導(dǎo)致老陳醋產(chǎn)氣微生物的分離和鑒定

張懷敏，段國(guó)鋒，李江涌，王進(jìn)龍，王如福*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山西 太谷，030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

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導(dǎo)致老陳醋產(chǎn)氣微生物的分離和鑒定

張懷敏1，段國(guó)鋒2，李江涌1，王進(jìn)龍1，王如福1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山西 太谷，030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的]針對(duì)某些老陳醋產(chǎn)氣現(xiàn)象進(jìn)行研究，找到引起此現(xiàn)象的微生物，并進(jìn)行分析鑒定。[方法]采用不同的培養(yǎng)基(血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基)和不同的方法對(duì)產(chǎn)氣醋中的微生物進(jìn)行涂布分離，并對(duì)分離的菌株進(jìn)行生理生化及產(chǎn)氣性鑒定。[結(jié)果]經(jīng)離心處理后最終在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上分離、純化出7株細(xì)菌，編號(hào)為W1、W5、W3、W6-D、W6-X、WY1、W4*，其中WY1是在厭氧條件下分離得到。[結(jié)論]經(jīng)產(chǎn)氣試驗(yàn)確定W6-X具有產(chǎn)氣性，并初步鑒定 W6-X菌株為芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：老陳醋；產(chǎn)氣；微生物；分離

某些老陳醋產(chǎn)氣現(xiàn)象的發(fā)生，給產(chǎn)品本身的安全性帶來了一定的影響，也給企業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)氣菌的出現(xiàn)是由于它們能夠利用多種碳水化合物作為底物生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)、繁殖過程中能夠代謝產(chǎn)生大量的粘性物質(zhì)。有研究表明，在石油的開采中也發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)氣的芽飽桿菌組，且產(chǎn)氣量與糖蜜濃度成正比[1]；李偉麗[2]從腐敗醋中分離得到的83株菌株，其中82株為芽孢桿菌，僅一株耐酸乳酸菌。

山西老陳醋是中國(guó)四大名醋之一，距今已有3 000余年的歷史，有天下第一醋的聲譽(yù)。老陳醋以高粱為主要原料，經(jīng)多種微生物發(fā)酵而成，富含氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。由于某些老陳醋采用多菌種固態(tài)開放的工藝進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)過程中使用的原料、容器或管道滅菌不徹底，灌裝及貯存中管理不善，容易被雜菌污染[3]，可能引起老陳醋脹袋[4～7]。鄒敏娟[8]從脹袋醬油中分離出1株微生物，經(jīng)過驗(yàn)證證實(shí)它是引起醬油產(chǎn)氣滲漏的原因菌；于志鵬等[9]對(duì)大豆醬脹袋原因進(jìn)行微生物檢測(cè)分析中，采用國(guó)標(biāo)的方法分離得到酵母菌，并確定其是引起大豆醬脹袋的主要原因。

本試驗(yàn)主要從引起某老陳醋產(chǎn)氣的微生物入手，找到由于產(chǎn)氣引起醋變質(zhì)的主要微生物，為防止老陳醋脹袋變質(zhì)提供新思路。借鑒田小群[10]在研究啤酒腐敗菌的方法，結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)法研究產(chǎn)氣醋。離心法處理樣品并結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法在微生物的分離上比較新穎，且有研究表明該方法的可靠性，本文采用離心的方法對(duì)引起醋產(chǎn)氣變質(zhì)的微生物進(jìn)行分離研究。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1樣品

瓶裝變質(zhì)老陳醋(脹瓶)、未變質(zhì)老陳醋(樣品醋均由某醋企業(yè)提供)。

1.1.2培養(yǎng)基

血平板培養(yǎng)基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，NaCl15g，脫纖維羊血50mL，瓊脂15g)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、淀粉水解瓊脂、葡萄糖蛋白胨。

1.1.3主要試劑

瓊脂粉、孔雀綠、番紅、5%過氧化氫、1%鹽酸四甲基對(duì)苯撐二胺、結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、肌酸、40%NaOH、蛋白胨、乙醚、吲哚。

1.1.4儀器設(shè)備

移液槍、杜氏管、試管、培養(yǎng)皿、厭氧袋、pH計(jì)、精密電子天平、顯微鏡、立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品醋中產(chǎn)氣菌的分離純化

樣品→稀釋→涂布→培養(yǎng)、計(jì)數(shù)→挑取單菌落→純化培養(yǎng)→保存?zhèn)溆谩?/p>

方法1：稱取1mL樣品醋加入到9mL無菌水的三角瓶中稀釋到10-2、10-3；取不同濃度梯度的樣品稀釋液各100μL至相應(yīng)標(biāo)記的平板上(血平板培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MRS、M17等培養(yǎng)基)，溶液滴至平板中央，涂布棒涂勻，每個(gè)梯度重復(fù)3次；37 ℃恒溫培養(yǎng)24h；每個(gè)梯度做一個(gè)厭氧培養(yǎng)(即傾注后在上面加蓋一層素瓊脂)，選擇要分離的產(chǎn)氣菌株并編號(hào)、純化，37 ℃恒溫培養(yǎng)；固體斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法2：取樣品醋40mL于50mL無菌離心管中，4 000r·min-1離心10min，棄掉上清液收集沉淀；在離心管中加入40mL無菌水，4 000r·min-1離心10min，棄掉上清液，收集沉淀；重復(fù)洗滌沉淀2～3 次，最后用2mL無菌水溶解沉淀[2]。取0.1mL菌液，涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MRS、M17、血平板等培養(yǎng)皿，并做厭氧培養(yǎng)和好氧培養(yǎng)，每組3個(gè)重復(fù)。平板倒置平放于37 ℃生化培養(yǎng)箱，經(jīng)48h培養(yǎng)后，觀察菌落情況。

