發(fā)酵條件對蘋果渣發(fā)酵飼料中4種水解酶活性的影響

任雅萍，郭　俏，來航線，陳姣姣，薛泉宏

(西北農(nóng)林科技大學 a 生命科學學院，b 資源環(huán)境學院，陜西 楊凌 712100)

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發(fā)酵條件對蘋果渣發(fā)酵飼料中4種水解酶活性的影響

任雅萍a，郭俏b，來航線b，陳姣姣b，薛泉宏b

(西北農(nóng)林科技大學 a 生命科學學院，b 資源環(huán)境學院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 研究發(fā)酵菌種、原料組成及發(fā)酵原料滅菌處理對蘋果渣發(fā)酵飼料中4種重要水解酶(蛋白酶、纖維素酶、果膠酶及植酸酶)活性的影響?！痉椒ā?以酵母菌(Yeast)、黑曲霉A8(Aspergillus niger A8)和米曲霉(Aspergillus oryzae)為發(fā)酵菌劑，通過單一菌種及雙菌混合接種方法，分別對2種原料(原料A為蘋果渣+尿素，原料B為蘋果渣+尿素+油渣粉)在自然發(fā)酵(原料不滅菌)和滅菌發(fā)酵(原料121℃滅菌30 min)條件下進行固態(tài)發(fā)酵，利用比色法測定發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶、纖維素酶、果膠酶及植酸酶4種水解酶的活性。【結(jié)果】 發(fā)酵可大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中影響飼料消化利用率的4種重要水解酶活性，且混合發(fā)酵劑對發(fā)酵產(chǎn)物中4種水解酶活性的提高作用優(yōu)于單菌發(fā)酵，添加油渣粉和原料滅菌處理有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物中4 種水解酶的活性。滅菌和添加油渣粉工藝條件下，在發(fā)酵產(chǎn)物中：蛋白酶活性58.85～368.43 U，發(fā)酵增率67.7%～949.6%，接菌增率109.4%～526.0%，滅菌增率22.2%～118.6%；纖維素酶活性3 617.53～6 278.22 U，發(fā)酵增率13.8%～97.6%，接菌增率2.3%～73.5%，滅菌增率8.3%～63.9%；果膠酶活性203.20～358.47 U，發(fā)酵增率34.5%～137.4%，接菌增率26.4%～76.4%，滅菌增率為17.1%～64.8%；植酸酶活性19.45～54.96 U，發(fā)酵增率336.1%～1 132.3%，接菌增率41.4%～182.6%，滅菌增率1.2%～92.0%。【結(jié)論】 混菌發(fā)酵、添加油渣粉以及發(fā)酵原料滅菌處理對提高蘋果渣發(fā)酵飼料中蛋白酶、纖維素酶、果膠酶及植酸酶活性均有顯著作用。

[關(guān)鍵詞]蘋果渣；固態(tài)發(fā)酵；蛋白酶活性；纖維素酶活性；果膠酶活性；植酸酶活性

我國是世界上蘋果產(chǎn)量最多的國家之一，年產(chǎn)量在2 000萬 t 以上，每年由果汁加工而產(chǎn)生的蘋果渣達120萬 t。蘋果渣含水量約80%，其干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量僅占3%～5%，直接用作飼料營養(yǎng)價值較低，提高蘋果渣的營養(yǎng)品質(zhì)已成為其作為飼料資源開發(fā)利用的關(guān)鍵。采用特定工藝通過微生物發(fā)酵提高蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量及其營養(yǎng)價值，是蘋果渣合理利用的重要途徑之一。在蘋果渣發(fā)酵飼料中，除蛋白質(zhì)以外，發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶等水解酶類對動物營養(yǎng)也具有重要作用。已有研究表明，發(fā)酵飼料中存在的水解酶類可大幅度提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，促進家畜生長，增強動物免疫力[1]。因此，在關(guān)注蘋果渣發(fā)酵飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)及其發(fā)酵工藝優(yōu)化的同時，進一步研究不同發(fā)酵工藝處理對果渣發(fā)酵飼料水解酶活性的影響，對蘋果渣發(fā)酵飼料的品質(zhì)評價也具有重要的意義。

