SEITO LN，DI STASI LC，et al.Epicatechin used in the treatment of intestinal inflammatory disease：an analysis by experimental models［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2012，2012：508902.DOI：10.1155/2012/508902.

［5］DEZFULI BS，GIARI L，LUI A，et al.Proliferative cell nuclear anti?gen（PCNA）expression in the intestine of Salmo trutta trutta natu?rally infected with an acanthocephalan［J］.Parasit Vectors，2012，5 （1）：198.DOI：10.1186/1756?3305?5?198

［6］LEE MY，ZHANG S，LIN SH，et al.Regulation of human DNA poly?merase delta in the cellular responses to DNA damage［J］.Environ Mol Mutagen，2012，53（9）：683-698.DOI：10.1002/em.21743.

［7］吳瓊，葉華，朱宇珍，等.黃芩湯預(yù)防伊立替康所致遲發(fā)性腹瀉的研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（12）：163-168.

［8］趙秀軍，李艷麗，趙昱，等.復(fù)方雙苓止瀉散對腹瀉模型大鼠小腸黏膜PCNA mRNA表達的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2876-2877.DOI：10.3969/j.issn.1008?0805.2010.11.074.

［9］陳小良，李建忠，曾利嫻，等.ω?6不飽和脂肪酸促進結(jié)腸癌變的實驗研究［J］.中華胃腸外科雜志，2010，13（10）：774-777.DOI：10.3760/cma.j.issn.1671?0274.2010.10.016.

（編輯陳姜）

Protective Effect of ω?6 Soybean Oil Fat Emulsion on Folium Sennae?induced Diarrhea in Mice

SUN Mingli，ZHAO Haishan，YAO Weifan，WEI Minjie
（Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of ω?6 soybean oil fat emulsion on folium sennae?induced diarrhea in mice.Methods Thirty?six Kunming mice were randomly divided into three groups，including control，diarrhea，ω?6 soybean oil fat emulsion group（12 mice in each group）.Besides the mice in control group，other mice were administrated folium sennae by gavage for 15 days to establish the diarrhea model. Then mice in ω?6 soybean oil fat emulsion group received ω?6 soybean oil fat emulsion by intravenously administration at a dose of 15 mL/kg daily since 6th day after intragastric administration of folium sennae for 10 days.Animals in control group and diarrhea group were intravenously adminis?tered with same volume of saline.The body weight，general state and diarrhea index of the mice in each group were dynamically assessed.Ten days after intravenous injection，mice in every group were sacrificed and tissues were collected.Morphology of intestine mucosa was observed after HE staining.Albumin（ALB）level in plasma was evaluated by biochemical method.Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression in intestine mucosa were assessed by immunohistochemical method.ResultsCompared with that in the diarrhea group，the general status，body weight and diarrhea index of mice in ω?6 soybean oil fat emulsion group were improved significantly.Ten days after intravenously administration，pathological change in intestine mucosa of mice in ω?6 soybean oil fat emulsion group was improved significantly，ALB level in plasma and PCNA expression in intestine mucosa were significantly increased（P＜0.05）compared with that in diarrhea group.Conclusionω?6 soybean oil fat emulsion has a significant protective effect on the diarrhea of mice induced by folium sennae，which may be related to the up?regulated expression of PCNA by ω?6 soybean oil fat emulsion.

ω?6 soybean oil fat emulsion；folium sennae；diarrhea；intestinal mucosal injury

R965.1

A

0258-4646（2016）08-0742-04

10.12007/j.issn.0258?4646.2016.08.017

孫明立（1980-），男，講師，博士.

魏敏杰，E-mail：weiminjie1963@163.com

2015-12-09