1.2.2菌落特征觀察[11]

將分離純化的菌株接種在固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)1d后觀察其菌落特征，如顏色、透明度、形狀、邊緣、表面、隆起形狀等記錄結(jié)果。

1.2.3生理生化試驗(yàn)[12]

1.2.3.1產(chǎn)氣試驗(yàn)1：將菌株在裝有倒置杜氏管的營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)氣試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)在培養(yǎng)基上覆蓋一層液體石蠟，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱48h后觀察是否有氣泡產(chǎn)生，若出現(xiàn)氣泡則該菌株為產(chǎn)氣菌，反之，則不是。

1.2.3.2產(chǎn)氣試驗(yàn)2：將得到的菌株在裝有倒置杜氏管的營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)氣試驗(yàn)，在37 ℃搖床培養(yǎng)48h，觀察是否有氣泡產(chǎn)生，若出現(xiàn)氣泡則該菌株為產(chǎn)氣菌，反之，則不是。

1.2.3.3接觸酶：將 24h培養(yǎng)的菌種，用接種環(huán)取一小環(huán)菌體，涂抹于滴有 5%過氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生為陽性，否則為陰性。

1.2.3.4糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，乳糖)：用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，分別接種于上述糖發(fā)酵管中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察是否產(chǎn)酸、產(chǎn)氣。

1.2.3.5VP試驗(yàn) (乙酰甲基甲醇試驗(yàn))[11]：用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，分別接種于裝有9mL葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。取出試管振蕩1min，再加入40%NaOH溶液10滴，并用加入1mg微量肌酸振蕩試管，置37 ℃恒溫箱中30min后觀察結(jié)果。若培養(yǎng)液呈紅色，則為VP試驗(yàn)陽性，否則為陰性。

1.2.3.6淀粉水解試驗(yàn)：將細(xì)菌接種于含淀粉水解瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)48h后用碘溶液覆蓋平板，觀察菌落周圍是否有透明圈。若出現(xiàn)透明圈，為淀粉水解試驗(yàn)陽性；否則為陰性。

1.2.3.7吲哚試驗(yàn)：將細(xì)菌接種于裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管中37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48h，在培養(yǎng)液中加入乙醚2mL充分振蕩，靜置片刻，待乙醚層浮于上層，此時(shí)沿管壁緩慢加入幾滴吲哚試劑(切勿搖動(dòng)試管)觀察結(jié)果。若乙醚層呈現(xiàn)玫紅色，吲哚試驗(yàn)為陽性反應(yīng)；否則為陰性。

1.2.4革蘭氏染色鑒定[13]：將純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)胞形態(tài)及染色結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離

將樣品醋稀釋到10-3后，采用方法1進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)，48h后觀察培養(yǎng)基上菌體的生長(zhǎng)情況，未分離到任何菌株，原因可能是樣品醋中微生物數(shù)量比較少，醋在出廠分裝后又在相當(dāng)大的程度上稀釋了樣品，所以無法分離出菌株。

采用方法2將離心后的醋樣涂布于培養(yǎng)基，48h后觀察到在MRS培養(yǎng)基上出現(xiàn)了幾株菌體，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基純化后得到菌株W1、W5、W3、W6-D、W6-X、WY1、W4*(圖1)。

2.2菌體形態(tài)觀察

將菌株按形態(tài)歸類，結(jié)果如表1。

圖1　分離到的菌株Fig.1　Isolated strain

表1　菌株的基本形態(tài)及染色結(jié)果

從表1可以看出，樣品醋中分離到的菌株W1、W5、W3、W6-D、W6-X、WY1、W4*經(jīng)革蘭氏染色后均呈紫色，即革蘭氏陽性菌株，接觸酶反應(yīng)均無氣泡，即接觸酶陰性，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》菌株均呈現(xiàn)芽孢菌的形態(tài)特征。

2.3產(chǎn)氣試驗(yàn)結(jié)果

將分離到的7株菌分別進(jìn)行產(chǎn)氣試驗(yàn)，結(jié)果如表2。

在進(jìn)行產(chǎn)氣試1時(shí)觀察到WY1、W6-D、W6-X、W3在各氧層出現(xiàn)氣泡，在杜氏管內(nèi)無氣泡出現(xiàn)，W1、W5、W4*菌株在各氧層和杜氏管均無氣泡出現(xiàn)。產(chǎn)氣試驗(yàn)2中，菌株W6-X在杜氏管內(nèi)出現(xiàn)了氣泡，而其他菌株無明顯變化，由此推斷W6-X可能為導(dǎo)致樣品醋產(chǎn)生氣體的菌株。