目前關(guān)于利用蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的發(fā)酵工藝已有較多研究[2-4]，但對蘋果渣單細胞蛋白發(fā)酵飼料中的水解酶研究不多。張高波等[5]探索了酵母菌與霉菌不同接種菌劑組合對蘋果渣發(fā)酵飼料中蛋白酶和纖維素酶活性的影響，但對蘋果渣固態(tài)發(fā)酵飼料中的果膠酶及植酸酶活性尚無報道，且關(guān)于發(fā)酵原料中輔料添加及原料滅菌處理對蘋果渣發(fā)酵飼料中水解酶活性的影響尚無系統(tǒng)研究。

本研究以蘋果渣為原料，以酵母菌和2株霉菌(黑曲霉A8和米曲霉)為發(fā)酵劑，系統(tǒng)研究了發(fā)酵劑、原料組成及原料滅菌方式等3種因素不同組合處理對蘋果渣發(fā)酵飼料中蛋白酶、纖維素酶、果膠酶及植酸酶活性的影響，旨在為蘋果渣發(fā)酵飼料品質(zhì)評價及生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

菌種：酵母菌(Yeast)、黑曲霉A8(AspergillusnigerA8)及米曲霉(Aspergillusoryzae)，均由西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院微生物資源研究室提供。

原料：干蘋果渣(自然條件下風干)，由乾縣海升果汁廠提供。油渣粉(油菜籽榨油后所余殘渣粉碎而成)，市購。

發(fā)酵干原料：原料A為干蘋果渣和尿素按質(zhì)量比19∶1混合；原料B為干蘋果渣、油渣粉和尿素按質(zhì)量比17∶2∶1混合。

發(fā)酵濕原料：由發(fā)酵干原料與自來水按質(zhì)量比1∶2混合。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其中含100 g馬鈴薯，10 g葡萄糖，7.5 g瓊脂，500 mL水，121 ℃滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1發(fā)酵劑制備向250 mL三角瓶中裝入50 mL PDA滅菌培養(yǎng)基，待冷凝后將活化好的酵母菌懸液1 mL接入該瓶中，用金屬刮鏟涂勻后于28 ℃下培養(yǎng)3 d；向瓶中加100 mL無菌水制得菌懸液。經(jīng)血球計數(shù)板測定，其活菌數(shù)為4.0×109個/mL。按相同方法制備黑曲霉A8及米曲霉孢子懸液，于28 ℃下培養(yǎng)5 d，所得孢子數(shù)分別為8.7×108和1.1×109CFU/mL。

1.2.2固態(tài)發(fā)酵設(shè)計設(shè)發(fā)酵劑、滅菌方式及原料組成3個因素，發(fā)酵劑設(shè)不接菌(CK1)、單接酵母菌(Y)、單接黑曲霉A8(H)、單接米曲霉(M)、酵母菌+黑曲霉A8(YH)、酵母菌+米曲霉(YM)6個處理；滅菌方式設(shè)自然發(fā)酵(原料不滅菌)和滅菌發(fā)酵(原料121 ℃滅菌30 min)2個處理；原料組成設(shè)原料A(蘋果渣+尿素)和原料B(蘋果渣+尿素+油渣粉)2種類型。試驗共24個處理，每處理重復3次，以未發(fā)酵純蘋果渣原料作為對照(CK)。

1.2.3試驗步驟按照1.1節(jié)中的比例配制發(fā)酵原料，然后分別稱取50.0 g發(fā)酵濕原料于250 mL組培瓶中，121 ℃下滅菌30 min，冷卻至室溫，接入發(fā)酵劑(單菌接種量為5 mL，混菌各2.5 mL)，用滅菌竹簽攪勻，28 ℃下培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后將樣品在45 ℃下鼓風烘干并粉碎備用。自然發(fā)酵中原料不滅菌直接接種。