表2　產(chǎn)氣結(jié)果

注：‘+’表示結(jié)果為陽性，‘-’表示結(jié)果為陰性

Note:‘+’indicatesapositiveresult, ‘-’indicatesnegativeresults

2.4生理生化特征

分別對(duì)7株菌進(jìn)行了糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖)、VP試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)，結(jié)果如表3。

表3　生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：‘+’表示結(jié)果為陽性，‘-’表示結(jié)果為陰性

Note:‘+’indicatesapositiveresult, ‘-’indicatesnegativeresults

由表3可見，分離得到的7株菌糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)葡萄糖為陽性，麥芽糖、蔗糖、乳糖產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果只有部分為陽性，但產(chǎn)氣試驗(yàn)為陰性；VP試驗(yàn)結(jié)果為陽性；淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果為陽性；吲哚試驗(yàn)結(jié)果部分是陽性。通過對(duì)比《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》可知，菌株WY1、W6-D、W6-X、W3、W1、W5、W4*均呈現(xiàn)芽孢桿菌屬的主要特征，其具體菌種有待進(jìn)一步鑒定。

2.5鏡檢結(jié)果

將菌株W6-X純化、恒溫培養(yǎng)后，對(duì)菌株進(jìn)行了鏡檢，如圖2。結(jié)果表明，W6-X菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈革蘭氏陽性桿狀，菌體較小，單個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)。

圖2　菌株W6-X顯微鏡下結(jié)果Fig.2　Microscope results of strain W6-X

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過使用不同培養(yǎng)基對(duì)樣品醋中的微生物進(jìn)行分離純化，在使用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法時(shí)，不能分離得到微生物。將方法進(jìn)行改良，將樣品醋先進(jìn)行離心，然后對(duì)樣品醋中微生物分離純化，最終得到7株菌株，分別為W1、W5、W3、W6-D、W6-X、WY1、W4*，其中WY1是厭氧環(huán)境下培養(yǎng)出的菌，其他6株均為好氧環(huán)境下的菌。對(duì)7株菌做革蘭氏染色試驗(yàn)，得出7株菌均為革蘭氏陽性菌株；在產(chǎn)氣試驗(yàn)中，由產(chǎn)氣試驗(yàn)可知，W6-X菌株具有產(chǎn)氣性；經(jīng)生理生化試驗(yàn)，并根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》判斷得出，產(chǎn)氣菌株W6-X為芽孢桿菌，但還需進(jìn)一步鑒定。

目前對(duì)山西老陳醋產(chǎn)氣微生物的研究很少，僅有李偉麗[2]從腐敗醋中分離得到82株芽孢桿菌?？赡苁怯捎诋a(chǎn)氣微生物難以收集，而且微生物分離的方法也需要改進(jìn)，就分離到的微生物也要減少傳代次數(shù)，還需對(duì)其進(jìn)行變異性、耐受性等研究。對(duì)于分離得到的菌株，其自身安全性是需要解決的一大問題；菌株在老陳醋釀造過程中是否發(fā)生變異將是下一步研究的重點(diǎn)；菌株產(chǎn)生的物質(zhì)是直接導(dǎo)致醋變質(zhì)的原因，還是與其他物質(zhì)的作用結(jié)果；為了進(jìn)一步解決這個(gè)困境，對(duì)菌株進(jìn)行分子方面的研究也勢(shì)在必行。

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(編輯：馬榮博)

收稿日期：2016-01-27 修回日期：2016-04-28

作者簡(jiǎn)介：張懷敏(1992-)，女(漢)，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程 *通訊作者：王如福，教授，博士生導(dǎo)師。Tel:13603546976,E-mail：wrf558@126.com

基金項(xiàng)目：山西省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2015-TN-10)

中圖分類號(hào)：Q93-33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-8151(2016)08-0594-04

IsolationandidentificationofmicroorganismwhichledtheVinegargas-producing

Zhanghuaimin1,Duanguofeng2,Lijiangyong1,Wangjinlong1,Wangrufu1*

(1.College of food science and Engineering, Taigu 030801, China; 2.College of Horticulture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract:[Objective]This paper mainly researchedthe gas production phenomenonof Shanxi Mature Vinegar, in order to find the microorganisms, and to identify it.[Methods]Used the different media(Blood agar, nutrient agar, MRS medium, M17 medium) and different approaches to isolate microorganisms and identified by physiology, biochemistry and gassing test. [Results]Purified seven bacteria, numbered W1, W5, W3, W6-D, W6-X, WY1, W4*, the WY1 was isolated under anaerobic conditions.[Conclusion]Strain through gas test, the results showed that W6-X had produced gas, preliminary identification W6-X strain was Bacillus subtilis.

Key words:Aged vinegar; Gas production; Microorganisms; Isolate