1.3發(fā)酵產(chǎn)物中水解酶活性的測定

1.3.1蛋白酶稱烘干樣品1.000 g于三角瓶中，加pH 7.2磷酸緩沖液20 mL，40 ℃水浴保溫60 min，過濾后選擇適宜稀釋倍數(shù)采用福林法[6]測定蛋白酶活性。將1.0 g發(fā)酵產(chǎn)物在40 ℃下每1 min水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶活定義為1個蛋白酶活性單位，用1 U表示。

1.3.2纖維素酶稱烘干樣品0.500 g于三角瓶中，加蒸餾水20 mL，40 ℃水浴保溫45 min，過濾后選擇合適稀釋倍數(shù)以羧甲基纖維素納(CMC)為底物，用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法[7]測定還原糖含量，計算纖維素酶活性。將在pH 5.0、40 ℃下每 1.0 g發(fā)酵產(chǎn)物在1 min內(nèi)水解CMC生成1 μg葡萄糖的酶活性定義為1個纖維素酶活性(CMC酶活)單位，用1 U表示。

1.3.3果膠酶稱烘干樣品0.500 g于三角瓶中，加pH 4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液20 mL，48 ℃水浴45 min，過濾后選擇合適稀釋倍數(shù)用DNS(3，5-二硝基水楊酸)法[8]測定果膠酶的活性。將1.0 g發(fā)酵產(chǎn)物在48 ℃、pH 4.8的條件下1 h內(nèi)水解果膠底物轉(zhuǎn)化成1 mg D-半乳糖醛酸的果膠酶活性定義為1個果膠酶活性單位，用1 U表示。

1.3.4植酸酶稱烘干樣品0.500 g于三角瓶中，加pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液20 mL，37 ℃水浴30 min，過濾后選擇合適的稀釋倍數(shù)用偏釩酸銨法[9]測定植酸酶活性。將1.0 g發(fā)酵產(chǎn)物在植酸鈉濃度為5 mmol/L、溫度37 ℃、pH 5.5條件下反應1 min，從植酸鈉中釋放1 μmol無機磷的植酸酶活性定義為1個植酸酶活性單位，用1 U表示。

1.4數(shù)據(jù)處理

以未發(fā)酵原料為對照，由發(fā)酵引起蛋白酶活性的增率稱為發(fā)酵增率(Δf)；以未接菌處理為對照，由接菌引起蛋白酶活性的增率稱為接菌增率(Δi)；以原料未滅菌處理為對照，由原料滅菌引起蛋白酶活性的增率稱為滅菌增率(Δs)；蛋白酶活性的發(fā)酵增率(Δf)、接菌增率(Δi)和滅菌增率(Δs)均采用下式計算：

式中：CCK分別表示未發(fā)酵、未接菌及未滅菌處理的蛋白酶活性(U)；Ci分別為發(fā)酵、接菌和滅菌處理的蛋白酶活性(U)。纖維素酶、果膠酶及植酸酶酶活性增率的計算與蛋白酶相同。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理對蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶活性的影響

2.1.1自然發(fā)酵不同菌劑及輔料對未滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶活性的影響結(jié)果見表1。

表 1　不同菌劑及輔料對未滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶活性的影響Table 1　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on protease activity in fermentation product of unsterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣的蛋白酶活性為35.10 U；同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)；下表同。

Note：The protease activity in blank sample was 35.10 U.Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05).The same below.

由表1可以看出，在自然發(fā)酵條件下，原料A不接種發(fā)酵劑，單靠原料及空氣中微生物自然接種，發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性由未發(fā)酵純蘋果渣的35.10 U提高到42.10 U，發(fā)酵增率(Δf)為19.9%，而接種酵母菌+黑曲霉A8、酵母菌+米曲霉、黑曲霉A8、米曲霉及酵母菌后，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶活性較未發(fā)酵純果渣原料顯著提高，其發(fā)酵增率(Δf)分別為278.6%，203.6%，171.2%，116.3%及68.2%；與不接發(fā)酵劑的原料A相比，接種發(fā)酵劑處理的蛋白酶活性接種增率(Δi)為40.2%～215.7%。原料B與之類似，特別是在接種酵母菌+黑曲霉A8時，蛋白酶活性的發(fā)酵增率(Δf)及接菌增率(Δi)分別為380.1%及249.9%，即原料中加入油渣粉能大幅度提高酵母菌+黑曲霉A8發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白酶活性。

2.1.2滅菌發(fā)酵由表2可知，在滅菌條件下，發(fā)酵能大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性。在原料A中，發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性為55.70～246.05 U，發(fā)酵增率(Δf)為58.7%～601.0%。在不同發(fā)酵劑處理中，蛋白酶活性的接菌增率(Δi)為57.5%～341.7%，其中接種酵母菌+黑曲霉A8時蛋白酶活性較不接菌(CK1)增加341.7%。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶活性高達58.85～368.43 U，蛋白酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為67.7%～949.6%，接菌增率(Δi)為109.4%～526.0%，且以酵母菌+黑曲霉A8接種處理的接菌增率最高(526.0%)。

表 2　不同菌劑及輔料對滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶活性的影響Table 2　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on protease activity in fermentation product of sterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣的蛋白酶活性為35.10 U。

Note：The protease activity in blank sample was 35.10 U.

2.1.3原料滅菌及添加油渣粉對發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶活性的影響比較表1和表2并結(jié)合表2中的滅菌增率(Δs)可以看出，滅菌條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性均明顯大于未滅菌的自然發(fā)酵。在原料A中，自然發(fā)酵與滅菌發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性分別為42.10～132.90 U與55.70～246.05 U，其滅菌增率(Δs)為32.3%～117.8%，滅菌處理發(fā)酵產(chǎn)物蛋白酶活性增幅明顯，說明原料滅菌能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性，且原料B與原料A類似。

由表1和表2可以看出，無論原料是否滅菌，同一發(fā)酵處理中，原料B發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白酶活性及其發(fā)酵增率(Δf)均明顯高于原料A的。上述分析表明，向原料中添加油渣粉有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白酶活性及發(fā)酵增率。

2.2不同處理對蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活性的影響

2.2.1自然發(fā)酵不同菌劑及輔料對未滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活性的影響見表3。

表 3　不同菌劑及輔料對未滅菌原料的發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活性的影響Table 3　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on cellulase activity in fermentation product of unsterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣的纖維素酶活性為3 177.78 U。

Note：The cellulase activity in blank sample was 3 177.78 U.

由表3可以看出，原料A在不滅菌和不接種發(fā)酵劑的自然條件下，靠原料及空氣中微生物自然接種，可以使發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活性由未發(fā)酵純蘋果渣的3 177.78 U增加到 3 314.82 U，發(fā)酵增率(Δf)為4.3%；接種酵母菌+黑曲霉A8、酵母菌+米曲霉、黑曲霉A8、米曲霉及酵母菌后，發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活性的發(fā)酵增率(Δf)分別為9.7%，7.9%，7.1%，6.2%及4.6%；與不接種對照處理相比，纖維素酶活性的接菌增率(Δi)為0.2%～5.1%。原料B與之類似，特別是在接種酵母菌+黑曲霉A8時，纖維素酶活性的發(fā)酵增率(Δf)及接菌增率(Δi)分別為20.5%和15.4%。

2.2.2滅菌發(fā)酵由表4看出，在滅菌發(fā)酵中，接菌處理能大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活性。在原料A中，發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活性為3 465.43～5 695.56 U，黑曲霉A8+酵母菌、黑曲霉A8、米曲霉+酵母菌及米曲霉處理與不接菌對照的纖維素酶活性差異顯著；纖維素酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為 9.1%～79.2%，其中不接菌處理纖維素酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為9.1%；在不同發(fā)酵劑處理中，纖維素酶活性的接菌增率(Δi)為1.1%～64.4%，其中接種酵母菌+黑曲霉A8混菌時纖維素酶活性較對照增加64.4%，增幅明顯。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活性高達3 617.53～6 278.22 U，發(fā)酵增率(Δf)為13.8%～97.6%，纖維素酶活性的接菌增率(Δi)為2.3%～73.5%。

表 4　不同菌劑及輔料對滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活性的影響Table 4　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on cellulase activity in fermentation product of sterilized material fermentation products of sterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣的纖維素酶活性為3 177.78 U。

Note：The cellulase activity in blank sample was 3 177.78 U.

2.2.3原料滅菌及添加油渣粉對發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶活性的影響由表4滅菌增率(Δs)可知，滅菌條件下發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活性均明顯大于自然發(fā)酵，原料A、原料B的滅菌增率(Δs)分別為 4.5%～63.4%和8.3%～63.9%，說明滅菌能提高發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活性。結(jié)合表3、表4可以看出，在未滅菌及滅菌條件下，原料B發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活性均明顯高于原料A，原料B的發(fā)酵增率也明顯高于原料A。由此可見，原料中添加油渣粉對提高發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活性及發(fā)酵增率有一定促進作用。

2.3不同處理對蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性的影響

2.3.1自然發(fā)酵不同菌劑及輔料對未滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性的影響見表5。

表 5　不同菌劑及輔料對未滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性的影響Table 5　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on pectinase activity in fermentation product of unsterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣的果膠酶活性為151.03 U。

Note：The pectinase activity in blank sample was 151.03 U.

由表5可知，在自然發(fā)酵條件下，原料A不接種發(fā)酵劑而僅靠原料及空氣中的微生物自然接種，就可以使蘋果渣的果膠酶活性由未發(fā)酵純蘋果渣的151.03 U提高到160.16 U，即自然發(fā)酵條件下果膠酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為6.0%；接種酵母菌+米曲霉、酵母菌+黑曲霉A8、米曲霉及黑曲霉A8后，發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性較未發(fā)酵純果渣分別提高30.7%，23.9%，21.9%和19.8%；與不接種對照處理相比，果膠酶活性的接菌增率(Δi)為9.2%～23.2%。原料B與之類似，特別是在接種酵母菌+米曲霉時，果膠酶活性的發(fā)酵增率(Δf)及接菌增率(Δi)分別為47.3%和 28.2%。

2.3.2滅菌發(fā)酵由表6可以看出，在滅菌發(fā)酵中，發(fā)酵能顯著增加產(chǎn)物中果膠酶活性。在原料A中，果膠酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為27.1%～120.6%，其中不接菌處理果膠酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為 27.1%。接菌處理能大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物的果膠酶活性，向蘋果渣中接種各供試菌株發(fā)酵所得果膠酶活性為 235.12～333.21 U，且接種黑曲霉A8、米曲霉、黑曲霉A8+酵母菌和米曲酶+酵母菌均與不接菌對照差異顯著(P<0.05)，果膠酶活性的接菌增率(Δi)為 22.5%～73.6%，其中接種酵母菌+米曲霉時果膠酶活性較對照增加73.6%。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性為203.20～358.47 U，其發(fā)酵增率(Δf)為34.5%～137.4%；與不接菌對照相比，果膠酶活性的接菌增率(Δi)為26.4%～76.4%。

表 6　不同菌劑及輔料對滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性的影響Table 6　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on pectinase activity in fermentation product of sterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣果膠酶活性為151.03 U。

Note：The pectinase activity in blank sample was 151.03 U.

2.3.3原料滅菌及添加油渣粉對發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性的影響由表6中的滅菌增率(Δs)可以看出，滅菌條件下發(fā)酵產(chǎn)物的果膠酶活性均明顯大于自然發(fā)酵，原料A和原料B的滅菌增率(Δs)分別為19.9%～68.8%和17.1%～64.8%，說明滅菌處理能提高發(fā)酵產(chǎn)物果膠酶活性。結(jié)合表5、表6可知，在自然及滅菌條件下，原料B發(fā)酵產(chǎn)物中果膠酶活性均明顯高于原料A發(fā)酵產(chǎn)物。在自然發(fā)酵中，單接米曲霉時原料B中的果膠酶活性是原料A的1.2倍；原料A、原料B的發(fā)酵增率(Δf)分別為6.0%～120.6%和14.9%～137.4%，即原料B的發(fā)酵增率明顯高于原料A，表明原料中添加油渣粉有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物中的果膠酶活性及其發(fā)酵增率。

2.4不同處理對蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性的影響

2.4.1自然發(fā)酵不同菌劑及輔料對未滅菌原料的發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性的影響見表7。

表 7　不同菌劑及輔料對未滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性的影響Table 7　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on phytase activity in fermentation product of unsterilized material fermentation products of unsterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣的植酸酶活性為4.46 U。

Note：The phytase activity in blank sample was 4.46 U.

由表7可以看出，原料A在不滅菌和不接種發(fā)酵劑的自然條件下，靠原料及空氣中的微生物自然接種，可以使蘋果渣的植酸酶活性由未發(fā)酵純蘋果渣的4.46 U增加到8.42 U，發(fā)酵增率(Δf)為 88.8%；接種酵母菌+米曲霉、米曲霉、酵母菌+黑曲霉A8、黑曲霉A8及酵母菌后，發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性的發(fā)酵增率(Δf)分別為535.9%，481.4%，430.5%，414.1%和266.4%；與不接種對照處理相比，植酸酶活性的接菌增率(Δi)為 94.1%～236.8%。原料B與之類似，特別是在接種酵母菌+米曲霉時，植酸酶活性的發(fā)酵增率(Δf)及接種增率(Δi)分別為799.3%和296.0%。

2.4.2滅菌發(fā)酵由表8可知，在滅菌發(fā)酵中，接菌處理能大幅提高發(fā)酵產(chǎn)物的植酸酶活性。在原料A中，向蘋果渣中接種各供試菌株，發(fā)酵產(chǎn)物植酸酶活性為13.37～36.85 U，且米曲霉+酵母菌、米曲霉和黑曲霉A8+酵母菌處理均與不接菌對照植酸酶活性差異顯著；植酸酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為199.8%～726.2%，其中不接菌處理條件下植酸酶活性的發(fā)酵增率(Δf)為199.8%；在不同發(fā)酵劑處理中，植酸酶活性的接菌增率(Δi)為 58.6%～175.6%，其中接種酵母菌+米曲霉混菌時植酸酶活性較對照增加175.6%，增幅明顯。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性高達19.45～54.96 U，發(fā)酵增率(Δf)為336.1%～1 132.3%，植酸酶活性的接菌增率(Δi)為41.4%～182.6%。

表 8　不同菌劑及油渣粉對滅菌原料發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性的影響Table 8　Effect of different microbial inoculums and auxiliary materials on phytase activity in fermentation product of sterilized material

注：未發(fā)酵純蘋果渣植酸酶活性為4.46 U。

Note：The phytase activity in blank sample was 4.46 U.

2.4.3原料滅菌及添加油渣粉對發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性的影響由表8中的滅菌增率(Δs)可以看出，除黑曲霉A8處理以外，滅菌條件下發(fā)酵產(chǎn)物的植酸酶活性均明顯大于自然發(fā)酵，原料A和原料B的滅菌增率(Δs)分別為29.7%～58.8%和-1.2%～92.0%，說明滅菌能提高發(fā)酵產(chǎn)物植酸酶活性。結(jié)合表7、表8可知，在未滅菌及滅菌條件下，原料B發(fā)酵產(chǎn)物的植酸酶活性明顯高于原料A。在自然發(fā)酵中，單接黑曲霉A8、米曲霉及酵母菌+黑曲霉A8、酵母菌+米曲霉混接，原料B發(fā)酵產(chǎn)物中的植酸酶活性均為原料A的1.4倍；在滅菌發(fā)酵中，單接米曲霉、酵母菌+米曲霉混接處理的植酸酶活性也均為原料A的1.5倍。此外，原料A、原料B的發(fā)酵增率(Δf)分別為88.8%～726.2%和 127.1%～1 132.3%，即原料B的發(fā)酵增率高于原料A，表明原料中添加油渣粉有助于提高發(fā)酵產(chǎn)物中的植酸酶活性及發(fā)酵增率。

3討論與結(jié)論

酶是一種由活細胞產(chǎn)生的具有生物催化能力的蛋白質(zhì)，在動物體內(nèi)消化與新陳代謝過程中發(fā)揮著重要作用。自1975年美國飼料工業(yè)首次將酶制劑作為添加劑應用于配合飼料中并取得顯著效果后，飼用酶制劑日益受到養(yǎng)殖業(yè)的重視。外源加入的飼用蛋白酶可增強動物消化道酶系作用，降解蛋白質(zhì)成為易被吸收的氨基酸等小分子物質(zhì)；纖維素酶和果膠酶通過破壞植物細胞壁，將纖維素、半纖維素及果膠等大分子分解成易被消化吸收的小分子糖類，同時釋放出植物細胞內(nèi)的淀粉及蛋白質(zhì)等，使其充分水解為小分子后被吸收利用[10-12]；植酸酶催化植酸鹽水解，釋放出游離態(tài)的無機磷酸鹽和肌醇，提高飼料中磷和肌醇等養(yǎng)分的利用率[13]。大量試驗表明，將復合酶添加到不同動物的基礎(chǔ)日糧中，均可顯著提高其生產(chǎn)性能[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉A8和米曲霉分別與酵母菌混合接種處理蘋果渣，其發(fā)酵產(chǎn)物4種水解酶活性均高于2種霉菌單獨接種，其主要原因在于酵母菌通過利用2種霉菌水解酶水解形成的小分子糖等產(chǎn)物，解除了這些小分子糖對纖維素酶等水解酶合成的阻遏作用[16]，促進了水解酶的大量合成。供試發(fā)酵菌種中，黑曲霉A8具有很強的纖維素酶、果膠酶、糖化酶、植酸酶及蛋白酶等水解酶的合成能力，米曲霉合成蛋白酶及淀粉酶的能力也很強，而酵母菌則不具備對上述水解酶的合成能力。在固態(tài)發(fā)酵過程中，黑曲霉A8分泌到固態(tài)基質(zhì)中的纖維素酶可水解發(fā)酵原料中的纖維素生成葡萄糖，葡萄糖等小分子糖的大量累積可阻遏纖維素酶的進一步合成，導致酶活性降低。而酵母菌則可利用這些葡萄糖，消除或減弱葡萄糖對纖維素酶合成的阻遏作用，促進纖維素酶的合成，從而提高發(fā)酵產(chǎn)物的纖維素酶活性[16]。其他3種酶合成也有類似作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵原料滅菌處理可明顯提高發(fā)酵產(chǎn)物中4種水解酶的活性，其原因之一是滅菌處理使發(fā)酵原料充分熟化，原因之二是滅菌處理消除了發(fā)酵原料中雜菌對接入菌生長的競爭影響，這兩種效應均有利于接入菌的大量生長繁殖，進而增加了接入菌合成的水解酶量，提高了發(fā)酵產(chǎn)物中4種水解酶的活性。以蘋果渣為主料，通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)出具有較高蛋白質(zhì)及動物必需氨基酸含量[16]且含有多種水解酶的發(fā)酵飼料，是蘋果渣高效利用的重要途徑之一，但目前的研究主要集中在提高發(fā)酵飼料中蛋白質(zhì)含量的工藝優(yōu)化及氨基酸變化[17-21]方面，對發(fā)酵飼料中多種具有重要作用的水解酶活性的關(guān)注較少，更缺乏深入研究。本研究系統(tǒng)探討了不同發(fā)酵劑、輔料及滅菌與否對蘋果渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白酶、纖維素酶、果膠酶及植酸酶酶活性的影響，結(jié)果表明，以供試發(fā)酵劑進行固態(tài)發(fā)酵獲得的蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中含多種活性較高的水解酶系，所得產(chǎn)物用于飼料原料時不僅可為動物提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和多種動物必需氨基酸，還可提供多種水解酶系，兼有復合酶制劑的部分功能。因此，不能將蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物單純視為單細胞蛋白質(zhì)原料，而是兼?zhèn)鋬?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)及復合酶制劑多種功能的飼料原料。若將該發(fā)酵產(chǎn)物以一定比例添加到飼料中，在發(fā)酵產(chǎn)物及其中復合水解酶的共同作用下，動物飼料中的一些抗營養(yǎng)因子將被破壞，飼料的消化利用率得到提高，對加快動物生長速度、提高免疫力及健康水平均有重要的促進作用，本研究結(jié)果將為蘋果渣發(fā)酵飼料品質(zhì)評價及發(fā)酵工藝優(yōu)化提供新的科學依據(jù)。

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DOI：網(wǎng)絡出版時間:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.027

[收稿日期]2014-11-19

[基金項目]陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項目(2015KTTSNY03-06)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD14B11)

[作者簡介]任雅萍(1985-)，女，陜西渭南人，碩士，主要從事微生物資源利用研究。E-mail：renyaping19850618@163.com [通信作者]薛泉宏(1957-)，男，陜西白水人，教授，主要從事微生物資源利用研究。E-mail：xuequanhong@163.com

[中圖分類號]S816.46

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)07-0193-08

Effect of fermention conditions on the four hydrolases in apple pomace fermented feed

REN Yapinga,GUO Qiaob,LAI Hangxianb,CHEN Jiaojiaob,XUE Quanhongb

(aCollegeofLifeScience,bCollegeofNatrualResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The study investigated the effects of microbial inoculums,auxiliary materials and sterilization of material on activities of 4 important hydrolases (protease,cellulose,pectinase and phytase) in fermentation product of apple pomace.【Method】 Apple pomace with different auxiliary materials (urea or urea and oil residue) was fermented with three fungal species,yeast,Aspergillus niger A8 and Aspergillus oryzae.The effects of microbial inoculums (single-strain fermentation and mixed-strains fermentation),auxiliary materials and sterilization of material on activities of 4 important hydrolases (protease,cellulose,pectinase and phytase) were analyzed by colorimetric spectroscopy.【Result】 The activities of the 4 hydrolases were increased significantly in fermentation product of apple pomace.The activities of all 4 hydrolases in mixed-strains fermentation product were much higher than in the single-strain fermentation product.Adding oil residues and sterilization significantly improved the activities of protease,cellulose,pectinase and phytase.In the fermentation product of sterilized material containing oil residues,the activities of protease,cellulose,pectinase and phytase reached 58.85-368.43 U,3 617.53-6 278.22 U,203.20-358.47 U,and 19.45-54.96 U,respectively.The fermentation rates were increased by 67.7%-949.6%,13.8%-97.6%,34.5%-137.4%,and 336.1%-1 132.3%,the activities with microbial inoculation were increased by 109.4%-526.0%,2.3%-73.5%,26.4%-76.4%,and 41.4%-182.6%,and the activities in fermentation product of sterilized material were 22.2%-118.6%,8.3%-63.9%,17.1%-64.8%,and 1.2%-92.0%,respectively.【Conclusion】 Mixed-strains fermentation,auxiliary materials (oil residues) and sterilization of material significantly improved activities of protease,cellulose,pectinase and phytase in fermentation product of apple pomace.

Key words：apple pomace;fermented feed;protease activity;cellulose activity;pectinase activity;phytase activity

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.054.html